4.5mL的含有A)(L逆轉錄病毒+新鮮添加的聚凝胺（最終濃度為祉g/mL)的收集培養基中。六 至八小時后，將6mL完全DMEM培養基加入至各個培養皿中，并且將細胞用該培養基解育48小 時。將所述細胞W1:4平分，然后使用0.扣g/mL嚷嶺霉素挑選，直到所有未感染的NIH3T3細 胞已經死亡。然后將所述細胞擴增，并且在體內異種移植物研究之前，通過免疫印跡法確認 細胞中的A)(L表達和酪氨酸憐酸化。
[0067] 將雌性Scid/Beige小鼠（6-8周，了曰(3〇111(3，化(13〇11，^)^5只/籠維持在微型隔離單 元中，采用標準實驗室飲食(Teklad Labchow,化rlan Teklad,Madison,WI)。將動物飼養在 控制濕度和溫度的條件下，并且W12小時的間隔設置光/暗循環。在實驗操作前將小鼠隔離 至少一周。所有動物研究都在Teva Pharmaceuticals Inc.的動物保護和利用委員會 ((IACUC))批準的協議#03-023下進行。
[0068] 收集NI冊T3/A化細胞并將其W5 X lOVmL的密度再懸浮于DMEM培養基中。使用23g 針將等分（100化)的細胞懸浮液(5 ΧΙΟ6個細胞)皮下接種于每只小鼠的左側。監控小鼠并 巧慢腫瘤大小。當NIH3T3/AXL腫瘤體積達到300mm3時，將攜帶腫瘤的小鼠隨機分配至不同 的處理組(8-10只小鼠/組）內，并且給予介質(PEG-400)或指定劑量的在陽G-400中配制的 CEP-40783(qd，100化每劑量體積）。使用游標卡尺測量各個腫瘤的長度化)和寬度(W)并且 每兩至Ξ天測定小鼠的體重。使用公式0.5236*L*W*化+WV2計算腫瘤體積。使用曼-惠特尼 秩和檢驗(Mann-怖itney Rank Sum Test)進行腫瘤體積和小鼠體重的統計學分析。在最后 一次給藥后2小時，獲得各劑量水平的血漿和腫瘤樣本，并且通過LC-MS/MS測量在血漿和腫 瘤裂解物中的化合物水平。
[0069] 如圖4所示，對攜帶皮下NIH3T3-A化腫瘤異種移植物的雌性SCID小鼠每天一次 (qd)經口（P0/每OS)給予介質或 W下劑量的CEP-40783:0.3mg/kg、Img/kg或 1 Omg/kg。每兩 至Ξ天測量并記錄腫瘤大小和小鼠體重，并計算絕對的腫瘤體積。在所有的測試劑量下 CEP-40783的給藥導致完全的腫瘤消退，運符合在運些A)(L依賴性腫瘤中A)(L活性的持久且 顯著的藥效動力學抑制。
[0070] CEP-40783抑制GT1-16胃癌異種移植物的生長
[0071] 人胃癌細胞系6化-16購自ATCC(美國組織培養物保藏中屯、，Manassas，VA)并且在 含有 10 %胎牛血清(FBS，Cat#S冊007003，Hyclone Laboratory Inc，Logan，UT)的DMEM培養 基中培養。將雌性Nu/Nu小鼠（6-8周齡，Charles River實驗室，Wilmington,ΜΑ)W5只/籠維 持在微型隔離單元中，并采用標準實驗室飲食(Teklad Labchow,化rlan Teklad,Madison, WI)。將動物飼養在控制濕度和溫度的條件下，并且小時的間隔設置光/暗循環。在實驗 操作前把小鼠隔離至少一周。實驗得到了Teva Pharmaceuticals Inc.的動物保護和利用 委員會的批準(03-023協議）。收集6化-16細胞并將其WSXlO^mL的密度再懸浮于DMEM培 養基中，然后使用23g針將等分（100化)的細胞懸浮液(5X106個細胞)皮下接種于每只小鼠 的左側。然后每天監控小鼠。當腫瘤體積約為200mm3時，將小鼠隨機分配至不同的處理組 (8-10只小鼠/組），并且口服給予介質（PEG-400)或指定劑量的在PEG-400中配制的CEP- 40783(qd，100化每劑量體積）。