改善植物農學性能的bg1組合物和方法
【專利說明】
[0001 ] 交叉引用
[0002] 本實用申請要求提交于2013年8月8日的中國專利申請No. 201310343713.3的優先 權，該申請W引用方式并入本文。 陶]對^電子方式提交的序列表的引用
[0004] 2014年8月6日創建的文件名為"5648P2_sequence_listing.txt"、大小為85字節 的序列表W計算機可讀的形式與本說明書同時提交，該序列表是本說明書的一部分并全文 W引用方式并入本文。
技術領域
[0005] 本公開整體設及分子生物學領域。
【背景技術】
[0006] 許多植物的馴化已與產量顯著提高相關。自然群體中發生的大多數表型變異是連 續的并通過多種基因影響來實現。對造成馴化植物中產量顯著不同的特定基因的鑒別已成 為農業研究的重要焦點。
[0007] 水稻是超過一半的世界人口的主要膳食組分。同時提高水稻產量和最終使用質量 仍然是一個挑戰。谷物顆粒尺寸是主要育種目標，因為它既影響產量，也影響質量。運一性 狀的基因控制在過去十年中得到了廣泛的研究。然而，谷物顆粒尺寸的許多遺傳決定子目 前只能通過定量性狀基因座(Q化)進行解釋，人們對編碼的基因產物的性質還沒有詳細的 了解。本公開提供了改善谷物顆粒尺寸、形狀和質量的方法和組合物。
【發明內容】
[000引本公開提供了新型基因 OsBGl的多核巧酸、相關多膚及所有保守修飾的變體，該基 因已顯示出可影響水稻的谷物顆粒產量和其他農學參數。在一個實施例中，大粒基因(BG1) 同時控制谷物顆粒和節間部分的伸長。在一個實施例中，過表達BG1的轉基因植物具有增大 的種子尺寸和穗長，而通過RNAi敲除BG1基因則得到較小的種子尺寸。BG1可由生長素誘導， 并且Bgl-D突變體顯示出對IAA的敏感性提高且生長素極性傳輸增強，運改變了內源性IAA 分布。本發明公開了 BG1在水稻和其他植物的分子育種中的用途。
[0009] 改善植物農學特性的方法，該方法包括調節W下多核巧酸的表達：（i)編碼包含 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 1中的一者具有至少95%同一性的氨基酸序列 的多核巧酸，（ii)在嚴格的雜交條件下與包含SEQ ID N0:2的多核巧酸的片段雜交的多核 巧酸，其中所述片段包含SEQ ID N0:2的至少100個連續核巧酸，（iii)編碼與SEQ ID N0:1 具有至少90%同一性的氨基酸序列的多核巧酸，（iv)編碼多膚的多核巧酸，與SEQ ID NO: 1 相比所述多膚包含氨基酸的一個或多個缺失或插入或替換。
[0010] 在一個實施例中，通過用可操作地連接至異源啟動子的重組多核巧酸轉化植物來 提高編碼與SEQ ID NO: 1具有至少95%同一性的多膚的多核巧酸的表達。在一個實施例中， 通過上調與內源性多核巧酸可操作地結合的調控元件的基因表達來提高編碼與SEQ ID NO: 1具有至少95%同一性的多膚的內源性多核巧酸的表達。在一個實施例中，通過在SEQ ID NO: 3的調控元件的調控下表達所述多核巧酸來提高多核巧酸的表達。
[0011] 在一個實施例中，所述農學特性選自：（i)谷物顆粒尺寸增大，（i i)谷物顆粒重量 增加，（iii)穗長增大，（iv)谷物顆粒產量提高，（V)巧粒灌漿速率提高，（Vi)生物量增加。農 學特性的改善是相對于未顯示BG1水平升高的對照植物(或它的變體或同系/同源物)而測 量的。在一個實施例中，農學性能為植物生物量的增加。在一個實施例中，相對于多核巧酸 的表達未提高的對照植物，谷物顆粒重量有所增加。
[0012] 在一個實施例中，植物為單子葉植物。在一個實施例中，植物為水稻或玉米。在一 個實施例中，植物為雙子葉植物。在一個實施例中，植物為大豆。
