含有肽修飾劑的氨基二酸的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明設及膚修飾劑(peptide modifier)，及其在經修飾的膚衍生物的合成中的 應用。
【背景技術】
[0002] 膚廣泛地用作藥物，并且人們期望在未來能夠提高它們的應用。可W通過重組DNA 技術或常規化學合成來制備它們。
[0003] 天然膚或其類似物通常具有高清除率，因此如果需要長期的生物學活性的話運是 一個問題。
[0004] 具有高清除率的藥物膚包括，例如:ACTH、血管緊張素、降巧素、膜島素、膜高血糖 素樣膚-1、膜高血糖素樣膚-2、膜島素樣生長因子-1、膜島素樣生長因子-2、生長激素釋放 因子、促血小板生成素、紅細胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳素、PTH和相關膚、內啡膚、腦 啡膚和其他阿片類物質、抗利尿激素、催產素、恩夫韋等等。在許多情況下，可W通過修飾膚 鏈或所述膚的氨基酸側鏈來改變所述膚的釋放性能和生物學活性。所述修飾通常引入在賴 氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半脫氨酸的側鏈上，氨基末端和簇基末端的官能團。
[0005] 氨基酸側鏈或氨基末端修飾通常如下進行:在通過對獨特的氨基酸側鏈選擇性脫 保護并加入修飾劑而合成線性膚后，之后進行膚脫保護和純化的步驟。通過例如，對膜島 素、GLP-1和氯毒素的修飾是在線性膚合成完成后進行的。在許多情況下，修飾劑為諸如谷 氨酸、天冬氨酸的二酸衍生物，并且經修飾的官能團是氨基官能團，其可W是二氨基酸的側 鏈氨基官能團或膚的N端官能團。
[0006] 膚修飾劑可W為任意種類，包括膚;氨基酸，如谷氨酸及其衍生物、半脫氨酸及其 衍生物；W及復雜分子，如糖、聚乙二醇、親脂酸、親脂控、用于診斷的發色團和用于制備抗 體和研究疫苗的抗原。隨著修飾劑的復雜度提高，其合成的復雜度也提高。
[0007] 已經證實氨基二酸是膚和膚修飾劑之間合適的連接子。代表性例子有，德谷膜島 素和經修飾的膜島素，如利拉魯膚化iraglutide)和索馬魯膚(Semaglutide)膚，其中谷氨 酸連接在賴氨酸的側鏈上，所述谷氨酸的γ簇基官能團作為膚與親脂性基團的連接子。運 樣的修飾是有利的，運是由于剩余的游離α簇基官能團提高了修飾膚的水溶解度。通常，膚 的修飾是在合成后進行的。另外，可W在膚鏈在合適的樹脂上裝配好后進行修飾，將膚序列 中所含的二氨基酸(如賴氨酸)的側鏈氨基保護基團選擇性除去后，在樹脂上引入修飾劑。 [000引本發明旨在提供新的膚修飾劑及其制備方法。本發明的膚修飾劑已經在膚衍生物 的合成中得到應用，特別是用于治療的那些膚衍生物。
【發明內容】
[0009] 本發明的各方面在隨附的權利要求中闡述。
[0010] 在第一個方面，本發明設及式1表示的化合物，或其鹽：
[00川或其鹽：
[0012]
[0013] 其中；
[0014] a為1至10的整數，更優選為1至4或1至3的整數； [001引 b為0至7的整數；
[0016] Z為選自W下的末端基團：
[0017] ω式2表示的基團：
[001 引
[0019] 其中*表示與Υ連接的點；
[0020] r為1至12的整數，更優選為2至6的整數；
[0021] R功畑2或0R3，其中R3選自H、烷基、芳基和芳烷基；
[0022] R2為Η或Pr，其中Pr為氨基保護基團，優選為Fmoc;
[0023] (b)式4或式5表示的基團：
[0024]
[0025] 其中*表示與Y連接的點；W及
[0026] k和1各自獨立地為0至25的整數；
[0027] (C)式6、7、8或37表示的基團：
[002引
[0029] 其中*表示與Υ連接的點；
[0030] **表示與選自細、03、順1?'和式9的基團的連接；
[0031] Pr為氨基保護基團；
[0032] k和1各自獨立地為0至25的整數；W及
[0033] R和R '各自獨立地選自H、烷基和芳烷基；
[0034] (d)式10表示的基團：
[0035]
[0036] 其中*表示與Y連接的點；
[0037] R4為天然或非天然氨基酸的側鏈；
[003引C為1至12的整數；W及
[0039] **表示與選自0H、0R、NRR'和式9的基團的連接；W及
