)置換內源性肌醇單磷酸酶基因的一部分或全部；
[0067] h)使內源性肌醇單磷酸酶基因的一部分缺失；
[0068] i)使降低肌醇單磷酸酶活性的其它蛋白質減少;或者
[0069] j)使降低肌醇單磷酸酶活性的化合物的生成減少。
[0070] 在本發明的肌肉肌醇的發酵生產中，使用下述碳源作為培養基材為適宜的，該碳 源含有適于生成作為肌醇-1-磷酸合成酶底物的葡萄糖-6-磷酸的化合物。進一步地，本發 明的制造方法還可以包括下述的附加工序，在該附加工序中，從在與該碳源的接觸下進行 生長和/或維持的上述轉化體的培養物中分離出肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物。因而，本發明 的進一步適宜的方式包括：
[0071] (10)如上述（1)或(9)的任一項所述的制造方法，其中，上述碳源包含可在上述轉 化體內轉換為葡萄糖-6-磷酸的化合物；
[0072] (11)如上述(10)所述的制造方法，其中，上述碳源為選自由D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、 多糖、淀粉、纖維素、米糠、廢糖蜜以及D-葡萄糖的生物物質組成的組中的1種以上；以及
[0073] (12)如上述（1)或（11)的任一項所述的制造方法，其中，該方法進一步包括分離肌 肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的工序，該肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物是在與上述碳源的接觸下 進行生長和/或維持的上述轉化體的培養物中累積得到的。
[0074] 此外，本發明還謀求用于上述肌肉肌醇的制造方法的轉化體。因而，本發明的第2 方面在于：
[0075] (13)-種轉化體，其為不表達內源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物的轉化體，該轉 化體至少含有以能夠在該轉化體內表達的方式導入的編碼肌醇-1-磷酸合成酶的外來基 因，并且具有對該轉化體內的功能性肌醇單磷酸酶的過剩生產或肌醇單磷酸酶的活化進行 誘導的基因重組或變異。
[0076] 更特定地說，上述轉化體為具有以能夠表達的方式導入到不表達內源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物內的編碼肌醇-1-磷酸合成酶的外來基因的轉化體，其特征在于，該轉 化體具有對功能性肌醇單磷酸酶的過剩生產或肌醇單磷酸酶的活化進行誘導的基因重組 或變異。
[0077] 此外，本發明第1方面中記載的方式也適用于本發明的第2方面。這些方式包括：
[0078] (14)如上述(13)所述的轉化體，其中，上述不表達內源性肌醇-1-磷酸合成酶的微 生物為原核生物；
[0079] (15)如上述（13)或（14)所述的轉化體，其中，上述不表達內源性肌醇-1-磷酸合成 酶的微生物為具有內源性肌醇單磷酸酶基因的微生物；
[0080] (16)如上述（13)或（15)的任一項所述的轉化體，其中，上述不表達內源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物為選自由大腸桿菌、芽胞桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單胞菌屬 細菌組成的組中的細菌；
[0081] (17)如上述(16)所述的轉化體，其中，上述細菌為大腸桿菌；
[0082] (18)如上述（13)或（17)的任一項所述的轉化體，其中，上述肌醇單磷酸酶的過剩 生產是通過對上述微生物進行下述操作而誘導的：
[0083] a)導入外來肌醇單磷酸酶基因；
[0084] b)增加內源性肌醇單磷酸酶基因的拷貝數；
[0085] c)在內源性肌醇單磷酸酶基因的調節區域導入變異；
[0086] d)利用高表達誘導性外來調節區域來置換內源性肌醇單磷酸酶基因的調節區域； 或者
[0087] e)使內源性肌醇單磷酸酶基因的調節區域缺失；
[0088] (19)如上述（18)所述的轉化體，其中，上述肌醇單磷酸酶的過剩生產是通過對上 述微生物導入外來肌醇單磷酸酶基因而誘導的；以及
