0157]擴增子表達盒包含源自植物病毒的序列，該序列含有祀基因的全部或部分但通常 不含有該天然病毒的基因的全部。存在于表達盒的轉錄產物中的病毒序列使得該轉錄產物 指導其自身的復制。由該擴增子產生的轉錄物相對于祀序列（即硝酸鹽攝取相關多膚的信 使RNA)可W是有義或反義的。利用擴增子來抑制內源植物基因的表達的方法例如在如下文 獻中有描述:Angell and Baulcombe，（1997化MBO J.16:3675-3684(AngeU和Baulcombe， 1997年，《歐洲分子生物學組織雜志》，第16卷，第3675-3684頁）、Angell and Baulcombe， (1999)Plant J. 20:357-362(Angel 1 和Baulcombe，1999年，《植物雜志》，第20卷，第357-362 頁）W及美國專利齡.6,646,805，運些文獻和專利的每一個^引用的方式并入本文。
[015引 vi.核酶
[0159] 在一些實施例中，由本公開的表達盒表達的多核巧酸是信使RNA特異性的催化性 RNA或具有信使RNA特異性的核酶活性。運個方法例如在美國專利No. 4，987，071中進行了描 述，將該專利W引用方式并入本文。
[0160] vii.小干擾 RNA 或微 RNA
[0161] 在本公開的一些實施例中，OsBGl表達的抑制可通過表達編碼微RNA(miRNA)的基 因經由RNA干擾來獲得。miRNA是由約22個核糖核巧酸組成的調控劑，miRNA在抑制內源性基 因表達方面很高效。參見，例如化vier，et al. ,(2003)化Uire 425:257-263(化vier等人， 2003年，《自然》，第425卷，第257-263頁），該文獻W引用方式并入本文。
[0162] 對于miRNA干擾，將表達盒設計成表達在內源性miRNA基因上建模的RNA分子。該 miRNA基因編碼可形成發夾結構的RNA，該發夾結構含有與另一內源性基因（祀序列)互補的 22核巧酸序列。為抑制硝酸鹽攝取相關表達，所述22個核巧酸的序列選自硝酸鹽攝取相關 轉錄物序列并包含所述硝酸鹽攝取相關序列W有義取向的22個核巧酸和與所述有義序列 互補的相應反義序列的21個核巧酸。miRNA分子在抑制內源性基因的表達上很高效，它們誘 導的RNA干擾被植物后代繼承。
[0163] 2.基因表達白勺基于多膚白勺抑審。
[0164] 在一個實施例中，所述多核巧酸編碼與編碼OsBGl的基因結合的鋒指蛋白，從而導 致所述基因的表達降低。在特定實施例中，該鋒指蛋白結合至硝酸鹽攝取相關基因的調控 區。在其他實施例中，該鋒指蛋白結合至編碼OsBGl的信使RNA并防止其翻譯。選擇被鋒指蛋 白祀向的位點的方法已例如在美國專利No.6,453,242中進行了描述，利用鋒指蛋白來抑制 植物中的基因表達的方法例如在美國專利申請公布No. 2003/0037355中進行了描述，運些 專利中的每一個W引用方式并入本文。
[01化]3.蛋白質活性的基于多膚的抑制
[0166] 在本公開的一些實施例中，多核巧酸編碼結合至本公開多膚的抗體。抗體在植物 細胞中的表達W及通過表達并將抗體結合至植物細胞中的蛋白質來抑制分子途徑是本領 域所熟知的。參見例如Conrad and Sonnewald, (2003)化 1:ure Biotech. 21: 35-36(Conrad 和Sonnewald，2003年，《自然生物技術》，第21卷，第35-36頁），其W引用方式并入本文。
[0167] 4.基因破壞
[0168] 在本公開的一些實施例中，通過破壞編碼硝酸鹽攝取相關多膚的基因，降低或消 除OsBGl的活性。可通過本領域已知的任何方法來破壞編碼硝酸鹽攝取相關多膚的基因。例 如，在一個實施例中，通過轉座子標簽法破壞所述基因。在另一個實施例中，通過利用隨機 誘變或定向誘變來對植物進行誘變處理并選擇具有減低了的氮利用活性的植物來破壞所 述基因。
[01~]i.轉座子標簽法
[0170] 在本公開的一個實施例中，使用轉座子標簽法降低或消除一種或多種硝酸鹽攝取 相關多膚的硝酸鹽攝取相關活性。轉座子標簽法包括在內源性硝酸鹽攝取相關基因內插入 轉座子W降低或消除所述硝酸鹽攝取相關多膚的表達。"硝酸鹽攝取相關基因"意指編碼根 據本公開的OsBGl的基因。
[0171] 在該實施例中，通過在編碼硝酸鹽攝取相關多膚的基因的調控區或編碼區內插入 轉座子來降低或消除一種或多種硝酸鹽攝取相關多膚的表達。處于硝酸鹽攝取相關基因的 外顯子、內含子、5'或3'非翻譯序列、啟動子或任何其他調控序列內的轉座子可用于降低或 消除所編碼硝酸鹽攝取相關多膚的表達和/或活性。