[0040] (e)式11或式12表示的基團：
[0041]
[0042] 其中*表示與Y連接的點；
[0043] X不存在，或選自C出、0、S和NR，其中R為H、烷基或芳烷基；
[0044] m、n、o、p各自獨立地為1至25的整數；W及
[0045] R5為Η或Pr，其中Pr為氨基保護基團，優選地選自Fmoc、Boc和Trt;
[0046] 各個Υ為獨立地選自W下的二價基團：
[0047] (a)式2'表示的基團：
[004引
[0049] 其中*表示(與式1的NH基團的)連接點；
[0050] **表不與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；
[0051] r為1至12的整數，更優選為2至6的整數；W及 [0化2] R功N出或0R3，其中R3選自H、烷基、芳基和芳烷基；
[0053] (b)式6'、7'或8'表示的基團：
[0化4]
[0055] 其中*表示(與式1的NH基團的)連接點；
[0056] **表不與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；
[0化7] k和1各自獨立地為1至25的整數；
[005引Pr為氨基保護基團；W及
[0059] R選自H、烷基和芳烷基；
[0060] (C)式10表不的基團：
[0061]
[0062] 其中R4為天然或非天然氨基酸側鏈的側鏈；
[0063] C為1至12的整數；
[0064] *表示(與式1的NH基團的)連接點；W及
[0065] **表示與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；W及
[0066] (d)式11'或式12'表示的基團：
[0067]
[006引其中*表示(與式1的NH基團的)連接點；
[0069] **表示與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；
[0070] X不存在，或選自C此、0、S和NR，其中R為H、烷基或芳烷基;并且m、n、o、p各自獨立地 為1至25的整數。
[0071] 本發明的第二個方面設及式18表示的樹脂綴合物：
[0072]
式18
[0073] 其中；
[0074] R功畑2或0R3，其中R3選自H、烷基、芳基和芳烷基，
[0075] r為1至12的整數，更優選為2至6的整數；
[0076] 樹脂為酸敏感性樹脂，其允許在tBu-型基團的存在下選擇性地從樹脂上裂解化合 物；
[0077] b為0至7的整數；
[007引 Z為選自W下的末端基團：
[0079] (a)式2表示的基團：
[0080]
[0081] 其中*表示與Y連接的點；
[0082] r為1至12的整數，更優選為2至6的整數；
[00削 R功畑2或0R3，其中R3選自H、烷基、芳基和芳烷基；
[0084] R2為Η或Pr，其中Pr為氨基保護基團，優選為Fmoc;
[0085] (b)式4或式5表示的基團：
[0086]
[0087] 其中*表示與Y連接的點；W及
[0088] k和1各自獨立地為0至25的整數；
[0089] (C)式6、7、8或37表示的基團：
[0090]
[0091 ]其中*表示與Y連接的點；
[0092] **表示與選自細、03、順1?'和式9的基團的連接；
[0093] Pr為氨基保護基團；
[0094] k和1各自獨立地為0至25的整數；W及
[0095] R和R'各自獨立地選自H、烷基和芳烷基；
[0096] (d)式10表示的基團：
[0097]
[0098] 其中*表示與Υ連接的點；
[0099] R4為天然或非天然氨基酸的側鏈;W及
[0100] C為1至12的整數；W及
[0101] **表示與選自細、03、順1?'和式9的基團的連接；
[0102] (e)式11或式12表示的基團：
[0103]
[0104] 其中*表示與Y連接的點；
[0105] X不存在，或選自C出、0、S和NR，其中R為H、烷基或芳烷基；
[0106] m、n、o、p各自獨立地為1至25的整數；W及
[0107] R5為Η或Pr，其中Pr為氨基保護基團，優選地選自Fmoc、Boc和Trt;
[0108] 各個Υ為獨立地選自W下的二價基團：
[0109] (a)式2'表示的基團：
[0110]
[0111] 其中*表示(與式1的NH基團的)連接點；
