-RNAi的兩個代表性轉基因植株。 誤差線代表平均值±SD(n = 20)。
【具體實施方式】
[0075] 谷物顆粒尺寸是（例如水稻)顆粒產量的一個重要因素，其一直在接受選擇，因為 谷物是首選被馴化的。
[0076] -種生產種子的方法，所述方法包括：（a)將第一植物與第二植物進行雜交，其中 第一植物和第二植物中的至少一者包含重組DNA構建體，其中所述重組DNA構建體包含可操 作地連接至至少一個異源調控元件的多核巧酸，其中所述多核巧酸編碼多膚，所述多膚具 有與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27具有至少70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的氨基酸序列(基 于Clus化1 V或Clus化1 W比對方法，使用各自的默認參數）；W及(b)選擇步驟(a)的雜交的 種子，其中所述種子包含重組DNA構建體。當與不包含重組DNA構建體的對照植株進行比較 時，由所述種子生長出的植株可表現出至少一種選自W下的性狀:提高的氮脅迫耐受性、提 高的產量、增加的生物量和改變的根構造。多膚可在所述植物的至少一種組織中過表達，或 者在至少一種非生物脅迫條件下過表達，或兩者兼具。所述植物可選自：玉米、大豆、向日 葵、高梁、卡諾拉、小麥、首猜、棉花、水稻、大麥、小米、甘薦和柳枝稷。
[0077] -種生產植物的方法，該植物在至少一種選自W下的性狀上表現出提高：提高的 氮脅迫耐受性、提高的產量、增加的生物量和改變的根構造，其中所述方法包括用包含重組 DNA建構體的種子種植植物，其中所述重組DNA建構體包含可操作地連接至至少一個異源調 控元件的多核巧酸，其中所述多核巧酸編碼多膚，所述多膚具有與SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列（基于(：11131日1￥或(：1113化1￥比對 方法，使用各自的默認參數），其中當與不包含重組DNA建構體的對照植物進行比較時，所述 植物表現出至少一種選自W下的性狀：：提高的氮脅迫耐受性、提高的產量、增加的生物量 和改變的根構造。所述多膚可在所述植物的至少一種組織中過表達，或者在至少一種非生 物脅迫條件下過表達，或兩者兼具。所述植物可選自：玉米、大豆、向日葵、高梁、卡諾拉、小 麥、首猜、棉花、水稻、大麥、小米、甘薦和柳枝稷。
[0078] 除非另外指明，否則本公開的實施將采用植物學、微生物學、組織培養、分子生物 學、化學、生物化學和重組DNA技術的常規技術，運些技術處于本領域技能范圍內。運類技術 在文獻中有完整的解釋。參見例如，Langenheim and Thimann,(1982)Botany:Plant Biology and Its Relation to Human Affairs John Wiley(Langenheim和Thimann，1982 年，《植物學：植物生物學及其與人類事務的關系》，約翰威立出版社）；Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,vol.l,"Vasil,ed. (1984)(《細胞培養和植物體細胞遺 傳學》，第 1 卷，Vasil編輯，1984年）；Stanier，et al.，（1986)The Microbial World,5th ed. ,Prentice-化11(Stanier等人，1986年，《微生物界》，第5版，Prentice-化11出版社）； Dhringra and Sinclair,(1985)Basic Plant Pathology Methods,CRC Press(Dhringra 和Sinclair,1985年，《基本植物病理學方法》，CRC出版社）；Maniatis，et al. ,(1982) Molecular Cloning:A LaboratoiT Manual(Maniatis等人，1982年，《分子克隆實驗指 南》）；DNA Cloning，vols.I and 11，61〇￥6'，6(1.(1985)(《0論克隆》，第1卷和第11卷， Glover編輯，1985年）；Oligonucleotide Synthesis,Gait ,ed. (1984)(《寡核巧酸合成》， Gait編輯，1984年）；Nucleic Acid Hybridization,化mes and Higgins,eds. (1984)(《核 酸雜交》，化mes和Higgins編輯，1984年）和叢書Methods in Enzymology,Colowick and Kaplan,eds,Academic Press,Inc. ,San Diego,CA(《酶學方法》，Colowick和Kaplan編輯， 學術出版社，加州圣地亞哥）。