[0089] (20)如上述（13)或（17)的任一項所述的轉化體，其中，上述肌醇單磷酸酶的活化 是通過對上述微生物進行下述操作而誘導的：
[0090] f)在內源性肌醇單磷酸酶基因中導入變異；
[0091] g)置換內源性肌醇單磷酸酶基因的一部分或全部；
[0092] h)使內源性肌醇單磷酸酶基因的一部分缺失；
[0093] i)使降低肌醇單磷酸酶活性的其它蛋白質減少；
[0094] j)使降低肌醇單磷酸酶活性的化合物的生成減少。
[0095] 本發明的第3方面為被發現在上述轉化體的培養物中生產出的新穎的肌肉肌醇衍 生物。因而，本發明在于：
[0096] (21)下述結構式所表示的化合物：
[0097] [化2]
[0098]
α
[0099] 進一步還確認到，本發明的新穎的肌肉肌醇衍生物通過能夠催化β-糖苷鍵的水解 反應的酶(EC 3.2.1.21等)而容易地分解成葡萄糖與肌肉肌醇。該酶分解能夠通過利用該 酶對上述(1)中得到的培養物進行直接處理、利用該酶對該培養物的粗制物進行處理、或者 利用該酶對分離出的本發明的肌肉肌醇衍生物進行處理的任一種手段來達成。因而，本發 明的第4方面在于：
[0100] (22)-種肌肉肌醇的制造方法，其特征在于，利用能夠催化β-糖苷鍵的水解反應 的酶將上述(21)的肌肉肌醇衍生物分解，生成肌肉肌醇。
[0101] 進一步地，本發明謀求含有本發明的新穎的肌肉肌醇衍生物的組合物。例如，肌肉 肌醇作為營養食品、飼料、藥品等的成分得到廣泛利用。但是，在環境中，存在有同化肌肉肌 醇的酵母、芽孢桿菌屬細菌和腸內細菌等。因而，將肌肉肌醇作為營養食品、飼料、藥品等中 所用的組合物加以利用時，優選保護肌肉肌醇免受上述的肌肉肌醇同化性細菌等的影響直 至發揮出其生理作用。從而，本發明的第5方面在于：
[0102] (23) -種組合物，其含有上述(21)的肌肉肌醇衍生物。
[0103]發明的效果
[0104] 根據本發明，能夠利用微生物培養技術有效達成肌肉肌醇的工業生產。此外，本發 明提供新穎的肌肉肌醇衍生物。本發明的新穎的肌肉肌醇衍生物容易轉換為肌肉肌醇，對 于同化肌肉肌醇的微生物等具有抵抗性。
【附圖說明】
[0105] 圖1示出了 ΙΝ01基因的編碼區域(序列編號1)。
[0106] 圖2示出了suhB基因的編碼區域(序列編號3)。
[0107] 圖3示出了本發明肌肉肌醇衍生物的生產例。圖中箭頭表示含有本發明肌肉肌醇 衍生物的級分。是利用將KS-G(保護柱）、Sugar KS-801和Sugar KS-802(均為商品名，昭和 電工株式會社制造)聯結得到的HPLC(移動相:水、柱溫度:70 °C、流速：lmL/min、檢測器:RI) 進行分析的結果。
[0108] 圖4為本發明肌肉肌醇衍生物的h-NMR光譜。
[0109] 圖5為本發明的肌肉肌醇衍生物的I3c-NMR光譜。
[0110] 圖6示出了本發明肌肉肌醇衍生物利用β-葡糖苷酶進行的分解例。是利用使用了 Shodex Asahipak ΝΗ2Ρ-50 4Ε(商品名、昭和電工株式會社制造）的HPLC(移動相：水/乙腈 = 25/75、柱溫度:40°C、流速:0.8mL/min、檢測器:RI)進行分析的結果。
【具體實施方式】
[0111] 本發明的課題是通過在不具有內源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物內導 入肌肉肌醇生物合成通路而得到的轉化體中、即在不表達內源性肌醇-1-磷酸合成酶的宿 主微生物中導入該酶的外來基因而得到的轉化體中，增強肌醇單磷酸酶的活性而得到解決 的。需要說明的是，在本說明書中，"外來"或"外來性"這一術語表示的是，在轉化前的宿主 微生物不具有要由本發明導入的基因的情況下;在實質上不表達由該基因編碼的酶的情況 下；以及該酶的氨基酸序列由不同的基因編碼、但在轉化后不表達相匹配的內源性酶活性 的情況下，向宿主中導入基于本發明的基因或核酸序列。