[0112] **表示與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；
[0113] r為1至12的整數，更優選為2至6的整數；W及
[0114] 化為N出或0R3，其中R3選自H、烷基、芳基和芳烷基；
[0115] (b)式6'、7'或8'表示的基團：
[0116]
[0117]其中*表示(與式1的NH基團的)連接點；
[011引**表示與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；
[0119] k和1各自獨立地為1至25的整數；
[0120] Pr為氨基保護基團；W及
[0121] R選自H、烷基和芳烷基；
[0122] (C)式10'表示的基團：
[0123]
[0124] 其中R4為天然或非天然氨基酸側鏈的側鏈的側鏈；
[0125] 幼語12的整數；
[0126] *表示(與式1的NH基團的)連接點；W及
[0127] **表示與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；W及
[0128] (d)式11'或式12'表示的基團：
[0129]
[0130] 其中*表示連接點；
[0131] **表示與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；
[0132] X不存在，或選自C此、0、S和NR，其中R為H、烷基或芳烷基;并且m、n、o、p各自獨立地 為1至25的整數。
[0133] 本發明的第Ξ個方面設及由式Z-(Y)b-〇H表示的化合物（中間體），
[0134] 其中；
[0135] b為0至7的整數；
[0136] Z為選自W下的末端基團：
[0137] (a)式2表示的基團：
[013 引
[0139] 其中*表示與Y連接的點；
[0140] r為1至12的整數，更優選為2至6的整數；
[0141] R功畑2或0R3，其中R3選自H、烷基、芳基和芳烷基；
[0142] R2為Η或Pr，其中Pr為氨基保護基團，優選為Fmoc;
[0143] (b)式4或式5表示的基團：
[0144]
[0145] 其中*表示與Υ連接的點；W及
[0146] k和1各自獨立地為0至25的整數；
[0147] (C)式6、7、8或37表示的基團：
[014 引
[0149] 其中*表示與Y連接的點；
[0150] **表示與選自細、03、順1?'和式9的基團的連接；
[0151] Pr為氨基保護基團；
[0152] k和1各自獨立地為0至25的整數；
[0153] P為1至20的整數；
[0154] q為5至20的整數；W及
[0155] R和R'各自獨立地選自H、烷基和芳烷基；
[0156] (d)式10表示的基團：
[0157]
[015引其中*表示與Y連接的點；
[0159] R4為天然或非天然氨基酸的側鏈；
[0160] C為1至12的整數；W及
[0161] **表示與選自0H、0R、NRR'和式9的基團的連接；W及
[0162] (e)式11或式12表示的基團：
[0163]
[0164] 其中*表示與Υ連接的點；
[01化]X不存在，或選自C出、0、S和NR，其中R為Η、烷基或芳烷基；
[0166] m、n、o、p各自獨立地為1至25的整數；W及
[0167] R5為Η或Pr，其中Pr為氨基保護基團，優選地選自Fmoc、Boc和化t; [016引各個Y為獨立地選自W下的二價基團：
[0169] (a)式2'表示的基團：
[0170]
[0171] 其中*表示(與0H基團的)連接點；
[0172] **表示與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；
[017引r為1至12的整數，更優選為2至6的整數；W及
[0174] R功畑2或0R3，其中R3選自H、烷基、芳基和芳烷基；
[0175] (b)式6'、7'或8'表示的基團：
[0176]
[0177] 其中*表示(與0H基團的)連接點；
[0178] **表示與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；
[01巧]k和1各自獨立地為1至25的整數；
[0180] Pr為氨基保護基團；W及
[0181] R選自H、烷基和芳烷基；