[0172] 用于對植物中的特定基因進行轉座子標簽的方法是本領域所熟知的。參見例如 Maes，et al.，（1999)Trends Plant Sci.4:90-96(Maes等人，1999年，《植物科學趨勢》，第4 卷，第90-96頁）；Dha;rmapu;ri and Sonti,(1999)FEMS Microbiol.Lett. 179:53-59 (Dharmapuri和Sonti，1999年，《歐洲微生物學會聯合會微生物學快報》，第179卷，第53-59 頁）；Meissner，et al.，（2000)Plant J. 22: 265-274(Meissner等人，2000年，《植物雜志》， 第22卷，第265-274頁）；I^ogat，et al.，（2000) J. Biosci . 25:57-63(曲ogat等人，2000年， 《生物科學雜志》，第25卷，第57-63頁）；￥3化的，（2000)加''.化111.?1311181〇1.2:103-107 (Wa化ot，2000年，《植物生物學新見》，第2卷，第 103-107頁）；Gai，et al.，（2000)Nucleic Acids Res. 28:94-96(Gai等人，2000年，《核酸研究》，第28卷，第94-96頁）；Fitzmaurice，et al.，（1999)Genetics 153:1919-1928(Fitzmaurice等人，1999年，《遺傳學》，第 153卷，第 1919-1928頁）。此外，用于選擇選定基因中的Mu插入序列的TUSC方法已在如下文獻中進行 了描述:Bensen，et al.，（1995)Plant Cell 7:75-84(Bensen等人，1995年，《植物細胞》，第 7卷，第75-84頁）；Mena，et al.，（1996)Science 274:1537-1540(Mena等人，1996年，《科 學》，第274卷，第1537-1540頁)和美國專利No. 5，962，764，運些文獻和專利的每一個W引用 的方式并入本文。
[017引 ii.活性降低的突變體植物
[0174] 用于降低或消除植物中的內源性基因的表達的另外方法也是本領域已知的，并且 可類似地應用于本公開。運些方法包括其他形式的誘變，諸如甲橫酸乙醋誘導的誘變、缺失 誘變和快中子缺失誘變，快中子缺失誘變W反向遺傳學方式(使用PCR)用于鑒別其中內源 性基因已缺失的植物株系。運些方法的例子參見化shima,et al. , (1998)Vi;rology 243: 472-481(0hshima 等人，1998年，《病毒學》，第 243卷，第472-481頁）；0kubara，et al.， (1994)Genetics 137:867-874(0kubara等人，1994年，《遺傳學》，第 137卷，第867-874頁）； W及Quesada,et al. , (2000)661161:;[。3154:421-436(01163日(1日等人，2000年，《遺傳學》，第 154卷，第421-436頁）；運些文獻的每一個W引用的方式并入本文。此外，一種用于篩選化學 誘導的突變的快速且可自動化的方法T化LING(祀向誘導基因組局部突變）也適用于本公 開，該方法利用變性HPLC或者對選定的PCR產物的選擇性內切核酸酶消化。參見Me化1 lum， et al. ,(2000)化t.Biotechnol.l8:455-457(McCallum等人，2000年，《國家生物科技》，第 18卷，第455-457頁），所述文獻W引用方式并入本文。
[0175] 影響基因表達或干擾所編碼的蛋白質的功能（增加的氮利用活性）的突變是本領 域所熟知的。基因外顯子中的插入突變通常導致無效突變體。保守殘基的突變在抑制所編 碼的蛋白質的活性方面是特別有效的。植物硝酸鹽攝取相關多膚的、適于W消除硝酸鹽攝 取相關活性為目標進行的誘變的保守殘基已得到描述。可根據熟知的程序分離運種突變 體，并且可通過遺傳雜交對不同硝酸鹽攝取相關基因座中的突變進行堆疊。參見例如 Gruis，et al.，（2002)Plant Cell 14:2863-2882(Gruis等人，2002年，《植物細胞》，第 14 卷，第 2863-2882頁）。