[0013] 在一個實施例中，提高植物產量的方法包括提高編碼多膚的多核巧酸的表達，所 述多膚包含選自SEQIDN0:1、SEQIDN0:4-SEQIDN0:27的氨基酸序列或它們的等位基 因變體。
[0014] 在一個實施例中，提高水稻顆粒產量的方法包括表達編碼多膚的多核巧酸，所述 多膚包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其變體。
[0015] 在一個實施例中，植物的標記輔助選擇或識別與提高產量相關的先天性狀的方法 包括：
[0016] a.進行植物的標記輔助選擇，該植物在編碼包含SEQ ID NO: 1或其變體或其調控 序列的蛋白質的基因組區域中具有一個或多個變異；W及
[0017] b.識別表現出更高產量的植物。
[0018] 在一個實施例中，在一組水稻植株中識別與谷物顆粒產量提高相關的一個或多個 等位基因的方法包括：
[0019] a.評估一組水稻植株中的下列區域中的一個或多個等位基因變異：（i)基因組區 域，該基因組區域編碼多膚，或（ii)控制多膚表達的調控區，其中多膚包含SEQ ID NO: 1的 氨基酸序列或與SEQ ID NO: 1具有95%同一性的序列；
[0020] b.獲得該組中一個或多個水稻植株的產量提高的表型值；
[0021] C.將基因組區域中等位基因的變異與表型相關聯；W及
[0022] d.識別與產量提高相關的一個或多個等位基因。
[0023] 在一個實施例中，分離的多核巧酸包括(例如）（i)編碼包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27中的一者的氨基酸序列或與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27 中的一者具有至少95%同一性的氨基酸序列，（ii)在嚴格的雜交條件下與選自SEQ ID NO: 2的多核巧酸的片段雜交，其中所述片段包含SEQ ID N0:2的至少100個連續核巧酸，（iii) 編碼與SEQ ID N0:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，（iv)編碼多膚的多核巧酸，與SEQ ID NO: 1相比所述多膚包含氨基酸的一個或多個缺失或插入或替換，其中所述多核巧酸編 碼參與谷物顆粒寬度、重量或產量調節的多膚。
[0024] 在一個實施例中，重組表達盒包括可操作地連接至調控元件的多核巧酸，其中該 表達盒在植物細胞中是有功能的。在一個實施例中，宿主細胞包括表達盒。在一個實施例 中，轉基因植物包括重組表達盒。
[0025] 在一個實施例中，轉基因植物部件包括植物調控元件，該植物調控元件可操作地 調控編碼多膚的多核巧酸的表達，所述多膚包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其變體或其 同源物，其中所述調控元件與多核巧酸是異源的。
[0026] 在一個實施例中，調控表達的多核巧酸包含選自SEQ ID N0:7-SEQ ID N0:8的序 列或其功能啟動子片段。
[0027] 在一個實施例中，用于提高產量的玉米植株的標記輔助選擇方法包括：
[0028] a.檢測多個玉米植株中的基因組區域中的或調控序列中的一個或多個基因變異， 其中所述基因組區域包含編碼選自SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 14的蛋白質或其變體的多核 巧酸，所述調控序列控制其多核巧酸的表達;W及
[0029] b.將所述一個或多個變異與產量提高相關聯，從而選擇具有與更高產量相關的一 個或多個變異的玉米植株。
[0030] 在一個實施例中，識別一組玉米植株中的與產量提高相關的一個或多個等位基因 的方法，所述方法包括：