[0182] (C)式10'表示的基團：
[0183]
[0184] 其中R4為天然或非天然氨基酸側鏈的側鏈；
[0185] c為1至12的整數；
[0186] *表示(與0H基團的)連接點；W及
[0187] **表示與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；W及
[0188] (d)式11'或式12'表示的基團：
[0189]
[0190] 其中*表示(與0H基團的)連接點；
[0191] **表示與如上所述的基團Z或另一基團Y的連接；
[0192] X不存在，或選自C此、0、S和NR，其中R為H、烷基或芳烷基;并且m、n、o、p各自獨立地 為1至25的整數。
[0193] 本發明的其它方面設及制備式1表示的化合物的方法，W及式1表示的化合物及其 中間體在膚衍生物的制備中的用途。
[0194] 例如，本發明的另一方面設及如上所述的化合物在膚或其片段或其變體的制備中 的用途。
[01%]本發明的另一方面設及如上所述的樹脂綴合物在膚或其片段或其變體的制備中 的用途。
[0196] 本發明的另一方面設及制備膚或其片段或其變體的方法，所述方法包括使用根據 本發明所述的方法。
[0197] 本發明的又一方面設及膚或其片段或變體，其中所述膚或其片段中至少一個氨基 酸殘基被衍生自Z-( Y)b-〇H的膚修飾劑側鏈連接而修飾。
[0198] 因此，在另一方面，本發明設及式38表示的膚或其片段或變體：
[0199]
[0200] 其中；
[0201] a、b、Z和Y如上述限定；
[0202] 化和化各自獨立地為末端基團；W及
[0203] AaaxAaay· · 'Aagiz和AaaiAaa2…Aaan各自獨立地為含有1至100個天然或非天然氨基 酸殘基的天然膚或合成膚，各自任選地被保護。
[0204] 本發明的另一方面設及本發明所述的膚或其片段或變體在藥物中、或用作藥劑的 用途。
[0205] 本發明的另一方面設及一種藥物組合物，其包含本發明所述的膚或其片段或變 體，并混有可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
[0206] 發明詳述
[0207] 如本文所用，術語"烷基"包括可被(單或多）取代或未取代的飽和直鏈和支鏈燒 基。優選地，所述烷基為Cl-2Q烷基，更優選為Cl-15烷基，還更優選為Cl-12烷基，還更優選為Cl-6 烷基，更優選為Cl-3烷基。特別優選的烷基包括，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、下基、異下 基、叔下基、戊基和己基。合適的取代基包括(例如)選自〇H、〇-烷基、面素、畑2、NH-烷基、N- (烷基）2、CF3、N02、CN、C00-烷基、C00H、C0NH2、C0-NH-烷基、C0-N (烷基）2、S〇2-烷基、SO2NH2 和 S化-NH-烷基基團中的一個或多個基團。
[0208] 如本文所用，術語"芳基"是指可被(單或多）取代或未取代的C6-12芳香族基團。典 型例子包括苯基和糞基等。合適的取代基包括(例如)選自〇H、〇-烷基、面素、N此、NH-烷基、 N-(烷基）2、CF3、N02、CN、C00-烷基、C00H、C0NH2、C0-NH-烷基、C0-N (烷基）2、S〇2-烷基、SO2NH2 和S02-NH-烷基基團中的一個或多個基團。
[0209] 術語"芳烷基"用作上述術語烷基和芳基的結合。
[0210] 在本文所述本發明的所有方面，本發明包括本發明化合物的合適的所有對映異構 體和互變異構體。本領域技術人員能夠識別具有光學性質(一個或多個手性碳原子)或互變 異構特性的化合物。相應的對映異構體和/或互變異構體可通過本領域已知的方法分離或 制備。
[0211] 本發明的一些化合物可W為立體異構體和/或幾何異構體，例如它們可具有一個 或多個不對稱和/或幾何中屯、，從而存在兩個或多個立體異構和/或幾何形式。本發明包括 使用運些化合物及其混合物的所有獨立的立體異構體和幾何異構體。權利要求中所用的術 語包括運些形式。