[0079] 所謂"擴增"意指構建核酸序列的多個拷貝或與該核酸序列互補的多個拷貝，該構 建是利用所述核酸序列中的至少一者作為模板進行的。擴增系統包括聚合酶鏈式反應 (PCR)系統、連接酶鏈式反應化CR)系統、基于核酸序列的擴增(安大略省米西索加市加拿大 基因公司（Cangene,Mississauga,Ontario))、Q-0復制酶系統、基于轉錄的擴增系統（TAS) 和鏈置換擴增（SDA)。參見例如Diagnostic Molecular Microbiology:P;rinciples and Applications,Persing,et al. ,eds. .American Society for Microbiology , Washington，DC( 1993)(《診斷分子和微生物學：原理和應用》，Arsing等人編輯，美國微生 物學會，華盛頓，1993年）。擴增的產物稱為擴增子。
[0080] 應當理解，本領域的技術人員將會知道，本公開不僅僅涵蓋特定的示例性序列。在 給定位點產生化學等同的氨基酸，但不影響編碼多膚的功能特性的核酸片段的變化是本領 域熟知的。例如，疏水氨基酸丙氨酸的密碼子可被編碼另一個疏水性較小的殘基諸如甘氨 酸，或疏水性較大的殘基諸如鄉氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的密碼子替換。類似地，還可預期 使一個帶負電的殘基替換為另一個，諸如天冬氨酸替換為谷氨酸，或一個帶正電的殘基替 換為另一個，諸如賴氨酸替換為精氨酸的變化產生功能等同的產物。還可預期使多膚分子 的N-端和C-端部分改變的核巧酸變化不會改變多膚的活性。每個所推薦的改變均在本領域 的常規技術內，正如確定編碼產物的生物活性的保留。
[0081] 本文所公開的蛋白質也可W是包含一種氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列包 含選自SEQ ID N0:1或其變體的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸的缺失、替換、插入和/ 或添加。替換可W是保守的，意指某氨基酸殘基被另一個具有類似物理和化學特性的殘基 取代。保守替換的非限制性例子包括含脂族基團的氨基酸殘基諸如lie、化l、Leu或Ala之間 的取代，W及極性殘基之間的取代，諸如Lys-Arg、Glu-Asp或Gln-Asn取代。
[0082] 來源于氨基酸缺失、替換、插入和/或添加的蛋白質可在編碼其野生型蛋白質的 DNA受到例如已知的定點誘變時制備（參見例如Nucleic Acid Research ,Vol. 10 ,No . 20, p.6487-6500,1982(《核酸研究》，第10卷，第20期，第6487-6500頁，1982年），該文獻全文據 此W引用方式并入）。如本文所用，術語"一個或多個氨基酸"旨在意指可通過定點誘變而缺 失、替換、插入和/或添加的氨基酸的可能數量。
[0083] 定點誘變可W例如如下使用與待突變的單鏈隧菌體DNA互補，不同的是具有特定 錯配(即，所需突變)的合成寡核巧酸引物來實現。也就是說，上述合成寡核巧酸用作引起互 補鏈通過隧菌體合成的引物，然后所得的雙鏈DNA用于轉化宿主細胞。將轉化細菌培養物置 于瓊脂上，從而允許隧菌斑從含隧菌體的單個細胞形成。因此，理論上，50%的新菌落包含 突變為單鏈的隧菌體，而其余50%具有原始序列。在允許與DNA雜交(該DNA與具有上述所需 突變的DNA完全相同），但不與具有原始鏈的DNA雜交的溫度下，允許所得的隧菌斑與通過激 酶處理標記的合成探針雜交。隨后，拾取與探針雜交的隧菌斑并培養W收集其DNA。
[0084] 允許生物活性膚(諸如酶）的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸的缺失、替換、插 入和/或添加，同時保持其活性的技術包括上述定點誘變，W及其他技術，諸如用誘變劑處 理基因的那些，W及其中基因選擇性裂解W移除、替換、插入或添加所選的一個或多個核巧 酸然后連接的那些。
[0085] 本文所公開的蛋白質也可W是由包含運樣的核巧酸序列的核酸編碼的蛋白質，所 述核巧酸序列包含選自編碼56〇10顯：1、56〇10^:4-569 10^:27的序列的核巧酸序 列中的一個或多個核巧酸的缺失、替換、插入和/或添加。核巧酸缺失、替換、插入和/或添加 可通過定點誘變或上述其他技術來實現。
[0086] 本文所公開的蛋白質也可W是由包含運樣的核巧酸序列的核酸編碼的蛋白質，所 述核巧酸序列能夠在嚴格條件下與選自編碼SEQIDN0:1、SEQIDN0:4-SEQIDN0:27的 序列的核巧酸序列的互補鏈雜交。
