3)。最重要的是，LCA的L2^和R374的 偵纖之間的距離估計為7.2A(圖4A)，LC/B的I22哺R3?的側鏈之間的距離為7.9A(圖4B)。 當L2^突變成為異亮氨酸(。3叫）時，LC/T的I23哺R374側鏈之間的距離為8.3 A (圖4C)，比原 型LC/T(WT-LC/T)的L2^和R374的側鏈距離7.2 A為大（圖4A)。運些數據進一步確認識別 VAMP2的ΡΓ和P2 '位點的效率取決于LC/B和LC/T其Sr和S2 ' 口袋之間的距離。Sr和S2 ' 口 袋之間更廣闊的空間有利容納VAMP2的ΡΓ位點殘基F7哺P2'位點殘基E78進入運兩個口袋。 表3 LC/T比i68E，L23°I]晶體參數衍射數據
LC/T、LC/B及其衍生物裂解內源性VAMP2的活性
[0076] 為了測試LC/T衍生物裂解神經細胞中天然底物VAMP2的活性，本實施例將各種LC/ T衍生物與取自Neuro2A的細胞裂解物一同溫育。如圖5A所示，LC/T[k168E，L23叫]裂解 Neuro2A細胞的內源性VAMP2的活性較原型LC/T(Wt-LC/T)的活性高。相近地，如圖5B所示， LC/B [ S2> ]裂解內源性VAMP2的活性亦較原型LC/B (Wt-LC/B)的活性高。
[0077] 如圖5A和5B的直方圖所示，LC/T及LC/T[k168E，L23叫]裂解內源性VAMP2的活性比 LC/B及LC/B[S201P]的更低，即使LC/T[k168E，L23叫]裂解重組VAMP2的活性比原型LC/B(Wt- LC/B)的稍高。神經元復雜的識別VAMP2機制或可解釋在此觀察的現象。在神經元中，VAMP2 與SNAP25和突觸融合蛋白la(syntaxin la)形式SNARE復合物。因此，除了 VAMP2相對LC/B和 LC/T的可及性外，其他因素亦可能影響毒素裂解天然VAMP2的效率。先前有關LC/A的研究發 現，除了底物識別區域外，LC/A亦在SNARE復合物W外的其他位點與SNAP25產生相互作用W 取得與SNAP25的初始接觸(45)。運將需要進一步的研究W找出位于SNARE復合物中的VAMP2 是否對LC/B和LC/T有不同的可及性。
[007引總括而言，運些數據表明LC/B比LC/T對天然VAMP2底物有更高的裂解活性，意味著 LC/B比LC/T更合適于在人類治療中使用。 討論
[0079] 血清型A輕鏈化C/A)的活性位點殘基的突變[k165L]，可提高底物水解4倍(44)。此 夕hS4 口袋突變[r188M]，可提高LC/T底物水解大約5倍(38)。本發明提供LC/B和LC/T的比較 研究并展示改造梭菌屬神經毒素輕鏈W提高毒素活性的可能性。
[0080] 本發明發現LC/T的S1 口袋的賴氨酸化iss)改變為谷氨酸化iss)可提高裂解VAMP2的 速率至與LC/B相若的水平。 優化LC/T底物識別口袋
[0081] 本發明發現，Sr 口袋對LC/B和LC/T兩種毒素的催化活性最為重要。LC/T的亮氨 酸-230化2^)的側鏈比LC/B的異亮氨酸-227(1227)大，因此不利容納位于VAMP2P1'和P2'位 點的殘基，并顯著地影響其催化活性（圖3-4)。突變體LC/T[。3叫]比原型LC/T(Wt-LC/T)具 有高約25倍的催化活性(表2)。
[0082] 本發明的發現說明肉毒桿菌神經毒素各個口袋在識別VAMP2上有密切的關系。例 如，未被優化的sr 口袋能影響S2' 口袋識別VAMP2。突變體?χ/τα2^1]具有高約25倍的催化 活性，而雙突變體LC/T比16?，]則具有高約100倍的催化活性(表2)。 優化LC/B的sr和S1底物識別口袋
[0083] LC/B的天然殘基異亮氨酸-227(1227)有利于裂解VAMP2。然而，LC/B的S1 口袋中的 天然絲氨酸-20USW1)似乎比LC/T中相應的脯氨酸殘基(pws)較不合適。本發明發現，LC/B [S2°i門突變可W提高LC/B的活性多于10倍(表1)。 比較LC/B和LC/T對重組VAMP2和天然VAMP2的活性
[0084] 本發明發現，LC/T[L23叫]及LC/T比i68E，L 23叫]裂解重組VAMP2的活性比原型毒素的 更高(表2)。本研究還發現，LC/T比i68E，L23叫]裂解Neuro2A細胞中原有的VAMP2的活性比原 型毒素更高（圖5A)。本發明更具活性的LC/T衍生物可W作為更有效的工具W研究中央神經 元的胞吐作用機制。
[0085] 本發明顯示LC/B[SW1門裂解重組VAMP2的活性比原型毒素的活性高于10倍(表1)， 對裂解化uro2A中原有的VAMP2亦具有更高的活性（圖5B)。本發明所述LC/B衍生物可W代替 現時在各種治療、化妝品或其它應用中使用的LC/B蛋白，或發展成為新穎療法^盡量減化 BoNT的免疫耐藥性。 參考： 1. Montecucco，C.，and Schiavo，G.(1994)Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins,Mol Microbiol 13,1-8. 2. Davletov,B.,Bajohrs,M.,and Binz,T.(2005)Beyond BOTOX:advantages and limitations of individual botulinum neurotoxins,Trends Neurosci 28,446-452. 3. Montecucco,C.,and Schiavo,G.(1993)Tetanus and botulism neurotoxins :a new group of zinc proteases,Trends Biochem Sci 18,324-327. 4. Brunger,A.T.(2005)Structure and function of SNA民E and SNARE-interacting proteins，Q 民ev Biophys 38,1-47. 5.Schiavo，G.，Benfenati，F.，Poulain，B.，民ossetto,0.，Polverino de Laureto，P.， DasGupta，B.民.，and Montecucco,C.