[0212] 本發明還包括運些化合物或其可藥用鹽的所有合適的同位素變體。本發明試劑或 其可藥用的鹽的同位素變體定義為:至少一個原子被具有相同原子序數但是具有與自然界 通常發現的原子質量不同的原子質量的原子替換。可W引入所述試劑及其可藥用鹽的同位 素的例子包括:氨、碳、氮、氧、憐、硫、氣和氯的同位素，如分別為2h、3h、i3c、i 4c、i5n、"o、"o、 3中、3中、355、1中和36〔1。所述試劑及其可藥用的鹽的特定同位素變體在藥物和/或基體組織 分布的研究中是有用的，例如引入化或1化的放射性同位素。由于易于制備和檢測，氣標記 (即3H)和C-14(即1化）同位素是特別優選的。此外，諸如気（即2H)的同位素的取代可能由于 具有更高的代謝穩定性而具有一定的治療優勢，例如提高體內半衰期或降低所需劑量，因 此在一些情況下是優選的。通常可使用適當試劑的合適的同位素變體通過常規方法來制備 本發明所述試劑及其可藥用的鹽的同位素變體。
[0213] 本發明的化合物的可藥用的鹽包括其合適的酸加成鹽或堿加成鹽。合適的可藥用 的鹽可參見Be;rge等人的綜述J Pharm Sci ,66,1-19(1977)。可與強無機酸，如礦物酸（例如 硫酸、憐酸或氨面酸）；與強有機簇酸，如未取代或取代(如被面素取代）的具有1至4個碳原 子的燒簇酸(例如乙酸）；與飽和或不飽和二簇酸，例如草酸、丙二酸、下二酸、馬來酸、延胡 索酸、鄰苯二甲酸或對苯二酸;與徑基簇酸，例如抗壞血酸、乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或 巧樣酸;與氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；與苯甲酸;或與有機橫酸，如未取代或取代(例 如被面素取代)的(C1-C4)-烷基-或芳基-橫酸(例如甲橫酸或對甲苯橫酸)形成鹽。
[0214] 天然氨基酸包括:丙氨酸、精氨酸、天冬酷胺、天冬氨酸、半脫氨酸、谷氨酸、谷氨酷 胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨 酸、色氨酸、酪氨酸和鄉氨酸。
[0215]如本文所用，術語"非天然氨基膨'包括天然氨基酸的α和α-雙取代的氨基酸、N-燒 基氨基酸、乳酸、面化物衍生物，如Ξ氣酪氨酸、對-氯-苯丙氨酸、對-氣-苯丙氨酸、對-漠- 苯丙氨酸、Ρ-Ν02-苯丙氨酸、苯基甘氨酸、肌氨酸、青霉胺、D-2-甲基色氨酸、憐酸絲氨酸、憐 酸蘇氨酸、憐酸酪氨酸、Ρ-Ι-苯丙氨酸、k締丙基-甘氨酸、0-丙氨酸、0-天冬氨酸、0-環己基 丙氨酸、瓜氨酸、高絲氨酸、高半脫氨酸、焦谷氨酸、L-a-氨基下酸、心丫-氨基下酸、L-a-氨 基異下酸、α-環己基甘氨酸、二氨基下酸、二氨基庚二酸、Ν-ε-二硝基苯基-賴氨酸、L-1-糞 基丙氨酸、糞基丙氨酸、3-(2-化晚基)寸-丙氨酸、3-(3-化晚基)寸-丙氨酸、3-(4-化晚 基)-L-丙氨酸、Ν-ε-甲基-賴氨酸、N，Ν-ε -二甲基-賴氨酸、N，N，Ν-ε 甲基-賴氨酸、3-琉基 丙酸、L-ε-氨基已酸、7-氨基庚酸、6-氨基己酸、1^-蛋氨酸諷、鳥氨酸、k正亮氨酸、k正鄉氨 酸、P-硝基-k苯丙氨酸、L-徑基脯氨酸、丫-谷氨酸、丫-氨基下酸、k琉基脯氨酸、苯丙氨酸 (Wie)的甲基衍生物（如4-甲基-Phe、五甲基-Phe、(4-氨基）、kTyr (甲基）、(4- 異丙基）、kTic(1，2，3，4-四氨異哇嘟-3-簇酸）、k二氨基丙酸和kPhe(4-芐基）。
[0216] 本發明的化合物可W包含氨基酸的L型或D型，即一個或多個殘基，優選所有殘基 均可W為L型或D型。
[0217] 氨基酸的合適的保護基團是本領域技術人員熟知的（參見例如化em.Rev. 2009， 109,2455-2504)。運些保護基團可W分為如下Ξ類：
[021引 ·Ν-端保護基團；
[0219] 端保護基團；
[0220] 側鏈保護基團。
[0221] 在"Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical App;roach"W.C.Qian& P.D.White.Oxford University Press,2000(于2004年重印）中描述了合適的氨基保護基 團。
[0222] 在Green T"Protective Groups in Organic Synthesis".Chapter 1, J.Wil巧&Sons，Inc.，1991，10-142中描述了合適的徑基保護基團。
[0223] 在合成之前，純化的獨立的氨基酸與運些保護基團反應，然后在膚合成的特定步 驟被選擇性地除去。