[0031] a.評估一組玉米植株中的下列區域中的一個或多個基因變異：（i)編碼多膚的基 因組區域，或（ii)控制多膚表達的調控區，其中多膚包含選自SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 14 的氨基酸序列或與沈Q IDNO: 12-沈Q ID NO: 14具有95%同一性的序列；
[0032] b.獲得該組中一個或多個玉米植株的產量數據；
[0033] C.將編碼多膚的基因組區域中的或控制多膚表達的調控區中的一個或多個基因 變異與產量相關聯，從而識別與產量提高相關的一個或多個等位基因。
[0034] 在一個實施例中，所述一個或多個基因變異在多核巧酸的編碼區中。在一個實施 例中，調控區為啟動子元件。在一個實施例中，產量為谷物顆粒產量。
[0035] 提高植物的谷物顆粒寬度、重量或產量的方法包括W下步驟:調節W下多核巧酸 的表達（i)編碼包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27中的一者的氨基酸序列或與 沈Q ID N0:1、沈Q ID N0:4-沈Q ID N0:27中的一者具有至少95%同一性的氨基酸序列的 多核巧酸，（ii)在嚴格的雜交條件下與編碼多膚的多核巧酸的片段雜交的多核巧酸，所述 多膚選自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27,其中所述片段包含編碼多膚的多核巧 酸的至少100個連續核巧酸，所述多膚選自沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27(iii) 編碼與SEQ ID N0:1具有至少90%同一性的氨基酸序列的多核巧酸，（iv)編碼多膚的多核 巧酸，與SEQ ID NO: 1相比，所述多膚包含氨基酸的一個或多個缺失或插入或替換，其中所 述多核巧酸編碼參與谷物顆粒寬度、重量或產量調節的多膚。
[0036] 在一個實施例中，包含SEQ ID NO: 2的片段的多核巧酸足W上調編碼多膚的多核 巧酸的內源性表達。在一個實施例中，通過RNA干擾來實現表達的調節。
[0037] 在一個實施例中，通過誘變來實現表達的調節。在一個實施例中，通過微RNA介導 的基因沉默來實現表達的調節。在一個實施例中，通過啟動子介導的基因抑制來實現表達 的調節。在一個實施例中，通過內源性調控元件的祀向誘變來實現表達的調節。
[0038] 在一個實施例中，相對于未表達多核巧酸的對照植物，谷物顆粒重量有所增加。
[0039] 在一個實施例中，表達的調節是在單子葉植物中進行的。在一個實施例中，植物為 水稻。在一個實施例中，植物為雙子葉植物。
[0040] -種提高水稻顆粒的長寬比的方法包括W下步驟:調節編碼多膚的多核巧酸的表 達，所述多膚包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其等位基因變體。
[0041] -種提高水稻顆粒產量的方法，該方法包括調節編碼多膚的多核巧酸的表達，所 述多膚包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其變體。
[0042] -種用于提高谷物顆粒尺寸或產量的植物標記輔助選擇的方法，所述方法包括W 下步驟:進行植物的標記輔助選擇，其中所述植物在編碼包含SEQ ID NO: 1或其變體或其調 控序列的蛋白質的基因組區域中具有一個或多個變異；W及識別產生谷物顆粒質量有所提 高和/或產量更高的谷物的植物。
