新型多肽的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及共價結合至分子支架的多膚，其中兩個或更多個膚環在支架的附著點 之間相對。特別地，本發明描述了特異于人和大鼠蛋白酶血漿激膚釋放酶的并且在一個或 兩個膚環中存在修飾W增強效能和/或蛋白酶抗性的膚。
【背景技術】
[0002] 環膚能夠W高親和性和祀標特異性的方式結合蛋白祀標，并且因此是用于治療開 發的有吸引力的分子類型。實際上，數個環膚已經成功用于臨床，例如，如抗菌膚萬古霉素， 免疫抑制藥物環抱霉素或抗癌藥物奧曲膚(octreotide) (Driggers等人（2008) Rev Drug Discov 7(7) ,608-24)。良好的結合特性來自膚和祀標之間形成的相對大的相互作用 表面，W及降低的環狀結構構象柔性。典型地，大環結合數百平方埃的表面，例如，環膚 CXCR4括抗劑CVX15C4孤 A2;Wu等人（2007)，Science 330,1066-71 )、結合整合素 aVb3的具 有Arg-Gly-Asp基序的環膚(355 A2) (Xiong等人(2002), Science 296(5565), 151-5)、或結 合尿激酶型纖溶酶原激活物的環膚抑制劑upain-l(603 A2;Zhao等人(2007)J Struct Biol 160(1)，1-10)。
[0003] 由于其環狀構型，大環膚比線性膚柔性低，導致了在結合祀標時賭損失較少，且得 到了較高的結合親和性。降低的柔性還導致鎖定祀標特異性構象，與線性膚相比增加了結 合特異性。該效果已經被基質金屬蛋白酶8(MMP-8)有效的選擇性抑制劑例證了，其中當其 環打開時，失去了對其它MMP的選擇性（化ern巧等人（1998)，J Med畑em 41(11) ,1749- 51)。通過大環化實現的有利的結合特性，甚至在具有一個W上膚環的多環膚中更顯著，例 如，在萬古霉素、乳酸鏈球菌膚或放線菌素中。
[0004] 先前不同的研究小組將帶有半脫氨酸殘基的多膚連接至合成的分子結構上化emp 和McNamara(1985) ,J.0rg.Qiem;Timmerman等人（2005) ,QiemBioQiem) sMeloen和同事使用 Ξ(漠甲基)苯和相關分子將多個膚環快速且定量地環化至合成的支架上，用于蛋白表面的 結構化模擬(Timmerman等人(2005),化emBioChem)。生成候選藥物化合物的方法公開于W0 2004/077062和W0 2006/078161中，其中通過將含有半脫氨酸的多膚連接至例如Ξ(漠甲 基)苯的分子支架生成所述化合物。
[0005] 已開發了基于隧菌體展示的組合方法，用于產生和篩選感興趣的祀標的雙環膚的 大文庫化einis等人（2009)，化t Chem Biol 5(7)，502-7和￥02009/098450)。簡言之，含^ 個半脫氨酸殘基和兩個區域的六個隨機氨基酸(切s-(Xaa)6-切s-(Xaa)6-切sKSEQ ID NO: 97)的線性膚組合文庫在隧菌體上展示，并通過半脫氨酸側鏈共價連接至小分子(Ξ(漠甲 基)苯)進行環化。在對人蛋白酶組織蛋白酶G和血漿激膚釋放酶(ΡΚ)的親和性選擇中分離 的雙環膚證實為納摩爾級的抑制常數。W0 2013/050615和W0 2013/050616進一步公開了特 異于人血漿激膚釋放酶的雙環膚配體。
【發明內容】
[0006] 根據本發明的第一方面，提供了一種特異于血漿激膚釋放酶的膚配體，其包含多 膚，所述多膚包含被至少兩個環序列分隔的至少Ξ個半脫氨酸殘基，W及分子支架，所述分 子支架與多膚的半脫氨酸殘基形成共價鍵，從而在分子支架上形成至少兩個多膚環，其中 所述膚配體包含選自W下任意的膚序列：
[0007] (a)-CrN-X-W-N-P-W-Cii-〇/U-X-X-X-〇/J-X-Ciii-(沈Q ID N0:1);
[000引（b)-CrB-N-J-W-N-P-Cii-XA-0-X-X-X-Ciii-(WQIDN0:2);
[0009] (c)-CrQ-K-F-E-S-R-Cii-X-X-X-X-X-X-Ciii-(沈Q ID N0:3);
[0010] (d)-CrPA-S-D-TA-Cii-Y-R-R-M-P-P-Ciii-(WQIDN0:4);
[0011] (6)-。斗-￥斗斗-3-。廣乂寸-乂-乂-乂-紅廣（沈9 10備：5);和
[0012] (f)-Cr(N)a-U-J-P-J-R-Ci廣V-Y-Y-P-D-I-Cii廣（沈Q ID N0:6);
[0013] 或其經修飾的衍生物，或藥學可接受的鹽；
[0014] 其中；
[0015] Ci、Cii和Ciii分別代表第一、第二和第Ξ半脫氨酸殘基；
[0016] 下標V代表選自0或1的整數；
[0017] X代表任意氨基酸殘基；
[001引0代表非極性的脂肪族氨基酸殘基，選自6、4、1、1^、？和￥;
[0019] J代表非極性的芳香族氨基酸殘基，選自F、W和Y;
[0020] U代表極性的不帶電的氨基酸殘基，選自N、C、Q、M、S和T;W及
[0021] B代表極性的帶正電的氨基酸殘基，選自R、H和K。
[0022] 根據如文中實施例中描述的生物選擇，鑒定本發明的新的結合激膚釋放酶的雙環 膚配體。在生物選擇期間，在人和大鼠激膚釋放酶間轉換祀標誘巧，鑒定具有物種間良好的 交叉反應性的前導序列。為增強形成雙環膚前導物的能力，在分子上引入增溶修飾，并且大 鼠藥代動力學分析顯示在體內序列具有高代謝穩定性。
