1(：/1'、91(：/8和9￥41?2的定點突變根據文獻所描述的使用 QuikChange(Stratagene公司）來進行（30,31)。質粒被測序W確認突變成功及確保開放讀 序框（Open Reading Frame,ORFs)沒有其他突變。突變蛋白如前所述的步驟生產及純化 (30-33)。 測定LC/B和LC/T裂解VAMP2的線性速度和動力學常數
[0062] 線性速度的反應物（1化1)如前所述的步驟進行(30，31，33) dVAMP2蛋白（5μΜ)與帶 有不同LC/T、LC/B或其衍生物濃度的lOmMS徑甲基氨基甲燒及鹽酸溶液（TriS-HC1) (pH 7.6)及201111的氯化鋼(化(：1)置于37°(：溫育10分鐘。通過加入505斗466緩沖液停止反應，使 用SDS-PAGE分離VAMP2及其裂解產物。通過光密度測定VAMP2被裂解的數量。Km及kcat使用相 同的測定法測定，其中VAMP2濃度調整至1-300μΜΚ達至由LC/T及其衍生物進行大約10%裂 解。使用Michaelis-Menten方程(反應速度與底物濃度的關係)對實驗數據進行擬合，使用 GraphPad程序(圣地亞哥，加州）獲得動力學常數。進行至少五個獨立的實驗，W確定每個蛋 白的動力學常數。 補償性測定實驗
[0063] 根據文獻所描述的方法確定LC/T的補償性突變對裂解VAMP2及其變體VAMP2[Fn0] 的影響（31)。簡單地說，5μΜ的VAMP2或VAMP2變體與LC/T或其衍生物一起溫育。使用SDS- PAGE分離未裂解的VAMP2及裂解的VAMP2并將之量化。將反應中的原型LC/T或其衍生物的數 量與VAMP2裂解百分比制作關系圖表。然后計算裂解50%VAMP2或VAMP2突變體所需的IX濃 度化Cso)。 LC結晶和結構鑒定
[0064] LC/T 衍生物[k168e，l23Di ]經懸滴蒸氣擴散法結晶。LC/T 比 168E，L230I ] W7.5mg/ml 的濃度儲存在1 ΟπιΜΞ徑甲基氨基甲燒(TriS)及20mM氯化鋼化Cl) (pH 7.9) 的緩沖液中。每個懸滴含有化1的蛋白溶液和化1母液(250mM硝酸儀(Mg(N03)2)及15 % 聚乙二醇3350(PEG 3350))。在16°C下溫育4-5天直至晶體成熟。收集晶體并在添加有20% 甘油的母液中冷凍保護，用作收集數據。使用Rigaku MicroMaxTM-007HF X-射線衍射儀在 100K的溫度下收集數據并使用iMOSFLM處理數據(34)。該晶體的空間群屬于單斜組C222,晶 胞參數為a = 105.% A，b = 176.83 A，e = 57J6 A，并衍射至2.6 A。每個不對稱的單元中有 一個分子。WLC/T(PDB ID:1Z7H)作為同源性模型，采用CCP4i程式套件的PHAS邸模塊利用 分子置換方法得到LC/T比16化，。3叫]的結構（35)。隨后使用CCP4的REFMAC模塊的進行結構 修正(36)。利用WINC00T進行人手結構重建。最終所得的結構保藏在蛋白質數據庫(PDB)，編 號為4J1L。 利用重組LC/T、LC/B及其衍生物裂解源自化uro2A細胞的VAMP
[0065] W添加有10%新生小牛血清、1.4%碳酸氨鋼和0.5%青霉素-鏈霉素的MEM培養基 (minimum essential medium)，在37°C及5%二氧化碳下培養化u;ro2A細胞。收集融合細胞， 并在冰上用25號規格的針頭反復抽放20至30次W裂解細胞。裂解產物W2500rpm離屯、5分鐘 沉淀細胞核及完整的細胞，收集上清液進行實驗。細胞裂解物與不同數量的LC(反應物體積 為10μ1)在37°C溫育10分鐘后，加入等量的SDS-PAGE樣品緩沖液停止反應，并在100°C下將 混合物加熱10分鐘。使用針對VAMP2的抗體和針對肌動蛋白的抗體進行蛋白印跡(Western blot) W分析VAMP的裂解。 結果