[0112] 如上所述，對于本發明的宿主微生物的"不表達內源性肌醇-1-磷酸合成酶的"這 一特性，由于能夠在該宿主細胞內新構建肌肉肌醇生物合成通路(即，無現有內源性通路的 影響），因而在合成生物學方法的應用中是極富魅力的。所示例出的原核微生物為埃希氏 菌、假單胞菌、芽胞桿菌、地芽胞桿菌、甲烷單胞菌、甲基芽孢桿菌、嗜甲基菌、精蛋白桿菌、 甲基球菌、棒狀桿菌、短桿菌、發酵單胞菌和李斯特氏菌屬的細菌。工業發酵生產中適宜的 原核微生物的非限定性示例包括大腸桿菌、芽胞桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單胞菌 屬細菌。大腸桿菌由于其迅速的生長能力和發酵管理的容易性的原因是本發明中特別優選 的宿主微生物的示例。
[0113] 此外，能夠作為本發明的宿主細胞使用的細胞株可以為通常含義下的野生型菌 株，或者也可以為營養要求性變異株、抗生素耐性變異株。進一步地，能夠作為本發明的宿 主細胞使用的細胞株可以已經被轉化從而使之具有與上述變異相關的各種標記基因。這些 變異或基因能夠提供對于本發明轉化體的制作、維持、管理有益的性質。優選的是，通過使 用顯示出對于氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、四環素等抗生素的耐性的菌株，能夠簡便地 進行本發明的肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的生產。
[0114] 在面向合成生物學的本發明中，為了在宿主細胞中構建新的肌肉肌醇生物合成通 路，對于上述不表達內源性肌醇-1-磷酸合成酶的宿主微生物導入外來肌醇-1-磷酸合成酶 基因。肌醇-1-磷酸合成酶基因為已知的（例如，基因庫登錄號.AB032073、AF056325、 八卩071103^?078915^?120146^?207640^?284065、8(：111160、1^3520、1]32511)，它們均可 在本發明的目的中使用。特別是酵母來源的IN01基因（序列編號1)是廣為人知的肌醇-1-磷 酸合成酶基因的示例，也能夠在本發明中適宜地使用。但是，能夠用于本發明的肌醇-1-磷 酸合成酶基因并不限于酵母來源的基因，其可來源于其它真核微生物或此外的生物、或者 可以為人工合成的基因，只要在上述宿主微生物細胞內能夠實質性地表達肌醇-1-磷酸合 成酶活性即可。
[0115] 從而，對于能夠用于本發明目的的肌醇-1-磷酸合成酶基因，只要在上述宿主微生 物細胞內能夠實質性地表達肌醇-1-磷酸合成酶活性，可以具有能夠在自然界發生的全部 變異、或者具有人工導入的變異和修飾。例如，已知在編碼特定氨基酸的各種密碼子中存在 冗余密碼子(redundancy)。因此，在本發明中也可利用最終可翻譯成相同氨基酸的代替密 碼子。即，由于基因編碼的簡并，因而編碼某一特定氨基酸時可使用2個以上的密碼子，因此 氨基酸序列可利用任意1組類似的DNA低聚核苷酸進行編碼得到。雖然僅這組唯一的成員與 天然型酶的基因序列相同，但即便是不匹配的的某DNA低聚核苷酸，在適當的嚴謹條件下 (例如，3xSSC、68°C雜交、2xSSC、0.1%SDS和68°C清洗)也能夠與天然型序列雜交，能夠對編 碼天然型序列的DNA進行鑒定、分離，進一步還可將這樣的基因用于本發明中。特別是已知 大部分生物優選使用特定密碼子(最佳密碼子)的子集(6〇1^、￥〇1.105、？？.61-72、1991等）， 因而根據宿主微生物進行"密碼子最佳化"在本發明中也是有用的。
[0116] 并且，在本發明中，也可通過將肌醇-1-磷酸合成酶基因以"表達盒"的形式導入到 宿主微生物細胞內來更為穩定地得到高水平的肌醇-1-磷酸合成酶活性，這對本領域技術 人員來說是可以理解的。在本說明書中，"表達盒"是指含有與表達對象的核酸或表達對象 的基因功能性結合的對于轉錄和翻譯進行調節的核酸序列的核苷酸。代表性地，本發明的 表達盒以功能性結合的狀態在編碼序列的5'上游含有啟動子序列、在3'下游含有終止子序 列、根據情況進一步含有通常的調節元件，在這樣的情況下，表達對象的核酸或表達對象的 基因以"能夠表達的方式導入"到宿主微生物中。
[0117] 關于啟動子，不論是結構性啟動子還是調節啟動子，均被定義為使RNA聚合酶與 DNA結合、引發RNA合成的DNA序列。強啟動子是指高頻引發mRNA合成的啟動子，在本發明中 也適于使用。可根據該宿主細胞的性質等使