(1992)Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin， Na化re 359,832-835. 6.Schiavo,G.，Malizio，C.，Trimble，W.S.，Polverino de Laureto，P.，Milan，G.， Sugiyama,H., Johnson ,E. A.,and Montecucco，C.(1994)Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond，J Biol Chem 269， 20213-20216. 7.Schiavo，G.，民ossetto,0.，Benfenati，F.，Poulain，B.，and Montecucco，C.(1994) Tetanus and botulinum neurotoxins are zinc proteases specific for components of the neuroexocytosis apparatus，Ann N Y Acad Sci 710,65-75. 8. Glogau,民.G.(2002)民eview of the use of botulinum toxin for hyperhidrosis andcosmetic purposes,Clin J Pain 18,8191-197. 9. Atassi,M.Z.(2004)Basic immunological aspects of botulinum toxin ^erapy，MovDisordl9Suppl8，S68-84. 10. Atassi，M.Z.，and Oshima，M.(1999)Structure，activity，and immune(T and Bcell)recognition of botulinum neurotoxins，Crit 民ev Immunol 19,219-260. 11. Cheng，C.M.，Qien，J.S.，and Patel，R.P.(2006)Unlabeled uses of botulinum toxins:a review,part 2，Am J Health Syst Pharm 63,225-232. 12. Ascher，B.，and 民ossi，B.(2004)[Botulinum toxin and wrinkles :few side effects andeffective combining procedures with other treatments]，Ann Chir Plast Es化et 49,537-552. IS.Bell，K.民.，and Williams，F.(2003)Use of botulinum toxin type A and type B forspasticity in upper and lower limbs,Phys Med 民ehabil Clin N Am 14,821- 835. 14. Benedetto,A.V.(2004)Commentary:Botulinum toxin in clinical medicine: part II，Cl in Dermatol 22,1-2. 15. Mahajan，S.T.，and Brubaker，L.(2007)Botulinum toxin : from life- threateningdisease to novel medical therapy，Am J Obstet Gynecol 196,7-15. 16. Mahant，N.，Clouston，P.D.，and Lorentz, I.T.(2000)The current use of botulinum toxin,J Clin Neurosci 7,389-394. 17. Thant，Z.S.，and Tan,E.K.(2003)Emerging therapeutic applications of botulinumtoxin，Med Sci Monit 9，RA40-48. IS.Figgitt，D.P.，and Noble，S.(2002)Botulinum toxin B:a review of its therapeuticpotential in the management of cervical dystonia,Drugs 62,705-722. 19. Brashear,A.(2001)Botulinum toxin type B:a new injectable treatment for cervicaldystonia,Expert Opin Investig Drugs 10,2191-2199. 20. Goschel，H. 'Wohlfai^tli'K· 'Frevei^t，J.，Dengler，R.，and Bigalke，H. (1997) Botulinum Atoxin therapy:neutralizing and nonneutralizing antibodies -- therapeuticconsequences，Exp Neurol 147,96-102. 21. Dolimbek，B.Z.，Jankovic,J.，and Atassi，M.Z.(2002)Cross reaction of tetanus andbotulinum neurotoxins A and B and the boosting effect of botulinum neurotoxins Aand B on a primary anti-tetanus antibody response, Immunol Invest 31,247-262. 22. Jankovic，J.，Vuong，K.D.，and Ahsan，J.(2003)Comparison of efficacy andimmunogenicity of original versus current botulinum toxin in cervical dystonia,Neurology 60,1186-1188. 23