[0087] 術語"在嚴格條件下"意指兩個序列在中等或高度嚴格條件下雜交。更具體地講， 本領域的普通技術人員可W例如根據DNA的長度容易地確定中等嚴格條件。W下文獻列出 了分子克隆的基本條件：Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, third edition , chapters 6曰nd 7, Cold Spring Harbor Laboratory Press ,2001 (Sambrook等人，《分子克隆實驗指南》，第Ξ版，第6章和第7章，冷泉港實驗室出版社，2001 年），并且包括使用硝化纖維過濾器的預洗涂溶液5 X SSC、0.5%SDS、1. OmM邸TA(pH 8.0)， 約50%甲酯胺、2 X SSC至6 X SSC、約40-50°C的雜交條件(或其他類似雜交溶液，諸如Stark 溶液，約50%甲酯胺、約42°C) W及例如約40-60°C、0.5-6 X SSC、0.1 %SDS的洗涂條件。優選 地，中等嚴格條件包括在約50°C和6 X SSC下雜交(和洗涂）。本領域的技術人員也可W例如 根據DNA的長度容易地確定高度嚴格條件。
[0088] -般來講，此類條件包括與中等嚴格條件相比，在較高溫度和/或較低鹽濃度下雜 交和/或洗涂(諸如在約65°C，6 X SSC至0.2 X SSC，優選地6 X SSC，更優選地2 X SSC，最優選 地0.2 XSSC下雜交）。例如，高度嚴格條件可包括如上所定義的雜交，并且在大約65-68°C、 0.2 X SSC、0.1 % SDS下洗涂。在雜交和洗涂緩沖液中SSPE( 1 X SSPE為0.15M化Cl、lOmM 化H2P04和1.25mM邸TA，pH7.4)可代替SSCαxSSC為0.15M化α和15mM巧樣酸鋼）；雜交 完成后進行15分鐘的洗涂。
[0089] 使用商購獲得的雜交試劑盒也是可能的，其不使用放射性物質作為探針。具體例 子包括用E化直接標記和檢測系統進行雜交。嚴格條件包括例如使用包含在試劑盒中的雜 交緩沖液在42°C下雜交4小時，該緩沖液補充有5%(w/v)阻斷試劑和0.5M NaCl，并且在 0.4% SDS、0.5 X SSC中55°C下洗涂20分鐘兩次，在2 X SSC中室溫下洗涂5分鐘一次。
[0090] 就指定的核酸而言，所謂"編碼"或"編碼的"意指包含翻譯成指定蛋白質的信息。 編碼蛋白質的核酸可在該核酸的翻譯區內包含非翻譯序列(例如內含子），或可缺少運種居 間的非翻譯序列(例如，如在cDNA中）。據W編碼蛋白質的信息是通過使用密碼子來確定的。 通常，氨基酸序列由核酸利用"通用"遺傳密碼來編碼。然而，當利用運些生物體表達核酸 時，可使用諸如在某些植物、動物和真菌線粒體、細菌山羊支原體（My cop lasma capricolum) "amao , et al. , (1985)P;roc .化tl .Acad. Sci .USA 82 : 2306-9(Yamao等人， 1985年，《美國國家科學院院刊》，第82卷，第2306-2309頁））或纖毛蟲大核（ciliate Macronucleus)中存在的通用密碼的變體。
[0091] 當通過合成法制備或改變核酸時，可利用將在其中表達核酸的預期宿主的已知密 碼子偏好性。例如，盡管本公開的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種中都可表 達，但可對序列進行修飾W解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和GC含量偏 好性，因為運些偏好性已被證實不同（Murray,et al.,(1989)Nucleic Acids Res. 17:477- 98(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498頁），該文獻W引用方式并入本 文）。因而，用于特定氨基酸的玉米優選密碼子可來源于來自玉米的已知基因序列。關于來 自玉米植物的28種基因的玉米密碼子的用法在Murray等人（出處同上）的表4中列出。
[0092] 如本文所用，針對核酸的"異源"為起源于外來物種的核酸，或者，如果起源于相同 物種的話，則為通過蓄意的人為干預對其天然形式在組成和/或基因組基因座方面進行了 實質性修飾的核酸。異源的還可W表示相比于在基因組中的天然位置，特定核酸對于其在 基因組中的位置而言是外來的。例如，可操作地連接至異源結構基因的啟動子來自一個物 種，該物種不同于擁有該結構基因的物種，或者如果來自相同的物種，則對一者或二者由其 原始形式進行了實質性修飾。異源蛋白質可起源于外來物種，或者，如果起源于相同物種， 則通過蓄意的人為干預對其天然形式進行了實質性的修飾。
