min的間隔進行30次讀數并且計算665nm/615nm發射比。從所有數據中減去對應 于無酶對照的平均比值。通過繪制對照活性百分比對化合物濃度的log 10來產生化合物的 抑制曲線。使用中的S形劑量-響應何變斜率)方程通過非線性回歸計算IC50值。通過 初始值除W所獲得的最低值計算IC50的倍-平移(fold-shift),還記錄所觀察到的最大變化 時間（tmax)。
[0056] 當使用LanthaScreen? Eu-激酶結合測定進行測試時，CEP-40783顯示出對A)(L和 c-Met的時間依賴性結合動力學，運與第二種類型機制一致(見圖1)。結合數據顯示了 2小時 的從時間to至tmax的CEP-40783抑制A)(L的IC50值的35倍-平移。CEP-40783還顯示出對c-Met 的時間依賴性抑制，其中注意到ICso的38倍平移。
[0057] CEP-40783從 A)(L 和 c-Met 的解離
[005引還使用LanthaScreen? Eu-激酶結合測定確定了CEP-40783從A)(L和c-Met的解離 速率。測定緩沖液制備為用于締合，并且用于所有稀釋液。將扣L等分的80nM LanthaScreen Eu-抗-GST抗體:20nM GST-標記的酶混合物添加至格雷納低容量白色384孔板，而對照孔中 僅添加抗體。通過pintoolW高于最終測定濃度2000倍的濃度添加 DMS0中的化合物 (100化）。將DMS0添加至無抑制劑的對照孔。在環境溫度下解育一小時后，形成酶-抑制劑復 合物，然后將化L的反應混合物轉移至384孔化tiplate^erkinElmer)并添加 7祉L的激酶示 蹤劑236。最終的示蹤劑濃度對于AXL為10化Μ而對于c-Met為200nM。在25°C或37°C下，立即 開始讀數并且W2min的間隔讀取總共60個時間點。將減去背景的比值歸一化至無抑制劑對 照W計算示蹤劑結合％，其相對于時間進行繪制。在GraphPad Prism化a Jolla CA)中將數 據與單相締合模型（one phase association model)進行擬合。
[0059] 如圖2所見，在25°C下，CEP-40783對AXL和c-Met顯示出非常慢的"解離速率'，其為 假-不可逆結合動力學的示例。解離速率由較高的溫度(37°C)而輕微增加。認為，CEP-40783 的有效的ML和c-Met細胞活性可W通過緩慢的解離速率來解釋，其導致延長的藥物-受體 停留時間。使用運種技術已經顯示I型激酶抑制劑展示出快速的解離速率。
[0060] CEP-40783在腫瘤異種移植物中抑制A)(L和C-Met憐酸化
[0061 ]雌性Nu/Nu小鼠（6-8周，化arles River實驗室，Wilmington，MA) W5只/籠維持在 微型隔離單元中，采用標準實驗室飲食(Teklad Labchow,化rlan Teklad,Madison,WI)。將 動物飼養在控制濕度和溫度的條件下，并且Wl2小時的間隔設置光/暗循環。在實驗操作之 前將小鼠隔離至少一周。實驗得到了Teva Pharmaceuticals Inc的動物保護和利用委員會 (Insti1:utional Animal &re and Use Committee)的批準（協議03-023)。