使用游標卡尺測量各個腫瘤的長度化)和寬度(W)并且每2-3 天測量小鼠體重。然后使用公式0.5236禮*W*(L+W)/2計算腫瘤體積。使用曼-惠特尼秩和檢 驗進行腫瘤體積和小鼠體重的統計學分析。與CEP-40783處理組相比，**p<0.01介質組。在 最后一次給藥后2小時，獲得各劑量水平的血漿和腫瘤樣本，并且通過LC-MS/MS測量在血漿 和腫瘤裂解物中的化合物水平。在研究結束時，通過將各個CEP-40783處理組的腫瘤體積 (TV)與介質處理組的腫瘤體積進行比較，按W下公式計算TGI值：1-(化合物處理組的最后 一天的TV/介質處理組的最后一天的TV)。
[0072] 運些數據（圖5)表明在運種cMet依賴性腫瘤模型中，W lOmg/kg和30mg/kg 口服給 予CEP-40783時，引起顯著的抗腫瘤功效(腫瘤停滯和消退）。
[0073] CEP-40783抑制邸C-1NS化C異種移植物的生長
[0074] 人NS化癌細胞系邸C-1購自ATCC(美國組織培養物保藏中屯、，Manassas，VA)并且在 含有 10%胎牛血清(FBS，Cat#S冊007003，Hyclone Laboratory Inc，Logan，UT)的DMEM培養 基中培養。將雌性Nu/Nu小鼠（6-8周，Charles River實驗室，Wilmington,Μ)W5只/籠維持 在微型隔離單元中，并采用標準實驗室飲食(Teklad Labchow,化rlan Teklad,Madison, WI)。將動物飼養在控制濕度和溫度的條件下，并且小時的間隔設置光/暗循環。在實驗 操作前將小鼠隔離至少一周。實驗得到了Teva Pharmaceuticals Inc.的動物保護和利用 委員會的批準(03-023協議）。收集6化-16細胞并將其WSXlO^mL的密度再懸浮于DMEM培 養基中，然后使用23g針將等分（100化)的細胞懸浮液(5X106個細胞)皮下接種于每只小鼠 的左側。然后每天監控小鼠。當腫瘤體積約為250mm3時，將小鼠隨機分配至不同的處理組 (8-10只小鼠/組），并且口服給予介質（PEG-400)或指定劑量的在PEG-400中配制的CEP- 40783(qd，100化每劑量體積）。使用游標卡尺測量各個腫瘤的長度化)和寬度(W)并且每2-3 天測量小鼠體重。然后使用公式0.5236禮*W*(L+W)/2計算腫瘤體積。使用曼-惠特尼秩和檢 驗進行腫瘤體積和小鼠體重的統計學分析。與CEP-40783處理組相比，**p<0.01的介質組。 在最后一次給藥后2小時，獲得各劑量水平的血漿和腫瘤樣本，并且通過LC-MS/MS測量在血 漿和腫瘤裂解物中的化合物水平。在研究結束時，通過將各個CEP-40783處理組的腫瘤體積 (TV)與介質處理組的腫瘤體積進行比較，按W下公式計算TGI值：1-(化合物處理組的最后 一天的TV/介質處理組的最后一天的TV)。
[0075] 如圖6所示，WlOmg/kg和30mg/kg的劑量口服給予CEP-40783,引起腫瘤消退，在運 種c-Met依賴性腫瘤模型中W3mg/kg給藥時，觀察到腫瘤停滯和部分消退。
[0076] CEP-40783的不連續的交替的口服給藥方案維持顯著的抗腫瘤功效
[0077] 采用與針對圖6的上述方法相類似的方法評估CEP-40783的不連續的交替的口服 給藥方案的抗腫瘤作用。邸C-1腫瘤異種移植物達到約200mm3時，將小鼠隨機分配至不同的 處理組(8-10只小鼠/組)并且W 口服給予介質(PEG-400)或在陽G-400中配制的CEP-40783, lOmg/kg qd。在7天的連續給藥時間段后，然后將動物轉換至7天給藥/7天停藥lOmg/kg qd 的給藥方案，或轉換至間歇的每周兩次(q2d)或每周Ξ次(q3d) 口服給藥lOmg/kg qd劑量， 總共21天。