[0093] 所謂"宿主細胞"意指包含本公開的異源核酸序列、含有載體并支持該表達載體的 復制和/或表達的細胞。宿主細胞可W是原核細胞諸如大腸桿菌化.coli)，或真核細胞諸如 酵母，昆蟲、植物、兩棲動物或哺乳動物細胞。優選地，宿主細胞是單子葉植物細胞或雙子葉 植物細胞，包括但不限于玉米、高梁、向日葵、大豆、小麥、首猜、水稻、棉花、卡諾拉、大麥、小 米和番茄。特別優選的單子葉宿主細胞是玉米宿主細胞。
[0094] 術語"雜交復合物"包括設及由相互選擇性雜交的兩條單鏈核酸序列形成的雙鏈 核酸結構。
[0095] 在將核酸插入細胞中的語境中，術語"引入"意指"轉染"或"轉化"或"轉導"，并包 括設及將核酸并入真核或原核細胞中，其中該核酸可并入細胞的基因組（例如染色體、質 粒、質體或線粒體DNA)中，轉化成自主復制子或瞬時表達(例如，轉染的mRNA)。
[0096] 術語"分離的"指諸如核酸或蛋白質之類的物質，該物質實質上或基本上不含在其 天然存在的環境中發現的通常與其相伴隨或與其相互作用的組分。分離的物質任選包含未 發現在其天然環境中與其一起的物質。本文所定義的"分離的"核酸也稱為"異源"核酸。除 非另有規定，否則術語"硝酸鹽吸收相關的核酸"意指包含編碼全長或部分長度硝酸鹽吸收 相關的多膚的多核巧酸Γ硝酸鹽吸收相關的多核巧酸"）的核酸。
[0097] 如本文所用，"核酸"包括指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核巧酸或核糖核巧酸聚合 物，并且除非另外限制，否則涵蓋在W下方面具有天然核巧酸的基本性質的已知類似物:其 W與天然存在的核巧酸(例如膚核酸)相似的方式雜交至單鏈核酸。
[0098] 所謂"核酸文庫"意指分離的DNA或RNA分子的集合，其包含且基本上代表指定生物 體的基因組的整個被轉錄的部分。示例性的核酸文庫（諸如基因組文庫和cDNA文庫）的構 建，在諸如W下的標準分子生物學參考文獻中有教導：Berger and Kimmel,(1987)Guide To Molecular Cloning Techniques, from the series Methods in Enzymology, vol. 152 ,Academic Press, Inc. , San Diego ,CA(Berge;r和Kimmel，1987年，《分子克隆技術 指南》，來自《酶學方法》系列，第152卷，學術出版社，加利福尼亞州圣地亞哥）；Sambrook，et al. , (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2"*^ ed. ,vols. l-3(Sambrook 等人， 1989年，《分子克隆實驗指南》，第2版，第1-3卷）；W及Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,et al.,eds.Current Protocols ,a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.and John Wiley&Sons , Inc. (1994Supplement)(《現代分子 生物學實驗技術》，Ausubel等人編輯，《現代實驗技術》，格林出版社聯合公司W及約翰威立 父子公司的合資公司，1994年增補本）。
[0099] 本文所用的"可操作地連接"包括指第一序列（諸如啟動子)和第二序列之間的功 能連接，其中該啟動子序列引發和介導對應于該第二序列的DNA的轉錄。一般來講，可操作 地連接意指被連接的核酸序列是連續的，并且如果有必要連接兩個蛋白質編碼區的話，是 連續的且在相同的閱讀框內。
[0100] 本文所用的術語"植物"包括指整個植株、植物器官（例如葉、莖、根等）、種子和植 物細胞和它們的子代。如本文所用，植物細胞包括但不限于種子、懸浮培養物、胚、分生組織 區、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、抱子體、花粉和小抱子。可用于本公開方法中的植物的類 別通常與適于轉化技術的高等植物的類別一樣寬，包括單子葉植物或雙子葉植物兩者在 內，包括W下各屬的物種在內：南瓜屬(化curbita)、菩薇屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、胡桃屬 (Juglans)、草替屬（Fragaria)、百脈根屬化otus)、首猜屬（Medicago)、驢食草屬 (OnobiTchis)、Ξ葉草屬（Trifolium)、胡盧己屬（Trigone 11a)、班豆屬（Vigna)、相橘屬 (Citrus)、亞麻屬(Xinum)、老鶴草屬（Geranium)、木馨屬(Manihot)、胡蘿h屬（Daucus)、鼠 耳芥屬（Arabidopsis)、蕓苔屬（Brassica)、蘿h屬（Raphanus)、白芥屬（Sinapis)、顛茄屬 (Atropa)、辣椒屬（Capsicum)、曼巧羅屬（Datura)、天仙子屬（Hyoscyamus)、番茄屬 化7。