[0043] -種識別水稻植株或水稻種質中與谷物顆粒質量改善和/或產量提高相關的等位 基因的方法，所述方法包括W下步驟:獲得一組水稻植株，其中一個或多個植株顯示谷物顆 粒質量改善和/或產量提高;相對于編碼包含多膚(包含SEQ ID NO: 1)的蛋白質的多核巧酸 序列來評估等位基因變異，或在調控編碼蛋白質的多核巧酸的表達的基因組區域中評估等 位基因變異;獲得該組中的多個水稻植株的谷物顆粒質量改善和/或產量提高的表型值;將 與多核巧酸相關的基因組區域中的等位基因變異與所述表型相關聯；W及識別與谷物顆粒 質量改善和/或產量提高相關的等位基因。
[0044] 在一個實施例中，本文所述的多核巧酸編碼參與谷物顆粒寬度、重量或產量調節 的多膚。
[0045] 在一個實施例中，宿主細胞包括本文所公開的重組多核巧酸。在一個實施例中，轉 基因植物包括本文所公開的重組表達盒。
[0046] 分離的多核巧酸可操作地調控編碼多膚的多核巧酸的表達，所述多膚包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其變體。在一個實施例中，調控表達的多核巧酸包含SEQ ID N0:3的序 列或其功能啟動子片段。
[0047] 表1序列說明
[0048] 本申請隨附的且W引用方式并入本文的序列說明和序列表符合美國聯邦法規 37C. F. R. §1.821-1.825中關于專利申請中的核巧酸和/或氨基酸序列公開的指導規則。
[0049] 序列表包含核巧酸序列特征的單字母代碼和氨基酸的Ξ字母代碼，其符合 Nucleic Acids Res. 13:3021-3030( 1985)(《核酸研究》，第 13卷，第3021-3030頁，1985年） 和Biochemical J. 219(2) :345-373( 1984)(《生物化學雜志》，第219卷，第2期，第345-373 頁，1984年）中所描述的IUPAC-IUBMB標準，所述文獻W引用方式并入本文。用于核巧酸和氨 基酸序列數據的符號和格式符合37C .F.R.§1.822中所示的規則。
[(Κ)加 ]
[0化1 ]
[0化2]
[0053] 在另一個方面，本公開設及包含所述核酸的重組表達盒。另外，本公開設及包含該 重組表達盒的載體。此外，包含該重組表達盒的載體可有利于該核酸在宿主細胞中的轉錄 和翻譯。本公開還設及能夠表達本公開的多核巧酸的宿主細胞。可W使用多種宿主細胞，諸 如但不限于微生物、哺乳動物、植物或昆蟲細胞。
[0054] 在另一個實施例中，本公開設及含有本公開的核酸的轉基因植物或植物細胞。含 有本公開的多核巧酸的優選植物包括但不限于玉米、大豆、向日葵、高梁、卡諾拉、小麥、首 猜、棉花、水稻、大麥、西紅柿和稷。在另一個實施例中，轉基因植物為玉米植物或植物細胞。 另一個實施例是來自本公開的轉基因硝酸鹽攝取相關多膚的轉基因種子，該多膚可操作地 連接至在植物中驅動表達的啟動子。與對照植物相比，本公開的植物可具有改善的谷物顆 粒質量。
【附圖說明】
[0055] 圖1示出了 Bgl-D突變體的表型。（A).在1/2MS培養基上生長的10天齡幼苗。比例 尺，5畑1。（8和C).在稻田中生長的2月齡(B)或4月齡(C)植株的生長表型。比例尺，10cm。（D和 E).相較于Bgl-D，幼穗化)和收獲的穗化)顯示長度增大。比例尺，5畑1。巧）.相對于Bgl-D，成 熟種子顯示尺寸增大。比例尺，10mm。
[0056] 圖2示出了抽穗前穎殼的組織學分析。（A).野生型或Bgl-D植物的小穗。比例尺， 2mmD(B).穎殼的橫截面。虛線指示橫截面的位置。比例尺，0.5mmD(C).B中框出的橫截面的 放大視圖。比例尺，0.1mm。（D-F).由野生型和Bgl-D植物形成的穎殼的外實質層的總面積 (D)、細胞數化）和細胞面積(F)。所有數據均為平均值±S.D.(n=15)。用學生t檢驗生成P 值。* 沖 <0.01。
