肉肌醇的偏好 菌(偏在菌）（酵母、枯草桿菌、腸內細菌)為抵抗性的，因而直至使用為止(或者至表現出生 理作用為止），將肌肉肌醇以本發明的肌肉肌醇衍生物的形態保存，該優點是本領域技術人 員可以理解的。
[0140] 因而，將本發明的肌肉肌醇衍生物作為藥品、食品、化妝品等的有效成分或功能性 成分使用也是其潛在用途之一。即，如上所述，肌肉肌醇對于多數高等動物來說為必不可缺 的物質，因而其作為營養食品、飼料、藥品等的成分廣泛使用。例如，已知肌肉肌醇在脂肪或 膽固醇類的代謝中發揮出重要的作用，在高膽固醇血癥等的預防或治療中是特別有效的。 并且，由于本發明的肌肉肌醇衍生物可容易地被酶分解生成肌肉肌醇，因而期待本發明的 肌肉肌醇衍生物在生物體內被酶分解產生肌肉肌醇，將本發明的肌肉肌醇衍生物本身添加 到藥品等中為本發明頗令人感興趣的利用方式。
[0141] 例如，含有本發明的肌肉肌醇衍生物作為有效成分的醫藥組合物可以制成片劑、 粉末、顆粒、膠囊、糖衣片、液劑、或者糖漿等口服給藥劑型，或者也可制成注射劑、點滴劑、 栓劑、經皮或吸收劑等非口服給藥劑型。可使用與這些制劑相應的各種載體。例如，作為口 服劑的載體，可以舉出賦形劑(例如乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、紅蘚醇、木糖醇、麥芽糖醇、 山梨糖醇、各種淀粉、結晶纖維素、粉末纖維素等）、粘合劑(例如糊精、阿拉伯膠、藻酸鈉、聚 乙烯吡咯酮、聚乙烯醇、甲基纖維素、羥基丙基纖維素、低置換度羥丙基纖維素、羧甲基纖維 素鈉等）、滑潤劑(例如硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、滑石等）、流動性促進劑(例如含水二氧 化硅、輕質硅酸酐、二氧化鈦等）、著色劑。
[0142] 醫藥組合物的給藥量沒有特別限定，例如，一般來說，對于成人，可以每1天以1次 到分數次給予O.Olmg~2000mg的有效成分。給藥頻率可以為每月1次到連日給藥，優選為1 次/周到3次/周、或5次/周、或者連日給藥。1天給藥量可根據給藥期間以及給藥頻率以及患 者的年齡、體重、身體健康程度及所要治療的疾病或其嚴重程度等一起進行適當增減。
[0143] 被提供了以上說明的本領域技術人員可充分實施本發明。下面出于進一步說明的 目的提供實施例，因而本發明并不限于該實施例。需要說明的是，在本說明書中，只要沒有 特別說明，核苷酸序列被記載為從5'向3'方向。
[0144] 實施例
[0145] 實施例1:質粒的構建
[0146] Ι-a)肌醇單磷酸酶表達盒
[0147] 在LB培養基中（2ml)在37°C振蕩培養大腸桿菌株W3110(NBRC 12713)。培養終止 后，由培養液回收菌體，使用Nucleo Spin Tissue(產品名、MACHEREY-NAGEL社制造)提取基 因組DNA。將所提取的基因組DNA用于模板，利用下述引物進行PCR擴增(PrimeSTAR Max DNA 聚合酶(產品名，Takara-Bio 制造)反應條件:98°(：1〇36(：，551€586(3,721€2〇86(3,28循環），克 隆suhB基因的編碼區域(序列編號3)。
[0148] [化 4]
[0149] 正向：a tgcatccgatgctgaa c(序列編號 5)
[0150] 反向：t taacgcttcagagcgtc g(序列編號 6)
[0151] 所得到的suhB編碼區域可轉錄地插入到下述序列的啟動子的下游。
[0152] [化 5]
[0153] 啟動子：g tcgtttttctgcttaggattttgttattta aattaagcctgtaatgccttgcttccattgcggataaat cctacttttttattgccttcaaataaatttaaggagttc (序列編號7)
[0154] g卩，在質粒pNFP-A51(于2012年10月26日以FERM BP-11515保藏在獨立行政法人制 品評價技術基盤機構專利生物保減中心）的多克隆位點插入終止子序列和上述啟動子序 列。