〇9日'3；[。0]1)、煙草屬（化。〇1:1日]1日）、茄屬（5〇1日]111111)、矮牽牛屬。日1：11]11日）、毛地黃屬 (Digitalis)、Majorana、菊宦屬（Ciahorium)、向日葵屬巧elianthus)、窩宦屬(Xactuca)、 雀麥屬（Bromus)、天口冬屬（Asparagus)、金魚草屬（Antirrhinum)、宣草屬 (Heterocallis)、化mesis、天竺葵屬（Pelargonium) Janieum、狼尾草屬（Pennisetum)、毛 良屬（Ranunculus)、千里光屬（Senecio)、蛾蝶花屬（Salpiglossis)、黃瓜屬（Cucumis)、 Rrowaalia、大豆屬(Glycine)、魏豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、黑麥草屬(Xolium)、稻 屬（OiTza)、燕麥屬（Avena)、大麥屬化ordeum)、黑麥屬（Secale)、蔥屬(Allium)和小麥屬 (Triticum)。特別優選的植物是玉米(Zea mays)。
[0101] 本文所用的"多核巧酸"包括指具有天然核巧酸的必要性質的脫氧核糖多核巧酸、 核糖多核巧酸或其類似物，它們具有該必要性質是因為它們能在嚴格雜交條件下雜交至與 天然存在的核巧酸所雜交的核巧酸基本上相同的核巧酸序列，和/或容許翻譯成與天然存 在的核巧酸所翻譯成的氨基酸相同的氨基酸。多核巧酸可W是天然或異源結構基因或調控 基因的全長序列或其亞序列。除非另外指明，否則該術語包括設及指定的序列及其互補序 列。因而，為了穩定性或為了其他原因對主鏈進行了修飾的DNA或RNA是如該術語在本文所 意指的"多核巧酸"。此外，包含稀有堿基(諸如次黃嚷嶺核巧)或修飾堿基(諸如Ξ苯甲基化 的堿基）（僅舉兩個例子)的DNA或RNA是多核巧酸(如該術語在本文所用的）。應當理解，已對 DNA和RNA進行了很多種修飾，運些修飾起到本領域技術人員已知的許多有用目的。本文所 用的術語多核巧酸涵蓋多核巧酸的運類經化學修飾、酶修飾或代謝修飾的形式，W及病毒 和細胞(包括特別是簡單細胞和復雜細胞)特征性的DNA和RNA的化學形式。
[0102] 術語"多膚"、"膚"和"蛋白質"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。運些 術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應的天然存在的氨基酸的人工化學類似物的 氨基酸聚合物，W及適用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0103] 本文所用的"啟動子"包括指DNA的在轉錄起始的上游并設及RNA聚合酶和其他蛋 白質的識別和結合W啟動轉錄的區域。"植物啟動子"是能夠在植物細胞中啟動轉錄的啟動 子。示例性的植物啟動子包括但不限于從植物、植物病毒和包含在植物細胞中表達的基因 的細菌獲得的那些啟動子，所述細菌諸如農桿菌(Agrobacterium)或根瘤菌(lihizobium)。 例如，在某些組織諸如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞或厚壁組織中優先啟動轉錄的 啟動子。運種啟動子稱為"組織優選的"。"細胞類型"特異性啟動子主要驅動在一種或多種 器官中的某些細胞類型（例如，根或葉中的維管細胞）中的表達。"誘導型"或"調控型"啟動 子是處于環境控制下的啟動子。可實現通過誘導型啟動子進行的轉錄的環境條件的例子包 括無氧條件或光的存在。另一類型的啟動子是發育調控的啟動子，例如在花粉發育過程中 驅動表達的啟動子。組織偏好啟動子、細胞類型特異性啟動子、發育調控的啟動子和誘導型 啟動子構成"非組成型"啟動子類別。"組成型"啟動子是在大多數環境條件下活躍的啟動 子。合適的組成型啟動子包括(例如)泛素啟動子、肌動蛋白啟動子和G0S2啟動子(Pater et al (1992)，The Plant Journal，2:837-844(Pater等人，1992年，《植物學報》，第2卷，第837- 844頁)）。
[0104] 本文所用的"重組