高催化活性的基因改造梭菌屬神經毒素的制作方法
【專利說明】高催化活性的基因改造梭菌屬神經毒素 相關申請
[0001] 本申請要求W2013年8月21日提交的美國臨時專利申請號61/868,560為優先權基 礎，所述優先權文件的所有內容及公開都W引用方式被納入本申請中。
[0002] 本申請引用了多篇參考文獻及出版物。所述參考文獻及出版物的所有內容都W引 用方式被納入本申請中W便更能全面地描述與本發明相關的現有技術。
技術領域
[0003] 本發明設及包括肉毒桿菌神經毒素和破傷風神經毒素的梭菌屬神經毒素的改造， W及運些神經毒素及其衍生物的用途。
【背景技術】
[0004] 梭菌屬神經毒素 (Clostridia Neurotoxins ,CNTs)是其中一種最毒害人類的蛋白 毒素。例如，肉毒桿菌神經毒素(Botulinum化urotoxin，BoNT)會引起弛緩性麻搏并導致肉 毒中毒，破傷風神經毒素(Tetanus化urotoxinJeNT)則會引發疫李性麻搏。梭菌屬神經毒 素的分子量約150kDa，是一個具有典型A-B鏈-結構/功能特性的雙鏈蛋白，其中B區域(結合 區域)與哺乳動物細胞的表面分子先結合，A區域(活性區域)隨后轉位至細胞內的位置(1). 梭菌屬神經毒素由Ξ個功能區域組成:N-末端的催化區域(輕鏈，LC)、中間的轉運區域(重 鏈，HCT)及C-末端的受體結合區域(重鏈，HCR) (2)。梭菌屬神經毒素屬于鋒金屬蛋白酶，能 夠切割SNARE蛋白（Soluble N-ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment REc邱tor，可溶性NSF附著受體），SNARE蛋白干擾突觸小泡與質膜融合，最終阻止神經細胞 分泌神經傳導物質（1，3)。哺乳動物神經元的胞吐作用是由一種SNARE蛋白質復合物所帶 動，該蛋白質復合物由囊泡SNARE蛋白囊泡相關膜蛋白-2(vesicle associated membrane protein-2，VAMP2)W及兩種質膜SNARE蛋白，SNAP25(分子量為25kDa的突觸體相關蛋白 Synaptosome-Associated Protein)和突觸融合蛋白 la(syntaxin la)所形成（4) eBoNT共 有屯個血清型(血清型A-G)能切割Ξ種SNARE蛋白其中一種的某些特定氨基酸殘基:BoNT血 清型B、D、F和G及TeNT能切割VAMP2，BoNT血清型A及E能切割SNAP25,和BoNT血清型C能切割 SNAP25和突觸融合蛋白1曰(3,5-7)。
[0005] BoNTs最被廣泛使用于蛋白治療。早在1989年，BoNT血清型A(BoNT/A)經美國食品 和藥物管理局(FDA)批準用于治療斜視、眼險疫李、面肌疫李，也可用于頸部肌張力障礙、化 妝品、眉間面部線條及蔽窩多汗癥。由于BoNT血清型A對治療肌張力障礙和其他與不隨意肌 活動有關的毛病有效，并且符合安全性，BoNT血清型A在眼科、胃腸道科、泌尿外科、骨科、皮 膚科、分泌及痛癥各個領域已被批準作為實驗性使用或藥品標示外使用(8-17)"FDA于2000 年12月11日批準肉毒桿菌神經毒素血清型B(MY0BL0C?)用于治療患有頸部肌張力障礙的患 者，W減少與此病相關的頭部位置異常和頸部疼痛的嚴重性(18，19)。
[0006] BoNT對治療不隨意肌的疫李及收縮、美容或其它應用只有暫時性的效果，因此需 要重復注射BoNT。在一些患者中，BoNT可誘發針對BoNT毒素的中和抗體的產生，并降低BoNT 的可用性。由此引起的免疫耐藥性限制了 BoNT的成效，或會使病人對進一步治療毫無反應 (9，10，20-26)。雖然患者對BoNT治療產生免疫耐藥性的確切百分比不詳，但相比BoNT血清 型B的治療，通常較少患者對BoNT血清型A的治療產生免疫耐藥性（9,26)。運可能是由于 BoNT血清型A復合物所使用的劑量比BoNT血清型B復合物的較低(27) dBoNT中和抗體多見于 接受頸部肌張力障礙或疫李治療的患者，運是由于治療此病癥需要更大劑量的毒素和定期 給藥。至于治療喉張力障礙、眼險疫李的患者或化妝品用途，由于需要較小的BoNT劑量，中 和抗體不太常見(9，28，29)。降低治療劑量或有助減少產生BoNT治療的免疫耐藥性。