[0155] 在所導入的啟動子序列的下游連接上述克隆的suhB編碼區域，構建pNFP-A54。將 所構建的PNFP-A54利用氯化鈣法(參照羊土社遺伝子工學実験y-卜(基因工程實驗筆記） 上田村隆明著)轉染到大腸桿菌(Escherichia coli )AKC_016株(于2012年10月26日以FERM BP-11512保藏在獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利生物保藏中心）中。通過SDS-PAGE確認肌醇單磷酸酶在該大腸桿菌的可溶性級分中的高表達。
[0156] Ι-b)肌醇-1-磷酸合成酶表達盒
[0?57]由分離出的酒精酵母培養液中回收菌體，使用Nucleo Spin Tissue(產品名、 MACHEREY-NAGEL社制造)提取基因組DNA。將所提取的基因組DNA用于模板，利用下述引物進 行PCR擴增(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(產品名、Takara-Bio制造)反應條件：98°C10sec，55 °〇586〇，721€2〇86(3,28循環），克隆預01基因的編碼區域(序列編號1)。
[0158] [化6]
[0159] 正向：a tgacagaagataatattgct c(序列編號 8)
[0160] 反向：t tacaacaatctctcttc g(序列編號 9)
[0161] 所得到的inol編碼區域可轉錄地插入到下述序列的啟動子的下游。
[0162] [化 7]
[0163] 啟動子：c tcaagcccaaaggaagagtgaggcgagtca gtcgcgtaatgcttaggcacaggattgatttgtcgcaat gattgacacgattccgcttgacgctgcgtaaggtttttg taattttacaggcaaccttttattcactaacaaatagct g g t g g a a(序列編號10)
[0164] 即，在上述質粒pNFP-A51的多克隆位點插入終止子序列和上述啟動子序列。
[0165] 在所導入的啟動子序列的下游連接上述克隆的inol編碼區域，構建pNFP-D78。將 所構建的PNFP-D78利用氯化鈣法(參照羊土社遺伝子工學実験y-卜(基因工程實驗筆記） 上田村隆明著)轉染到大腸桿菌(Escherichia coli )AKC_016株(于2012年10月26日以FERM BP-11512保藏在獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利生物保藏中心）中。通過SDS-PAGE確認肌醇-1-磷酸合成酶在該大腸桿菌的可溶性級分中的高表達。
[0166] Ι-c)用于轉化的質粒的構建
[0167] 將pNFP-D78利用Sal I消化，進行末端平滑化和5 '末端脫磷酸化。將pNFP-A54中的 suhB表達盒克隆化，與pNFP-D78連接。得到與pNFP-D78中的IN01表達盒順方向地連接了 suhB 表達盒的 pNFP-G22。
[0168] 實施例2:肌肉肌醇生產
[0169] 2-a)利用經含有表達盒的質粒轉染得到的轉化體進行的肌肉肌醇生產
[0170]使用氯化鈣法（參照羊土社遺伝子工學実験/ 一卜(基因工程實驗筆記）上田村隆 明著）將按照實施例1的過程構建的質粒PNFP-G22轉染到大腸桿菌(Escherichia coli) AKC-016株(于2012年10月26日以FERM BP-11512保藏在獨立行政法人制品評價技術基盤機 構專利生物保藏中心）中。將該轉化體命名為AKC-016-G22株。
[0171] 另一方面，在對照轉化中，利用僅含有IN01表達盒的質粒pNFP-D78進行轉染，將所 得到的該對照轉化體命名為A K C - 016 - D 7 8株。將所得到的各轉化體在含有氨芐青霉素 (100mg/L)的LB微板上于37 °C培養一天，形成菌落。將含有氨芐青霉素（100mg/L)的LB培養 基2mL裝入15mL容量的試管中，利用白金耳從上述微板上進行菌落的植菌，在37°C以180rpm 進行3~5小時的培養，直至0D(600nm)為0.5左右，將其作為主培養所用的前培養液。