[0023] 根據本發明的其它方面，提供了一種藥物組合物，其包含如文中定義的膚配體，所 述膚配體與一種或更多種藥學可接受的賦形劑組合。
[0024] 根據本發明的其它方面，提供了一種如文中定義的膚配體在預防、抑制或治療炎 癥狀態、變應性超敏反應、癌癥、細菌或病毒感染和自體免疫性疾病中的用途。
【附圖說明】
[0025] 圖1:相對于交叉反應性的新型結合激膚釋放酶的雙環前導而言，06-34-18對照的 比較性大鼠血漿穩定性。
[0026] 圖2:相對于交叉反應性的新型結合激膚釋放酶的雙環前導而言，06-34-18對照的 比較性人血漿穩定性。
[0027] 圖3:衍生物06-550在人(A)和大鼠（B)血漿中的比較性穩定性。在0(高）、21(中）和 46 (低)小時取樣血漿和膚的混合物。膚的母體峰在2481.9MH+。隨著46小時的時間進程觀察 到很少的降解，母體峰保持高的相對豐度。
[002引圖4:在大鼠中兩個選擇的膚的體內藥代動力學譜。特別地，衍生物06-259-02在大 鼠循環中顯示顯著的穩定性，其清除主要通過腎濾過驅動。
[0029]圖5:在兔的玻璃體內注射兩種選擇的膚后體內藥代動力學分析。包括衍生物06- 550的兩種膚從玻璃狀液中被緩慢地清除，具有20-30小時的清除半衰期。
[0030] 圖6:兩種選擇的膚對角叉菜膠誘導的足腫脹的作用。在所有時間點，包括衍生物 06-259-02的兩種膚均抑制由角叉菜膠誘導的足腫脹。
【具體實施方式】
[0031] 除非另有定義，所有用于文中的技術和科學術語具有與本領域技術人員通常理解 的相同含義，如膚化學領域、細胞培養和隧菌體展示領域、核酸化學和生物化學領域。用于 分子生物學、遺傳學和生物化學方法的標準技術(參見Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第Ξ片反，2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring 化;rbo;r,NY;Ausubel等人，Sho;rt Protocols in Molecular Biology(1999)第四 版，John Wi 1 ey&Sons，Inc.)引入文中作參考。
[00創膚配體
[0033] 如文中所指的膚配體，指與分子支架共價連接的膚。典型地，該膚包含兩個或更多 個能夠與支架形成共價鍵的反應基團（即半脫氨酸殘基），W及在所述反應基團之間相對 (subtended)的序列，其被稱為環序列，因為當膚和支架結合時，其形成環。在本情況中，膚 包含至少Ξ個半脫氨酸殘基(文中指Cl、Cii和Ciii )，并在支架上形成至少兩個環。
[0034] 在一個實施方案中，所述膚配體包含式(a)的序列。如實施例1和表2和表4中描述 的，式(a)的一致性序列含有來自初始前導雙環膚06-259的基序，W及通過初始前導物的親 和性成熟鑒定的每個最有前景的膚序列的基序。
[0035] 在其它的實施方案中，式(a)的膚包含選自-C廣N-X-W-N-P-W-Cii-0/U-X-X-X-O-X- 。1廣(沈9 10^:7)的序列。
[0036] 在另一個實施方案中，式(a)的膚包含選自-Ci-N-T/H/Y-W-N-P-W-Cii-G/S/P-A/V/ W/D/S-D/E/V/T/P-A/G/P/I/R/D-G/P/Y/I-F/I/L/V/R/G/D-Ciii-(SEQ ID NO:8)的序列。
[0037] 在另一個實施方案中，式(a)的膚包含選自-Ci-N-T/H/Y-W-N-P-W-Cii-G/S/P-A/V/ 胖-0作/￥-4/6作-6作斗/1/1/￥-。1廣(569 10^:9)的序列。
[0038] 在另一個實施方案中，式(a)的膚包含選自W下的序列：
[0039] -C廣N-T-W-N-P-W-Cii-G-W-V-G-G-F-Ciii-(06-259K沈Q ID N0:10);
[0040] -Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-V-E-P-P-V-Ciii-(06-259-01)(SEQ ID NO: 11)；
[0041] -Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii-(06-259-02)(SEQ ID NO: 12)；
[0042] -C廣N-H-W-N-P-W-Ci廣S-A-D-P-P-I-Cii廣（06-259-03)(沈Q ID N0:13);
[0043] -Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii-(06-259-04)(SEQ ID NO: 14)；
[0044] -Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-R-Ciii-(06-259-Fl)(SEQ ID NO: 15)；
[0045] -Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-P-A-D-I-P-V-Ciii-(06-259-E2)(SEQ ID NO: 16)；