[0057] 圖3示出了 BG1基因的鑒定。（A).Bgl-D突變體的T-DNA側翼區的示意圖。稱為BG1的 負責表型(0s03g0175800,其編碼具有未知功能的新型蛋白質，藍色）的候選0RF位于T-DNA 插入序列的下游0.8-化。水稻Actinl啟動子用綠色箭頭示出，LB和RB為T-DNA的左右邊界。 (B).野生型和Bgl-D植物中的BGlmRNA的表達水平。數據得自Ξ次獨立的平行測定。值W平 均值±S.D.表示。
[005引圖4示出了 BG1的系統發育分析。根據綠色植物中的BGl(0s03g0175800)同源物的 氨基酸序列推斷出MEGA4鄰接樹。自展值基于1000個平行測定并在它們各自的節點中顯示。 比例尺指示基于分支長度的遺傳距離。沈Q ID NO:l、沈Q ID N0:4-SEQ ID NO:27代表BG1 的系統發育中所示的序列。
[0059] 圖5示出了 BG1的表達模式。（A).通過定量RT-PCR分析得到的各個器官中BG1的表 達。在2月齡野生型(Nipponpare)植株中收獲的根、莖、葉和葉銷。使用不同長度的幼穗(YP) 進行分析，數字表示長度(厘米）。數據得自Ξ次獨立的平行測定。(B).PR0BG1:GUS轉基因株 系組織的GUS染色。（a)幼莖橫截面的顯微鏡觀察。（b)幼穗。（C)發育中的外殼。（d)外殼的橫 截面。（e)成熟的谷物顆粒。
[0060] 圖6示出了過表達BG1的轉基因水稻植株中增大的谷物顆粒尺寸和增加的重量。 (A).野生型(WT)、0E-l、0E-2和0E-3轉基因植物的總體形態。比例尺，20畑1。（8).示出了野生 型和轉基因植物的穗長對比。比例尺，5cm"(C).示出了野生型和轉基因植物的谷物顆粒形 態。比例尺，5mm。(D)野生型和轉基因植物中BG ImRNA的相對表達水平。數據得自Ξ次獨立的 平行測定。化-F).示出了野生型和轉基因植物的谷物顆粒長度化）、谷物顆粒寬度(F)和每 1000粒重量(G)的對比。^斗）.06-1、(^-2、(^-3表示661過表達的^種代表性轉基因株系。 化-G)值W平均值±S.D.表示化和F中n = 20，G中n = 5)。*沖<0.01(t檢驗）。
[0061] 圖7示出了表型BGl-RNAi植物(Ri)D(A和B).示出了野生型(WT)和BGl-RNAi植物的 整體形態。60天齡(A)，比例尺，10畑1。100天齡(B).比例尺，10畑1。（C)野生型和BGl-RNAi植物 的穗長對比。比例尺，5cm。（D).示出了野生型和BGl-RNAi植物的谷物顆粒形態。比例尺， 5mm。化)野生型和BG1 -RNAi植物中BGImRNA的相對表達水平。數據得自Ξ次獨立的平行測 定。（F).野生型和BGl-RNAi植物的每1000粒重量的對比。值W平均值±S.D.表示。（n = 5)。* P<0.05，*沖<0.01 (t檢驗）。(A-F). Ri-1、Ri-2表示BGl-RNAi植物的兩個代表性轉基因株系。
[0062] 圖8表明BG1主要集中于質膜。（A).水稻根部的共聚焦顯微照片示出了祀向BG1的 質膜。示出了使用pCambia 35S: :eGFP(上方面板)和pCambia 35S: :BGl-eGFP(下方面板)質 粒轉化的水稻。比例尺，50yM"DIC指示微分干設對比度，eGFP指示蛋白質的增強的綠色巧 光，合并指示eGFP和DIC的合并。（B).幼苗蛋白質提取物中的BG1的免疫印跡分析。(a).分離 7天齡幼苗中的微粒體(P)和可溶(S)片段。（b).雙相膜分離的片段，質膜(P)和其他膜(0)。 使用陽PC(憐酸締醇式丙酬酸簇化酶)作為細胞溶質對照物，使用LHCII和水通道蛋白PIP2; 1作為其他膜和質膜對照物。