[0062] 簡而言之，采集NCI-H1299NS化細胞（用于AXL研究）或GT1-16胃癌細胞（用于c-Met 研究)并W5Xl〇VmL的密度再懸浮于DMEM培養基中，并且使用2：3g針將等分（100化)的細胞 懸浮液(5X106個細胞)皮下接種于每只小鼠的左側。當腫瘤異種移植物的體積達到約300- 500mm3時，小鼠接受單次口服給予的PEG-400介質或指定劑量為10化L/劑的CEP-40783。在 給藥后的指定時間點，通過斷頭處死小鼠（每個時間點3只小鼠）并將血液采集在含有20化 肝素鋼（10,000單位/mL，在水中，Cat#0210193191，MP Biomedical,Solon,0H)的 1.5血微量 離屯、管中，然后簡單地放置在冰上。將所述管在4°C下W20,817x g(配有FA45-30-11旋轉體 的化pendorf離屯、機5417R)離屯、8分鐘，而且收集血漿并將其轉移至1.5mL微量離屯、管中，然 后膽存于-80°C。切除腫瘤并稱重，使用手術刀將其切成小片并放入在冰上的14mL圓底管中 (Cat#352059，Becton Dickinson,Franklin，NJ)。將兩體積份的不含去污劑的FRAK裂解緩 沖液[lOmM TriS，pH 7.5，50mM氯化鋼，20mM氣化鋼，2mM焦憐酸鋼，0.1 %BSA，外加新鮮配制 的ImM活化的抓酸鋼，4mM DTT，ImM PMSF和蛋白酶抑制劑混合物III (1: 100稀釋，Cat# 539134，Ca化iochem，La化lla，CA)]添加至1體積份的腫瘤中（例如，將5(Κ)化的FRAK裂解緩 沖液添加至250mg組織中）。然后使用手持式組織破碎儀將組織破碎2-3個周期，每個周期為 10-15秒，間隔為1-2分鐘。然后將裂解物超聲處理2次，每次4-5個沖程。將組織裂解物轉移 至1.5mL微量離屯、管中并在4°C下W20,817x g(配有FA45-30-11旋轉器的化pendorf離屯、機 5417R)離屯、10分鐘。將上清液（1化L)轉移至1.5mL微量離屯、管，所述微量離屯、管包含10祉L FRAK裂解緩沖液和含有新添加的lOOnM二硫蘇糖醇（Cat#F8 20-0 2，JT Baker， F*hillipsburg,NJ)的40化的4x LDS樣品緩沖液（Cat#NP0007, Invitrogen)。將剩余上清液 膽存于-80 °C。通過LC-MS/MS測量血漿和腫瘤裂解物中的化合物水平。根據抗體供應商 (Cell Si即aling 了6(：11]1〇1〇旨7)提供的方案，對于腫瘤?0分析，進行憐酸-(3-]\161:和總(3-]/[61 W及憐酸-A)(L和總A)(L的免疫印跡分析。家兔的憐酸-c-Met(Y1234/1235)(Cat#3129)和C- Met抗體（Cat#3127)W及家兔的憐酸-4化"702)(〔日1#5724)和4化抗體（〔日1#4939)購自 Cell Si即aling Technology(Beve;rly ,ΜΑ)。樣品在90°C下熱滅活5分鐘；在 150V下通過 NuPAGE 7%^(徑甲基）氨基甲燒醋酸鹽（打13-曰。61曰16)凝膠（〔曰1#640355280又， Invitrogen)對20化的各個樣品進行辨析，直到染料前沿脫離凝膠。使用濕的XCell II印跡 模塊（Cat#EL9051, Invitrogen)在30V恒定電壓下將凝膠轉移至硝酸纖維素膜（Cat# LC2000，Invitrogen)2 小時。將所述膜在含有 0.2%Tween-20(TBST)和 3% 化 stl 自 Carnation 脫脂奶(Nestle USA Inc,Solon,OH)的Tris-緩沖鹽水(TBS)中室溫封閉1小時。將所述膜用 抗-憐酸-c-Met(Tyrl234/1235)或抗-憐酸-A)(L抗體(Tyr702;Wl:1000稀釋在含有3%牛血 清白蛋白的TBST中）在室溫下解育1.5小時或在40°C下解育過夜，且同時輕輕搖動。在用 TBST洗涂Ξ次且每次洗涂10分鐘后，將所述膜用與辣根過氧化物酶化RP)(Cat#W401B， Promega，Madi son，WI)輛合的山羊抗兔抗體在室溫下解育1小時且同時輕輕搖動，所述辣根 過氧化物酶稀釋在含有3%脫脂奶的TBST中。在用TBST洗涂Ξ次且每次洗涂10分鐘并且用 TBSW5分鐘洗涂一次之后，將所述膜用5血的E&?