[0046] -Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-D-D-P-Y-I-Ciii-(06-259-H3)(SEQ ID NO: 17)；
[0047] -CrN-H-W-N-P-W-Cii-S-S-D-P-P-V-Ciii-(06-259-H4)(沈Q ID N0:18);
[004引-C廣N-Y-W-N-P-W-Cii-S-D-T-R-I-G-Ciii-(06-259-A6)(SEQIDN0:19);和
[0049] -C廣N-T-W-N-P-W-Cii-S-W-P-D-I-D-Ciii-(06-259-F2)(沈Q ID N0:20)。
[0050] 在仍然更進一步的實施方案中，式(a)的膚包含選自W下的序列：
[0051] -Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-V-E-P-P-V-Ciii-(06-259-01)(SEQ ID NO: 11)；
[0052] -Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii-(06-259-02)(SEQ ID NO: 12)；
[0053] -CrN-H-W-N-P-W-CirS-A-D-P-P-I-Ciir(06-259-03)(WQIDN0:13);^n
[0化4] -CrN-Y-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-PA-Ciii-(06-259-04)(SEQ ID N0:14)。
[0055] 根據親和性成熟，該實施方案中的膚被鑒定為最有效的候選物之一(參見實施例1 和表4)。此外，該實施方案的每個膚被鑒定證實是高效的，并且在大鼠和人激膚釋放酶間具 有良好的交叉反應性(參見表5)。
[0056] 在仍然更進一步的實施方案中，式(a)的膚包含選自-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D- A-P-レCiii-(06-259-02)(SEQIDN0:12)的序列。該實施方案的膚被鑒定為式(a)的膚配體 家族中最有效、最具交叉反應性的和最穩定性的成員（參見實施例1和2)。例如，正如長達10 天的檢測窗口所判斷的，使用文中描述的方法#1初始篩選表明06-259-02相比余下大部分 的雙環前導物更為穩定(數據未顯示）。此外，離體穩定性還在體內、特別是在大鼠中是可重 復的，正如清除W及與已知的腎小球濾過率的比較所判斷的，膚的代謝幾乎是不存在的(實 施例4)。
[0057] 在一個實施方案中，所述膚配體包含式(b)的序列。如實施例1和表2和表3中描述 的，式(b)的一致性序列含有來自初始前導雙環膚06-254和06-255的基序，W及通過初始前 導物06-254的親和性成熟鑒定的每個最有前景的膚序列的基序。
[005引在另一實施方案中，式(b)的膚包含選自-Ci-K/R-N-Y-W-N-P-Cii-D/T/GA-I/V/L- E/M/N/P/T/Q/S/Y/G/D/W/R/H/A-D/G/I/T/A/S/P/V-P/S/T/A/K/G/H/F/Q/D/L/I/M/R/Y- Ciii-(沈Q ID N0:21)的序列。
[0059] 在又一個實施方案中，式(b)的膚包含選自-Ci-K/R-N-Y-W-N-P-Cii-D/T-kl/V-E/ 1/^作/1'-0/6/1/1'斗/5/1'-。1廣(569 10^:22)的序列。
[0060] 在另一個實施方案中，式(b)的膚包含選自W下的序列：
[0061] -C廣K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-T-I-S-Ciii-(06-254)(沈Q ID N0:23);
[0062] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-E-T-T-Ciii-(06-254-01)(SEQ ID N0:24)；
[0063] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-G-P-Ciii-(06-254-02)(SEQ ID NO:25)；
[0064] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-M-D-T-Ciii-(06-254-03)(SEQ ID NO:26)；
[00化]-CH(-N-Y-W-N-P-Cii-DA-I-Q-D-A-Ciii-(06-254-F4)(SEQ ID N0:27);
[0066] -CrK-N-Y-W-N-P-Ci廣D-L-I-S-I-K-Cii廣（06-254-B3K沈Q ID N0:28);
[0067] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-T-G-Ciii-(06-254-G3)(SEQ ID NO:29)；
[006引-CH(-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-Q-I-H-Ciii-(06-254-H4)(沈Q ID N0:30);