[0063] 圖9顯示BG1為生長素應答基因。不同植物激素處理下BG1的相對表達水平。（B)響 應于1 ΟμΜ IAA處理，BG1隨時間的變化。（C)放線菌酬導致BG1的表達水平提高。（D)BG1針對 不同生長素化合物的響應。（A-D)數據得自Ξ次獨立的平行測定。誤差線代表平均值±SD(n = 3KE)BG1基因促進正在伸長的葉銷中的生長素誘導的生長。
[0064] 圖10顯示Bgl-D具有增強的極性生長素傳輸(PAT)。
[0065] 野生型、Bgl-D和BGl-RNAi (化2)植物在黑暗中生長的胚芽銷中PAT的對比。誤差線 代表平均值±SD(n = 5)。星號表示由學生t檢驗確定的差異的意義:**0.001<P<0.01。
[0066] 圖11示出了WT和Bgl-D中參與細胞周期和細胞擴張的基因的表達水平。（A)Bgl-D 中參與細胞周期G1期至S期的基因有所上調。（B)Bgl-D中參與細胞擴張的擴張蛋白基因有 所上調。誤差線代表平均值±SD(n = 3)。
[0067]圖12示出了由其天然啟動子過表達BG1的轉基因水稻植物中提高的谷物顆粒產 量。（A).野生型(WT)、0E-5和0E-7轉基因植物的總體形態。比例尺，20畑1。（8).野生型和轉基 因植物的谷物顆粒形態。比例尺，5皿。（〇.野生型和轉基因植物中收獲的每棵植株的總穗 數對比。比例尺，5cm"(D和E).野生型和轉基因植物的每1000粒重量(D)和每棵植株的產量 化)對比。（A-E).0E-5、0E-7表示由BG1天然啟動子驅動的BG1過表達的兩個代表性轉基因株 系。（D-E)值W平均值±S.D.表示(D中n=10，G中n = 25)〇*0.01 <P<0.05，**0.001 <P<0.01 (學生t檢驗）。
[006引圖13示出了Bgl-D幼苗的加速生長。（A)野生型和Bgl-D植株的7天齡幼苗。比例尺， 2cm。（B)種子發芽后一周內野生型和Bgl-D植株的植株高度對比。（C)野生型和Bgl-D植株的 7天齡幼苗的葉銷長度對比。數據W平均值±S.E.表示(n = 20)。
[00例圖14示出了Bgl-D穎殼中細胞長度增大。(A)穎殼的縱剖面的近距離視圖。比例尺， 50皿。（B)野生型和Bgl-D植株中內釋和外釋細胞層的細胞長度對比。數據W平均值±SE表 示(n = 15)。用學生t檢驗生成P值。**0.001 <P<0.01。
[0070] 圖15表明Bgl-D具有提高的巧粒灌漿速率。（A)WT和Bgl-D受精后胚乳鮮重對比。 (B)WT和Bgl-D受精后胚乳干重對比。數據W平均值±SE表示(n = 40)。
[0071] 圖16示出了水稻和擬南芥屬中BG1的系統發育和氨基酸序列分析。（A)BGl的系統 發育關系。（8化61的序列比對（569 10顯:4、沈〇10顯:5、56〇10^:7、569 10^:10或 SEQ ID NO: 1，和該順序的SEQ ID NO: 11)。保守氨基酸W黑色和灰色色調高亮顯示:具有黑 色背景的白色字母(100%同一性），具有灰色背景的白色字母(80%同一性），具有灰色背景 的黑色字母(60%同一性）。另外參見本文所公開的總體同一性(表2)和總體相似性(表3)。
[0072] 圖17表明OsBGl的過表達導致擬南芥屬的器官尺寸增大。(A)過表達OsBGl的5天齡 幼苗的伸長的下胚軸(B-D)OsBGl促進葉尺寸(B)、莖長(C)和種子尺寸(D)的增大。3#和50# 表示由35S啟動子驅動的擬南芥屬中OsBGl過表達的兩個代表性轉基因株系。
[0073] 圖18顯示BG1的激活導致極性生長素傳輸(PAT)提高(A)用Ο.ΙμΜ NAA處理的7天齡 幼苗的表型。（B)WT和Bgl-D植株的根長度對比。數據W平均值±SE表示(η = 20)。用學生t檢 驗生成P值。**〇. 001 < P<〇. 01。
[0074] 圖19表明BG1的激活導致生物量增加。用成熟器官的干重計算生物量。0E-U0E-2 和0E-3表示Ξ個獨立的轉基因株系。Ri-1和Ri-2表示BGl