[0007] 迄今為止仍未有方案能有效處理BoNT免疫耐藥性的問題。過往曾有研究試圖阻堵 設及誘導中和抗體的BoNT表位。研究人員將取自耐藥患者的中和抗體與BoNT血清型A和 BoNT血清型B的不同區域的反應，從而確定一系列可能設及誘導中和抗體的免疫原區（39- 41)。有報告指膚與單甲氧基聚乙二醇(m陽G)綴合能抑制針對膚的免疫反應。BoNT血清型A 的重鏈區域化C/A)有較強的免疫反應，研究人員將BoNT/A重鏈與mPEG綴合，并在小鼠接受 BoNT/A治療前施用該綴合物W進行預先免疫。結果顯示，某些mPEG綴合物減少了中和抗體 的產生(42)，表示該預先免疫程序或可臨床應用于免疫耐藥的患者。
[0008] 由于BoNT的治療特性和免疫耐藥性相互關聯，改造 BoNT成為更高活性的毒素 W降 低其治療所需劑量是克服免疫耐藥性最好的方法。Rummel等人將BoNT血清型B重鏈區域中 用來結合神經節巧脂的模序修改，相比原型毒素，改造后的毒素的結合和毒性提升高達Ξ 倍(43)。然而，BoNT的受體結合區域經改造后有可能影響結合作用的選擇性。此外，改造結 合區域不一定可W顯著增加毒素的效力W避免產生免疫耐受性。相反，改造輕鏈化C)W改 變BoNT活性或更有助于避免產生免疫耐受性。因此，有必要改造梭菌屬神經毒素，如肉毒桿 菌神經毒素，W提高其治療效果。 發明概述
[0009] 本發明提供了調節肉毒桿菌神經毒素及破傷風神經毒素的活性的方法。
[0010] 在一個實施例中，本發明的方法通過提升毒素的催化活性W增強破傷風神經毒素 輕鏈化C/T)和肉毒桿菌神經毒素輕鏈化C/B)的底物識別。
[0011] 在一個實施例中，本發明提供肉毒桿菌神經毒素和破傷風神經毒素的衍生物及其 應用。
[0012] 在一個實施例中，本發明提供破傷風神經毒素輕鏈化C/T)的衍生物或整個破傷風 神經毒素的衍生物，運些衍生物的活性被更改。
[0013] 在一個實施例中，本發明提供破肉毒桿菌神經毒素輕鏈化C/T)的衍生物或整個肉 毒桿菌神經毒素的衍生物，運些衍生物的活性被更改。
[0014] 在一個實施例中，本發明所述的肉毒桿菌神經毒素輕鏈化C/B)的衍生物或肉毒桿 菌神經毒素衍生物可W在各種治療、化妝品或其它應用中使用。在另一個實施例中，本發明 所述的肉毒桿菌神經毒素輕鏈化C/B)的衍生物或肉毒桿菌神經毒素衍生物用于治療減少 肉毒桿菌神經毒素的免疫耐藥性。
[0015] 在另一個實施例中，本發明提供了使用肉毒桿菌神經毒素 W改善當前的療法的方 法。在另一個實施例中，本發明提供了將肉毒桿菌神經毒素的衍生物或肉毒桿菌神經毒素 的輕鏈衍生物應用于各種治療或美容用途的方法。
【附圖說明】
[0016] 圖1所示的為破傷風神經毒素輕鏈化C/T)和肉毒桿菌神經毒素輕鏈化C/B)的S2'， Sr和S1 口袋，W及VAMP2的P位點。圖1顯示了位于口袋并與VAMP2不同P位點交互的氨 基酸殘基。圖1A示出的是LC/T和VAMP2產生相互作用的殘基，其中LC/TW表面模型來表示。 圖1B示出的是LC/T和VAMP2產生相互作用的殘基，其中LC/TW卡通模型來表示。圖1C示出的 是LC/B和VAMP2產生相互作用的殘基，其中LC/BW表面模型來表示。圖1D示出的是LC/B和 VAMP2產生相互作用的殘基，其中LC/BW卡通模型來表示。W下為VAMP2的P位點和LC/T的 S2 '，Sr和S1 口袋的命名方法：形成VAMP2可切鍵的兩個殘基從C-末端到N-末端被命名為 Ρ1-ΡΓ。從P1到C-末端方向的殘基被指定為P2，P3等，而從ΡΓ到N-末端方向的殘基被指定 為P2 '，P3 '等。識別特定P位點的LC/T或LC/B口袋W相應的…袋命名。識別VAMP2的P2 '位點 (即E78)的LC/T和LC/B S2 ' 口袋分別由R374和R3?組成。識別VAMP2的ΡΓ位點（即F77)的LC/T 和LC/B S1' 口袋分別由L23哺I227組成。識別VAMP2的P1位點（即礦6)的LC/T和LC/B S1 口袋分 別由Kiss肥和Eiss肥組成。