[0069] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-G-I-T-Ciii-(06-254-G2)(SEQ ID N0:31)；
[0070] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-D-T-F-Ciii-(06-254-A4)(SEQ ID NO:32)；
[0071] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-E-A-Q-Ciii-(06-254-G4)(SEQ ID NO:33)；
[0072] -Ci-K-N-F-W-N-P-Cii-D-L-I-P-I-S-Ciii-(06-254-D3)(SEQ ID N0:34)；
[0073] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-W-T-D-Ciii-(06-254-E2)(SEQ ID NO:35)；
[0074] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-D-L-Ciii-(06-254-F5)(SEQ ID NO:36)；
[00巧]-CrK-N-Y-W-N-P-Ci廣D-L-L-E-S-T-Cii廣（06-254-E5)(SEQ ID N0:37);
[0076] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-R-P-P-Ciii-(06-254-Dl)(SEQ ID N0:38)；
[0077] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-G-I-A-Ciii-(06-254-B9)(SEQ ID NO:39)；
[007引-CH(-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-H-D-I-Ciii-(06-254-E3)(SEQ ID N0:40);
[0079] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-D-M-Ciii-(06-254-D6)(SEQ ID N0:41)；
[0080] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-A-D-L-Ciii-(06-254-H3)(SEQ ID N0:42)；
[0081 ] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-H-V-R-Ciii-(06-254-A7)(SEQ ID N0:43)；
[0082] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-A-P-Y-Ciii-(06-254-Cl)(SEQ ID N0:44)；
[0083] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-G-L-V-Y-S-T-Ciii-(06-254-E6)(SEQ ID N0:45)；
[0084] -C廣K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-P-D-L-Ciii-(06-254-Bl)(SEQIDN0:46);和 [00 化]-CrR-N-Y-W-N-P-CirT-L-I-N-I-T-Ciir(06-255KWQIDN0:47)。
[0086] 在仍然更進一步的實施方案中，式(b)的膚包含選自W下的序列：
[0087] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-E-T-T-Ciii-(06-254-01)(SEQ ID N0:24)；
[0088] -Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-G-P-Ciii-(06-254-02)(SEQ ID NO:25)；
[0089] -C廣K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-M-D-T-Ciii-(06-254-03)(SEQIDN0:26);和
[0090] -C廣R-N-Y-W-N-P-Cii-T-L-I-N-I-T-Ciii-(06-255K沈Q ID N0:47)。
[0091] 根據親和性成熟，該實施方案中的膚被鑒定為最有效的候選物(參見實施例1和表 3)。此外，該實施方案的每一個膚被鑒定證實具有高效能，并且在大鼠和人激膚釋放酶間具 有良好的交叉反應性(參見表5)。
[0092] 在仍然更進一步的實施方案中，式(b)的膚包含選自W下的序列：
[0093] -C廣K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-G-P-Ciii-(06-254-02)(SEQIDN0:25);和
[0094] -C廣R-N-Y-W-N-P-Cii-T-L-I-N-