-Western印跡檢測試劑(化t#RPN2106，GE Healthcare UK,Buckinghamshire,UK)解育5分鐘并暴露于Kodak化學發光BioMax膠片 (Cat#l78,8207;(^irestream Health Inc,Rochester,NY)W用于可視化。然后通過用剝離 緩沖液(62.5mM化is肥1 pH 6.8,2%SDS和lOOmM 2-琉基乙醇)在56°C解育30分鐘而剝離 所述膜，并且使用抗-c-Met和抗-A化抗體重新印跡，然后用:10,000稀釋的山羊抗兔- 皿P第二抗體重新印跡。對憐酸-A化和總AXLW及憐酸-c-Met和總c-Met的膠片影像各波段 進行掃描化P ScanJet 7400c,Hewlett-Packard Company,化10 Alto,CA)并使用Gel-Pro 分析儀軟件(Media切6日111日1:;!^3，1]1(3,8日1:11日3(1日，]\?)進行定量。然后計算每個腫瘤樣品相 對于介質對照腫瘤樣品的歸一化的A)(L和歸一化的c-Met的憐酸化的幅度。
[0063] 在PK/ro研究中，使用NCI-H1299NSCL異種移植物，CEP-40783對A)(L憐酸化顯示出 劑量-和時間-依賴性抑制，在W0.3mg/kg給藥后化，祀標抑制為~80% ; Wlmg/kg給藥時， 在6-24h之間，完全祀標抑制達>90%抑制;而lOmg/kg PO給藥導致給藥后高達4她期間的完 全A)(L抑制。對攜帶有NCI-H1299NS化C的雌性Scid小鼠按指示給予CEP-40783,并且在給藥 后6小時采集血漿和腫瘤樣品（圖3A)。通過免疫印跡法檢測在腫瘤樣品中對憐酸-AXUCell Signaling#5724)和總AXUCell Signaling#4977)的作用，并且計算歸一化的A)(L憐酸化的 抑制幅度。
[0064] 攜帶有GT1-16胃癌SC腫瘤異種移植物的nu/nu小鼠按指示給藥，并且在給藥后6小 時和24小時采集血漿和腫瘤樣品（圖3B)。使用化ISAQnvitrogen KH00281和KH02031)測定 對c-Met憐酸化的作用，并且計算歸一化的c-Met憐酸化的抑制幅度。
[00化]CEP-40783抑制NI冊T3/AXL異種移植物的生長
[0066] 如下產生改造的NI冊T3/A)(L細胞系。將人AXL cDNA亞克隆到pQCXIP載體內并在費 城兒童醫院通過測序確認序列。將在4mL DMEM+10%FBS中的PT67細胞(5X105)接種于6孔 板(Cat#353046，Becton Dickinson,化anklin Lakes，NJ)的各個孔中，并在含有5%C02的濕 潤的培養箱中在37°C下培養過夜。按照制造商的方案，使用化g的含有Lipofectamine? 2000 (Cat#52887，Invi trogen, Carlsbad，CA)轉染試劑的 pQCXIP-A)(L 將所述細胞轉染。簡而 言之，將在5(Κ)化培養基中的DNA與50化L的含有20化Lipofectamine? 2000轉染試劑的培 養基混合，并且將該混合物在室溫下解育20分鐘。在吸出培養基后，用2mL IX Du化ecco's 憐酸鹽緩沖鹽水(PBS, Cat#21-031-CM，Mediatech, Manassas，VA)洗涂培養皿，然后將1血的 適當的轉染混合物添加至各個孔。將所述孔返回至含有5%C02的37°C濕潤培養箱中并且每 30分鐘小屯、地搖動，在解育3小時后，去除該混合物并向各個培養皿中添加4mL新鮮的完全 培養基。在轉染后約48小時收集上清液W及在轉染后60小時再次收集上清液，并且通過 0.4化m過濾器過濾。將所述培養基等分并膽存于-80°C下待用。使用AXL逆轉錄病毒感染 NI冊T3細胞W產生穩定的NI冊T3/A)(L細胞系:將接種于10cm培養皿中的NI冊T3細胞更換至