[0176] 在本公開的另一個實施例中，顯性突變體由于基因倒位和重復基因座的重組可用 于引發RNA沉默。參見例如Kusaba，et al.，（2003)Plant Celll5:1455-1467化usaba等人， 2003年，《植物細胞》，第15卷，第1455-1467頁）。
[0177] 本公開涵蓋用于降低或消除一種或多種硝酸鹽攝取相關多膚的活性的另外方法。 用于改變或突變植物中的基因組核巧酸序列的其他方法的例子是本領域已知的，包括但不 限于使用RNA: DNA載體、RNA: DNA突變載體、RNA: DNA修復載體、混合雙鏈寡核巧酸、自互補 RNA:DNA寡核巧酸W及重組工程寡核堿基（recombinogenic oligonucleobase)。運種載體 和使用方法是本領域已知的。參見例如第5,565,350號美國專利;第5,731，181號美國專利； 第5,756,325號美國專利;第5,760,012號美國專利;第5,795,972號美國專利和第5,871， 984號美國專利，將運些專利中的每一個W引用的方式并入本文。另參見W0 98/49350、W0 99/07865、W099/25821和Beetham，et al.，（1999)Proc.化tl.Acad.Sci.USA 96:8774-8778 (Beetham等人，1999年，《美國國家科學院院刊》，第96卷，第8774-8778頁）；將運些文獻和專 利的每一個W引用方式并入本文。
[017引 Vi.調節生殖組織發育
[0179] 提供了用于調節生殖組織發育的方法。在一個實施例中，提供了用于調節植物中 的花發育的方法。所謂"調節花發育"意指與其中硝酸鹽攝取相關多膚的活性或水平還未受 調節的對照植物相比，植物的生殖組織的結構的任何改變。"調節花發育"還包括與其中硝 酸鹽攝取相關多膚的活性或水平未受調節的對照植物相比，植物生殖組織發育的時刻的任 何改變（即花發育時刻的延遲或提前）。宏觀改變可包括在環境脅迫時的如下變化:生殖器 官的尺寸、形狀、數目或位置，運些結構形成的發育時間段，或者維持或發展經過開花過程 的能力。微觀改變可包括構成生殖器官的細胞的類型或形狀的變化。
[0180] -般來講，修改或改變宿主內源性基因組DNA的方法是可用的。運包括改變宿主天 然DNA序列或預先存在的轉基因序列，所述轉基因序列包括調控元件、編碼序列和非編碼序 列。運些方法也可用于使核酸祀向基因組中預工程化的祀標識別序列。例如，本文所述的經 遺傳修飾的細胞或植物使用"定制"或工程化的內切核酸酶(諸如大范圍核酸酶)生成，所述 大范圍核酸酶的產生用于修飾植物基因組(參見例如W0 2009/114321 ;Gao et al. (2010) Plant Journal l:176-187(Gao等人，2010年，《植物雜志》，第1卷，第176-187頁））。另一個 定點工程化通過使用與限制性酶的限制特性結合的鋒指結構域識別。參見例如，Urnov，et al .，（2010)化t Rev Genet. 11 (9):636-46化rnov等人，2010年，《自然綜述遺傳學》，第11 卷，第9期，第636-646頁）；amkla，et al.，（2009)化Uire 459(7245) :437-41(5}1址1日等人， 2009年，《自然》，第459卷，第7245期，第437-441頁）。類轉錄激活因子(TAL)效應物-DNA修飾 酶(TALE或TALEN)也用于植物基因組中進行工程化改變。參見例如US20110145940，Cermak et al.，（2011)Nucleic Acids Res.39(12)(Cermak等人，2011 年，《核酸研究》，第39卷，第 12期）和Boch，et al.，（2009)Science 326(5959): 1509-12(Boch等人，2009年，《科學》，第 326卷，第5959期，第1509-1512頁）。也可W使用細菌類型II CRISPR(成簇的規律間隔的短 回文重復序列）/Cas(CRISPR相關）系統進行植物基因組的位點特異性修飾。參見例如， Be化aj et al.，（2013)，Plant Methods 9:39(Be化aj等人，2013年，《植物方法》，第9卷，第 39頁）；CRISPR/Cas系統允許由可定制的小型非編碼RNA引導基因組DNA的祀向切割。基于 BG1編碼序列、直系同源物/同源物的多膚序列和基因組DNA序列的公開內容，可容易地進行 定點誘變，W生成表達更高水平的內源性BG1多膚或其直系同源物的植物。