[0066] BoNT血清型B和TeNT在同一個可切鍵切割VAMP2，但具有不同的底物水解效率，LC/ B的活性比LC/T高約20倍。在過往LC/B和LC/T識別VAMP2的研究中，發現兩種LC用來識別 VAMP2的活性位點有類似的布局。兩個LC系統的主要區別在于P2'-S2'底物的識別位點（33， 38)。VAMP2的P2 '位點的突變(E78改變為alanine，[E78A])，減少LC/B裂解約8倍，但減少LC/T 裂解約240倍，運表明VAMP2的E78在LC/B和LC/T的底物裂解有不同的作用(33)。
[0067] LC/B和LC/T的S2' 口袋的生化特性分析顯示，LC/B及LC/T的口袋分別由R37哺R374形成（圖1)。補償性突變實驗顯示LC/B的R3?直接與VAMP2的E78產生相互作用，但似乎沒有證 據顯示LC/T的R374與VAMP2的E78之間有相互作用(38)。運些研究數據促使本發明研究LC/B和 LC/T在VAMP2化78)的P2 '位點識別底物的不同機制。 優化LC/T和LC/B的Sr 口袋^增強其催化活性
[0068] 圖1示出LC/B及LC/T與底物VAMP2相互作用的活性位點。比較LC/B及LC/T的結構， 掲示兩個輕鏈的S2 ' 口袋是相似的，并包括一個精氨酸殘基化C/B為R3^，LCA為R374)，然而 其S1' 口袋是不同的。LC/B的S1' 口袋由尸95、￥2^、5201、。26及1 2"組成，而1〔/1'的51'口袋由 F"9、V2M、p2e5、L229、L 2w及L23l組成。當SΓ口袋殘基突變為丙氨酸，對LC/B底物水解沒有影 響，除了 I227A使ktat數值減少大約80倍，但沒有改變Km數值(38)。對于LC/T，Sr 口袋的殘基 突變沒有影響底物水解，除了1Χ/Τα2^Α]或1Χ/Τ[Ρ^5α]的突變使ktat數值減少大約30倍，但 不影響Km數值(38)。在Sr 口袋中的殘基，LC/T的pws與LC/B的S2°i結構排列一致，而LC/T的 L2^與LC/B的I227結構排列一致（圖1)"LC/B及LC/T的Sr 口袋的不同成分不僅可能引致不同 VAMP2的ΡΓ位點識別，還可能引致不同的P2'位點識別，并進一步影響LC/B及LC/T本身已經 不同的催化活性。
[00例將LC/B及LC/T的Sr 口袋中氨基酸殘基互換已進行突變。LC/T[pW5S]的突變使kcat 數值減少大約80倍，但沒有改變Km數值。LC/T[L2WI ]的突變使ksat數值提高大約20倍，但Km數 值相近(表1，圖2A)。上述數據表明，脯氨酸和異亮氨酸是形成LC/T的Sr 口袋的最佳殘基， 用于與VAMPP1位點的氨基酸F77進行相互作用。
[0070] 為了證實上述假設，對LC/B的sr 口袋的氨基酸殘基亦進行了互換。LC/B[I227L]的 突變使ktat數值減少大約590倍，但沒有改變Km數值。LC/B [ S^lp ]的突變使ktat數值提高大約 10倍，但沒有改變Km數值(表1，圖2B)。上述數據進一步證實，脯氨酸和異亮氨酸是構成LC/B 及LC/T的sr 口袋的最佳殘基，并意味著現時LC/B及LC/T的底物識別口袋還未被優化。優化 運些口袋可W改善毒素的催化活性。為了驗證改變LC/B及LC/T的sr 口袋并不會改變其底 物特異性，本實施例研究了上述四個突變體裂解VAMP2[F"D]的活性。VAMP2的F"是LC/B及 LC/T切鍵活動的關鍵氨基酸殘基，該殘基的突變可能會影響LC/B及LC/T的裂解活性。由于 上述LC/B及LC/T的突變體都不能裂解VAMP2[F"D]，意味著LC/B及LC/T的突變體經突變后其 VAMP2底物特異性沒有改變(圖2A-B)。 表1 LC/B和LC/T及其衍生物裂解VAMP2的動力學常數
ND:不確定，由于酶不活躍，W致不能確定動力學常數。 優化LC/T的sr 口袋能達至最佳的P2'位點識別
[0071] 由于sr及S2 ' 口袋接近，LC/B及LCA的sr 口袋的不同成分可能與LC/B及LCA的 S2' 口袋之間的不同特性有關聯。雖然LC/B及LC/T的S2' 口袋兩者都包括一個精氨酸殘基， 先前的研究指出，LC/B的R3?及VAMP的E7嘴直接的相互作用，而LC/T的R374與VAMP的E 78則沒 有直接的相互作用（38)。此外，當位于VAMP的P2'位點的E78突變為丙氨酸化78A)時，對LC/B 的裂解相比LC/T裂解的影響較小(38)。