[0172] 在250mL容量的罐狀培養裝置(機種名Bio Jr.8，Biott制造）中加入含有10g/L、 15g/L或30g/L的葡萄糖以及100mg/L的氨芐青霉素的合成培養基（下表）或者LB培養基 100mL，添加2mL的前培養液進行主培養(肌肉肌醇生產試驗）。培養條件如下：培養溫度30 °C ;培養pH 6.7;堿添加10 % (重量/容量)氨水;攪拌1200rpm;通氣0.1 vvm。
[0173] [表 1]
[0174]合成培養基組成
[0175]
總量 1 L
[0176] 使用8~1(0!1，將?!1調整為6.7
[0177] 將上述培養液在4°C進行10，000g X 10分鐘的離心分離，回收上清，測定培養上清 的肌肉肌醇濃度。具體地說，將KS-G(保護柱）、Sugar KS-801和Sugar KS-802 (均為商品名， 昭和電工株式會社制造)聯結進行HPLC(檢測器:RI、柱溫度:70°C、流速：lmL/min)，從而對 培養上清中的肌肉肌醇濃度進行定量。將本發明的轉化體(AKC-016-G22株)與對照株(AKC-016-D78株)的比較結果列于表2 (合成培養基)和表3 (LB培養基）。
[0178] 表2合成培養基的培養上清中生成的肌肉肌醇的濃度(g/L)
[0179]
[0180] 表3LB培養基的培養上清中生成的肌肉肌醇的濃度(g/L)
[0181]
[0182] 2_b)利用在染色體上具有表達盒的轉化體進行的肌肉肌醇生產
[0183] 在本實施例中，還進一步制作了在染色體上具有IN01表達盒和suhB表達盒這兩者 的轉化體（大腸桿菌（Escherichia coli)AKC-018株，于2012年 10月26日以FERM BP-11514 保藏在獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利生物保藏中心中）。
[0184] 另一方面，對照轉化是在染色體上僅插入IN01表達盒而得到的（大腸桿菌 (Escherichia coli)AKC-017株，于2012年10月26日以FERM BP-11513保藏在獨立行政法人 制品評價技術基盤機構專利生物保減中心中）。
[0185] 將各轉化體利用不含有氨芐青霉素的LB培養基進行前培養，并且除了不含有氨芐 青霉素且使葡萄糖的添加量為l〇g/L或30g/L以外，使用與實施例2-a)相同的合成培養基和 LB培養基，利用該轉化體在與實施例2-a)同樣的培養條件下進行肌肉肌醇的生產。接下來 利用與實施例2_a)相同的方法對培養上清中的肌肉肌醇濃度進行定量。本發明的轉化體 (AKC-018株)與對照株(AKC-017株)的比較結果列于表4(合成培養基)和表5(LB培養基）中。
[0186] 表4合成培養基的培養上清中生成的肌肉肌醇的濃度(g/L)
[0187]
[0188] 表5LB培養基的培養上清中生成的肌肉肌醇的濃度(g/L)
[0189]
[0190] 上述實施例2-a)和2-b)的結果顯示出，盡管在大腸桿菌宿主(對照株）中確認到了 內源性肌醇單磷酸酶活性的存在，但在利用合成生物學方法進行的現有的肌肉肌醇生產 中，該活性并不充分。令人吃驚的是，該宿主中的肌醇單磷酸酶活性的亢進使得肌肉肌醇生 產率與對照相比提高了 1.5~5倍。更令人吃驚的是，在肌醇單磷酸酶活性亢進的微生物中， 肌肉肌醇生產量與投料葡萄糖量成正比地增加。這種情況驗證了，與現有的技術常識相反 地，在利用合成生物學方法進行的肌肉肌醇生產中，肌醇單磷酸酶活性發揮了重要作用。
[0191 ]實施例3:新穎的肌肉肌醇衍生物
[0192] 3-a)新穎的肌肉肌醇衍生物的生產
[0193] 本實施例中示出了利用作為由實施例2-a)得到的本發明的轉化