[0224] 在本發明的上下文中，術語1 太片段"是指來自全長蛋白質的氨基酸序列（或其變 體）。優選地，膚片段在全長蛋白質中缺失一個或多個氨基酸殘基。
[0225] 優選地，所述膚片段在全長蛋白質中缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸殘基。 在另一個優選的實施方案中，所述膚片段包括全長序列的至少50%、至少60%、至少70%、 至少80%、至少90%或至少95%。
[0226] 如本文所用，術語"變體"包括任意變體，其中（a)-個或多個氨基酸殘基被一個天 然或非天然存在的氨基酸殘基替換；（b)兩個或多個氨基酸殘基的順序調換；（c)(a)和(b) 同時存在；（d)任意兩個氨基酸殘基之間存在聯接基團（spacer group); (e)類膚形式的一 個或多個氨基酸殘基；（f)膚的一個或多個氨基酸殘基的(N-C-C)骨架被修飾;或(a)至(f) 的任意組合。優選地，所述變體為(a)、（b)或(C)中的一者。
[0227] 更優選地，一個或兩個氨基酸殘基被一個或多個其它氨基酸殘基替換。更優選地， 一個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基替換。優選地，所述替換為同源性的。
[0228] 可能發生同源替換(本文使用的替換或置換均是指現存的氨基酸殘基與可選的殘 基的互換），即同比替換，如堿性替換堿性、酸性替換酸性、極性替換極性等。也可能發生非 同源替換，即一種殘基替換為另一種、或可選地包括非天然氨基酸，如鳥氨酸（W下稱為Z)、 二氨基下酸鳥氨酸下稱為B)、正亮氨酸鳥氨酸下稱為0)、化晚基丙氨酸、嚷吩基丙氨 酸、糞基丙氨酸和苯甘氨酸，下面列出了更詳細的列表。同時可W有多于一個氨基酸殘基被 修飾。
[0229] 如本文所用，根據W下類別對氨基酸分類：
[0230] 堿性:H、K、R;
[0231] 酸性:D、E;
[0232] 非極性:A、F、G、I、L、M、P、V、W;
[0233] 極性:C、N、Q、S、T、Y。
[0234] (使用國際接受的單字母氨基酸符號），并且使用運些種類來定義同源和非同源替 換。因此，同源替換是指在相同種類內的替換，而非同源替換是指被不同種類的替換或被非 天然氨基酸替換。
[0235] 除了氨基酸聯接基團如甘氨酸或β-丙氨酸殘基，可W插入到載體基團的任意兩個 氨基酸殘基之間的合適的聯接基團包括:烷基，如甲基、乙基或丙基。本領域技術人員能夠 理解另一種變體形式，（e)型，包括W類膚形式存在的一個或多個氨基酸殘基。為了避免疑 問，本文使用"類膚形式"來表示0-C取代基位于所述殘基的N原子而非a-C上的變體氨基酸 殘基。制備類膚形式的膚是本領域已知的，例如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20) ,9367-9371 和 Horwell DC, Trends Biotechnol.( 1995) 13(4)，132-134。（f)型修飾可由國際公開 PCT/ GB99/01855中描述的方法進行。
[0236] 氨基酸變體(優選為(a)或(b)型）優選獨立地發生在任意位置。如上所述，可能同 時發生多于一個的同源或非同源替換。通過在序列內反轉一些氨基酸殘基的序列可得到其 它變體。
[0237] 在一個實施方案中，替換氨基酸殘基選自丙氨酸、精氨酸、天冬酷胺、天冬氨酸、半 脫氨酸、谷氨酸、谷氨酷胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨 酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和鄉氨酸。
[0238] 替換氨基酸殘基另外也可W選自非天然氨基酸。可用于本發明的上下文中的非天 然氨基酸衍生物包括α*和α-雙取代*的氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的面化 物衍生物，如Ξ氣酪氨酸*、對-氯-苯丙氨酸*、對-漠 -苯丙氨酸*、對-艦-苯丙氨酸*、k締丙 基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、ka-氨基下酸*、k 丫-氨基下酸*、ka-氨基異下酸*、