[007^ 本發明改造 LC/TW優化其sr 口袋，創造了LC/T[L23叫]并測試其切割VAMP2E78R的 活性。如表2所示，裂解50 % VAMP2所需的LC/T濃度為約120nM化Cso)。可是，即使LC/T的濃度 高達36,000碰，1(：/1'仍不能裂解￥41?26呵。1〔/了[。3叫]裂解￥41?2的效率比原型1〔/1'(胖1- LC/T)高約24倍；雖然LC/T [。3叫]裂解VAMP2E78R的效率與Wt-LCA相近，LC/T [。3叫]裂解 VAMP2E78R的效率比原型LC/T(Wt-LC/T)高約360倍(表2)。上述數據顯示，優化LC/T的Sr 口 袋可W增加 LC/T對P2'位點由E78突變為R78的耐受性。LCA的Sr 口袋未被優化亦可能解釋 為何P2'位點E78突變對LC/T底物裂解的影響比LC/B底物裂解更大。先前的研究顯示，LC/B的 S2 ' 口袋殘基(R3?)和VAMP2形成鹽橋并產生相互作用，而LC/T的S2 ' 口袋殘基(R374)和VAMP2 之間沒有相互作用（38)。為了測試究竟LC/B和LC/T兩者不同的S2'-P2'相互作用是否由于 Sr 口袋的組成未被優化，本實施例測試了LC/T[L2Wi，R374E]切割VAMP2E 78R的效率。LC/T [。3叫，R374E]不能裂解VAMP2，但LC/T [。3叫，R374E ]能夠裂解VAMP2而且效率高于LC/T (表2)。 數據顯示，LC/T的Sr 口袋結構較不合適，不利于LC/T的R374和VAMP2的E78的直接相互作用。 表2 LC/T裂解VAMP2及VAMP2 E78R的補償性突變實驗結果
ECso指裂解50 % VAMP2或VAMP沈78R所需的LC蛋白濃度。 優化Sr及S1底物識別口袋進一步提高LC/T的活性
[0073] 先前的研究確定兩個殘基有助于提升LC/T的活性（38KS1 口袋殘基突變化C/T [k168E])，和S3 口袋殘基突變化C/T[R"8M])，被發現可提高LC/T的催化活性(38)。本實施例 將上述兩個突變加到1Χ/Τα2^Ι]中W測試運些突變的組合如何影響LC/T的活性。雙突變的 突變體LC/T比16?，L2^I ]的keat數值提高，但其Km數值沒有改變，顯示它比原型LC/T(Wt-LC) 裂解VAMP2的活性高約100倍(表1，圖24)。；重突變的突變體LC/T比i68E，L2Wi，R" 8M]剛未有 觀察到切割VAMP2的活性。運Ξ個殘基均位于LC/T的活性部位，同時突變Ξ個殘基可能影響 LC/T的正確構象因而喪失活性(表1)。 LC/T L2^側鏈的方向影響識別ΡΓ及P2'位點的優化
[0074] 異亮氨酸和亮氨酸是疏水氨基酸，很可能通過疏水相互作用與VAMP2F77產生相互 作用。然而，在LC/B和LC/T的情況下，我們發現LC/B和LC/T sr 口袋中的異亮氨酸的相互作 用較為顯著。運可能是由于該異亮氨酸殘基在口袋內具有不同的定向并有利于與VAMP2F77的相互作用。LC/B和LC/T sr 口袋的結構分析顯示LC/B的I227的定向比LC/T的L2^更平坦。 位于LC/T的亮氨酸較大，可能將VAMP2F"殘基向外推，從而限制了 R37哺VAMP2的E78之間的 相互作用。而LC/B的異亮氨酸的定向更平坦，可W提供最佳位置讓VAMP2的F77和E78嵌合到 LC/B的活性部位，因而有利于I2"-F"和R3?-e78的相互作用。
[0075] 本實施例解構了 LC/T[k168E，L2Wi]的晶體結構并將之與原型LC/T(WT-LC/T)的晶 體結構比較。圖3A顯示LC/T比16?，。3叫]結構中L23叫的化-Fc電子密度。LC/T比1 6?，L23叫]與 原型LC/T(WT-LC/T)兩者的結構可W-致地對齊，均方根差（Root Mean Square Deviation，RMSD)為0.150(即421個原子中有370個對齊），表示LC/T比16化，。3叫]的整體構 象與原型LC/T(WT-LC/T)相近。LC/T[k1s化，。3叫]亦與原型LC/B(WT-LC/B)的結構一致地對 齊，均方根差為0.750(即421個原子中有341個原子對齊）。分析結果顯示，LCA的亮氨酸突 變成異亮氨酸將Sr 口袋弄平至與LC/B相若的位置（圖