[0078] 如圖7所見，當口服給予CEP-407837天然后是停藥期(qdx7,每7天給藥)和/或交替 的給藥方案，即q3d(每Ξ天給藥)或q2d(每兩天給藥)時，維持了顯著的抗腫瘤功效。特別 地，在每7天(40% )、每3天(70% )和每2天(40% ) 口服給予CEP-40783的組中，觀察到部分響 應。在qck7和q2d的給藥組中，分別觀察到10%和20%的動物的完全腫瘤消退，運表明CEP- 40783 的不連續的間歇給藥保持了符合其腫瘤藥效動力學曲線的、高度顯著的抗腫瘤活性。
[0079] CEP-40783抑制4T1-LUC2 全身性擴散
[0080] 鼠乳腺癌細胞系4T1-巧光素酶標記的細胞系購自化liper Life Sciences,其通 過由SV40啟動子表達的蛋火蟲巧光素酶基因的穩定轉染而產生。將所述細胞生長在補充有 10%胎牛血清巧85，〔日18冊007003，而(：1〇11日，1^旨日11，1]1')的016]\1培養基中。0-巧光素蛋火 蟲/鐘鹽（&t .化-8220)購自 Biosynth International, IncUasca, IL.。雌性Ba化-C小鼠 (6-8周）購自化arles River實驗室。在使用PEG-400或在陽G-400中配制的CEP-40783(W lmg/kg、10mg/kg和30mg/kg給藥，po，qd)開始處理后兩天，將0.5X 1054T1-Luc2培養的腫瘤 細胞iv(尾靜脈)注射至Ba化/c小鼠。兩天后，每周兩次測量小鼠體重并且每周Ξ次對小鼠 進行體內全身成像。總共進行23天處理，有21天在腫瘤細胞接種后進行。在研究結束時，使 用化liper Life Sciences(Xenogen)Spec化皿體內成像儀進行生物發光圖像分析。使用異 氣燒麻醉每個籠的五只小鼠，并且從0.5分鐘-最大值5分鐘的一系列時間點對其進行成像。 利用覆蓋在每張動物圖像上的主觀但相同尺寸的口限(gates)或興趣區（ROI)，使用Living Image軟件(vs.4.0,2010)進行圖像分析。計數轉化成平均光亮度或平均光子通量;表達為 光子/秒/平方厘米的表面積(p/s/cm^sr)。將曼-惠特尼非參數、單向或雙向ANOVA用作統 計檢驗，P值小于0.05被認為是顯著的。所使用的統計學軟件為Graph化d P;rism(vs.5.01， 2007)，并使用Microsoft Office Excel(專業版,2003)進行計算。
[00川如圖8所見，WlOmg/kg和30mg/kg劑量口服給予CEP-40783時，引起全身性4T1乳腺 腫瘤擴散的高度顯著性降低，W及在Img/kg劑量下，引起顯著(盡管幅度較小）降低的腫瘤 擴散。
[00劇 CEP-40783減少MDA-MB-231化eu原位乳腺癌植入物的淋己結轉移
[0083] 人乳腺癌細胞系MDA-MB-231-Leu-D3H2LN-巧光素酶表達細胞系購自Caliper Life Sciences。運種腫瘤細胞系通過由SV40啟動子表達的蛋火蟲巧光素酶基因的穩定轉 染而產生，并且根據從MDA-MB-231-Luc細胞在免疫缺陷小鼠中的自發性淋己結轉移中分離 時的轉移潛力而被進一步選擇。所述細胞生長在補充有10 %胎牛血清（FBS，Cat 甜3007003，曲(：1〇116，1^旨曰11，1]1')的016]\1培養基中。0-巧光素蛋火蟲/鐘鹽(〔曰1.化-8220)購 自Biosynth International, Inc. , Uasca, IL。雌性nu/nu小鼠（6至8周齡）購自化rlan實驗 室。將MDA-MB-231-Iuc-D3H2LN(2X106)細胞原位植入nu/nu小鼠的乳腺脂肪墊內，兩天后， 將小鼠分組(每組10只小鼠）并口服給予介質(PEG-400)或在陽G-400中配制的CEP-40783， lOmg/kg