[0181] 還涵蓋對于本文所公開的或所述實施例的BG1多膚或對于其變體或片段的抗體。 本公開的抗體包括多克隆和單克隆抗體W及它們的片斷，所述片斷保留了其與本文所公開 的BG1多膚結合的能力。抗體、單克隆抗體或其片段如果能夠與分子發生特異性反應從而使 該分子與該抗體、單克隆抗體或其片段結合，則被認為能夠結合該分子。術語"抗體"（Ab)或 "單克隆抗體"（Mab)意在包括能夠結合半抗原的完整分子W及其片段或結合區或域(諸如 例如，Fab和F(ab). sub. 2片段）。此類片段通常由蛋白質水解裂解(諸如木瓜蛋白酶或胃蛋 白酶)產生。或者，半抗原結合片段可通過應用重組DNA技術或通過合成化學來產生。用于制 備本公開的抗體的方法是本領域公知的。例如參見Antibodies,A LaboratoiT Manual,Ed 化rlow and David Lane(eds.)Cold Spring 化rbor Laboratory,N.Y. (1988)(《抗體：實 驗室手冊》，Ed化rlow和化vid Lane編輯，紐約冷泉港實驗室，1988年）W及其中引用的參 考文獻。說明免疫學一般原理的標準參考著作包括:Klein, J. Immunology :The Science of Cell-Noncell Discrimination John Wil巧&Sons，N.Y. (1982KKlein，J，《免疫學：細胞- 非細胞識別科學》，約翰威利父子出版公司，紐約，1982年）；Dennett ,et al. ,Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses,Plenum Press,N.Y. (1980)(Dennett等人，單克隆抗體，《雜交瘤:生物學分析的新尺度》，普萊南出版社，紐約， 1980年似及Campbell, "Monoclonal Antibody TechnologyIn Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Vol.13,Burdon,et al.,(eds.),Elsevier, Amsterdam!； 1984) (Campbell，"單克隆抗體技術"，載于《生物化學和分子生物學實驗技術》， 第13卷，Burdon等人編輯，愛思唯爾出版社，阿姆斯特丹，1984年）。另參見W下各號美國專 利：4，196,265、4,609,893、4,713,325、4,714,681、4,716，111、4,716，117和4,720,459。 PtIP-50多膚或PtIP-65多膚抗體或其抗原結合部分可通過多種技術產生，包括常規的單克 隆抗體方法，例如Kohler and Milstein，（1975)NaUire 256:495化ohler和Milstein，1975 年，《自然》，第256卷，第495頁）的標準體細胞雜交技術。也可采用用于產生單克隆抗體的其 他技術，諸如B淋己細胞的病毒轉化或致癌性轉化。用于制備雜交瘤的動物系統是鼠系統。 用于分離供融合用的免疫脾細胞的免疫方案和技術是本領域已知的。融合伴侶(例如，鼠骨 髓瘤細胞)和融合程序也是已知的。本公開的抗體和單克隆抗體可通過將本文所公開的BG1 多膚用作抗原來制備。
[0182] 提供了用于在樣品中檢測本文所公開的BG1多膚的存在或檢測編碼本文所公開的 BG1多膚的核巧酸序列的存在的試劑盒。在一個實施例中，該試劑盒提供了基于抗體的試劑 W用于檢測組織樣品中的本文所公開的BG1多膚的存在。在另一個實施例中，該試劑盒提供 了可用于檢測編碼本文所公開的BG1多膚的一個或多個多核巧酸的存在的標記核酸探針。 該試劑盒連同執行檢測方法的適當試劑和對照W及試劑盒使用說明一起提供。
[0183] 如上面所論述的，技術人員將會認識用于調節植物中的花發育的適當啟動子。用 于該實施例的示例性啟動子包括組成型啟動子、誘導型啟動子、苗偏好的啟動子W及花序 偏好的啟動子。
[0184] 所關注基因可反映設及作物開發的那些的商業市場和利益。所關注的作物和市場 在變化，隨著發展中國家開放了世界市場，也將出現新的作物和技術。另外，隨著我們對農 學性狀和特性諸如產量和雜種優勢的理解逐漸深入，選擇進行轉化的基因會相應變化。所 關注基因的大體類別包括例如設及信息的那些基因（諸如鋒指）、設及通信的那些基因（諸 如激酶)和設及看家的那些基因（諸如熱休克蛋白）。轉基因的更具體類別例如包括編碼對 農學、昆蟲抗性、病害抗性、除草劑抗性、不育性、巧粒特性和商業產品重要的性狀的基因。 一般而言，所關注基因包括設及油、淀粉、碳水化合物或營養物質代謝的那些基因 W及影響 仁大小、薦糖載量等的那些基因。