[0017] 圖2所示的為LC/T、LC/B及其衍生物裂解VAMP2的催化活性。圖2A示出的為LC/T及 其衍生物裂解VAMP2的活性。圖2B示出的為LC/B及其衍生物裂解VAMP2的活性。誤差線為每 個實驗重復Ξ次的標準差。
[001引圖3所示的為LC/B、LC/T及LC/T衍生物比16?，。3叫]的S Γ 口袋殘基的方位。圖3A比 較位于sr 口袋的殘基LC/B(I2")、LC/T(L2w)及1〔/1'[1(16化，。 3叫](12^)的方位。其中線表示 膚的主鏈骨架，而棒則表示殘基。圖3B示出的為sr 口袋的相對平坦的位置，當中包括LC/B 的I2"(黑色)及LC/T的比16?，。3叫]的(灰色）。圖3C所示的為LC/T的sr 口袋的隆起表面 (W網狀曲面來表示），當中包含L2^。圖3D所示的為LC/T的sr 口袋的隆起表面m固定表面 來表示），當中包含L2^。
[0019 ]圖 4所示的為LC/T (圖 4A)、LC/B (圖 4B)及LC/T [ k168E，L2呵](圖 4C)的 S Γ 和S2 ' 口袋 中殘基之間的距離。sr殘基側鏈和S2'殘基側鏈之間的距離使用PyM化程式測量。LC/T的 R37哺L23哺者之間的距離約7.2 A:，LC/B的R37哺I22哺者之間的距離約巧也LC/T[k168E, 。3叫]的I23哺R37哺者之間的距離約S 3先。
[0020] 圖5所示的為重組LC/B、LC/T及其衍生物裂解內源性VAMP2的結果。圖5A顯示LC/T 及LC/T[k168E，L23叫]裂解內源性VAMP2的結果。圖5B顯示LC/B及LC/B[sWi門裂解內源性 VAMP2的結果。在每個圖中，上圖所示的是分析VAMP2裂解的蛋白印跡結果，當中使用針對 VAMP2的抗體和針對肌動蛋白的抗體。下圖則表示蛋白印跡分析的量化結果。
【發明內容】
[0021] 為了提高BoNT的治療效果及減少誘導BoNT的中和抗體，將BoNT改造成為更強力的 衍生物是非常有用的，運可W減低BoNT于各種治療及應用中的有效劑量。
[0022] 通過研究肉毒桿菌神經毒素及破傷風神經毒素的底物識別及特異性，本發明將肉 毒桿菌神經毒素及破傷風神經毒素改造成新的衍生物，W提高其活性和底物特異性。
[0023] 本發明中對肉毒桿菌神經毒素輕鏈化C/B)和破傷風神經毒素輕鏈化C/T)的底物 識別口袋中的活性部位進行比較和分析。
[0024] 在一個實施例中，本發明提供了通過提升催化活性W優化破傷風神經毒素輕鏈 化C/T)和肉毒桿菌神經毒素輕鏈化C/B)的底物識別。
[0025] 在一個實施例中，本發明提供了調節肉毒桿菌神經毒素及破傷風神經毒素的活性 的方法。
[0026] 在一個實施例中，本發明提供增強了活性的肉毒桿菌神經毒素輕鏈化C/B)的衍生 物或整個肉毒桿菌神經毒素的衍生物。在一個實施例中，本發明所述的肉毒桿菌神經毒素 包含SEQ ID NO.: 1的多膚。在另一個實施例中，本發明所述的肉毒桿菌神經毒素衍生物的 氨基酸序列帶有一個或多個改變。在一個實施例中，肉毒桿菌神經毒素的衍生物包含位于 SEQ ID N0.:1第201位的氨基酸的改變，所述氨基酸由絲氨酸serine(swi)改變為脯氨酸 proline(pwi)。在另一個實施例中，肉毒桿菌神經毒素衍生物[s^i門包括SEQ ID N0.:2的 序列。
[0027] 在一個實施例中，肉毒桿菌神經毒素的衍生物包括位于SEQ ID NO. :1第263位的 丙氨酸alanine的改變。在另一個實施例中，肉毒桿菌神經毒素的衍生物包括位于SEQ ID NO. : 1第264位的異亮氨酸isoleucine的改變。
[0028] 在一個實施例中，本發明提供破傷風神經毒素輕鏈化C/T)的衍生物或整個破傷風 神經毒素的衍生物。在一個實施例中，本發明所述的破傷風神經毒素包括SEQ ID NO. :3的 多膚。在另一個實施例中，本發明所述的破傷風神經毒素衍生物的氨基酸序列帶有一個或 多個改變。在一個實施例中，破傷風神經毒素的衍生物包含位于SEQ ID NO. :3第230位的氨 基酸的改變，所述氨基酸由亮氨酸leucinea2^)改變為異亮氨酸isoleucin