[0185] 在某些實施例中，可將本公開的核酸序列與所關注的其他多核巧酸序列結合（"堆 疊"）使用，W便產生具有所需表型的植物。
[0186] 參考如下非限制性實例可更好地理解本公開。本領域技術人員將會理解，可W在 不脫離本文所公開的并受權利要求書保護的本公開的實質和范圍的情況下實施本公開的 其他實施例。
[0187]
[01則實例l-Bgl-D突變體表現出增大的谷物顆粒尺寸表型
[0189] 為了更深入地了解控制水稻顆粒尺寸的基因網絡，在大量的T-DNA水稻突變體中 發現了具有不同種子尺寸的多個突變體，所述T-DNA水稻突變體是通過用農桿菌介導的轉 化(Ma et al .，2009，J. Genet.GenomiCS，36，267-276(Ma等人，2009年，《遺傳學與基因組學 雜志》，第36卷，第267-276頁））對水稻（日本晴水稻（0;ryza sativa L. cv.Nipponbare))進 行轉化而獲得的。鑒定并表征它們中的一者，即大粒顯性突變體(bgl-D)，一種具有顯著增 大的谷物顆粒尺寸和谷物顆粒重量的顯性水稻突變體。與野生型日本晴水稻（Oryza Sativa L.spp.Japonica)相比，bgl-D顯示在營養生長期和生殖期兩者中的植株高度增加 并且器官尺寸增大（圖1)。在發芽后第屯天，觀察到bgl-D突變體加速生長，與野生型植株相 比，其具有顯著伸長的葉銷（圖1A和圖13)。進入生殖期和營養生長期之后，野生型與bgl-D 的形態差異變得更明顯。bgl-D的葉大于野生型植株的葉，并且bgl-D突變體顯示節間伸長 改變，運導致植株高度增加（圖1B和圖1C)。有趣的是，bgl-D顯示具有更長的穗和更大的谷 物顆粒表型（圖1D、圖化和圖1F)，運些性狀與水稻產量密切相關。在開花之前檢驗稻殼的橫 截面，發現bgl-D中出現數量和體積增大的薄壁細胞（圖2)，從而導致谷物顆粒寬度增大。用 掃描電鏡(SEM)觀察到的穎殼的縱向剖面顯示bgl-D中的表皮細胞比野生型的表皮細胞要 長（圖14)。另外，還比較通過測量鮮重和干重獲得的巧粒灌漿速率。受精15天后，bgl-D的鮮 重和干重均顯著高于野生型的鮮重和干重，在受精后約25天該差值達到最大值（圖15)。基 于運些結果，很可能bgl-D突變體中谷物顆粒尺寸增大和谷物顆粒重量的增加主要是由谷 物顆粒寬度、長度增大和巧粒灌漿速率提高所致。表A1示出了 bgl-D和野生型植株的成熟植 株的農學性狀的比較。
[0190] 植物材料和生長條件:Bgl-D突變體最初是從我們在日本晴梗稻（SSP japonica) 背景中的T-DNA插入突變體庫中鑒定得到的。所有成熟植株均在北京或海南的稻田中在自 然條件下生長。就植物激素處理而言，將發芽的種子放置在浮置于1/2MS上的無底96孔板上 并移至具有1化光照/1化黑暗循環的生長室(28°〇。7天后對幼苗進行取樣和處理。
[0191] 表A1.野生型和Bgl-D植物的農學性狀。
[0192]
[0193] 對成熟植株進行農學性狀分析。結果表示為括號中所示的幾組尺寸的平均值± SD，（n = 30)。星號表示通過學生t檢驗確定的野生型和Bgl-D植物之間差異的顯著性。** 0.001 <P<0.01，林沖 <0.001。
[0194] 表A2.下面示出了稻田的產量試驗。
[0195]
[0196] 種植密度為20cmX20cm，每小塊地的面積為15m2。數據是通過在中國北京自然條 件下對塊區中的植株采用Ξ次平行測定計算獲得的。
[0197] 實例2 - BG1的分子克隆和表征
[0198] 通過遺傳學分析，用T-DNA插入序列共分離bgl-D的表型，并且T1代的分離比率為 大約3:1，運反映了 T-DNA在bgl-D突變體的單個基因座處插入。此外，不管bgl-D用作父本還 是母本，bgl-D的子代均表現為大顆粒表型，運表明Bgl為通過BG1的激活而產生的顯性突變 體(表S1)。
[0199] 使用已知方法，通過Site-Finding PCR法基于熱不對稱交錯式PCR(TA化-PCR)克 隆T-DNA 3 ' -旁側序列。序列分析顯示，基因0s03g0175800位于T-DNA插入序列的下游0.8kb 處。0s03g0175800的表達水平比在野生型植株中的水平提高了約10倍（圖3)