觸發針對多種腫瘤的抗體依賴細胞毒性的嵌合受體的制作方法
【專利說明】觸發針對多種腫瘤的抗體依賴細胞毒性的嵌合受體
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 基于35U.S.C.§119,本PCT申請要求2013年10月17日提交的美國臨時申請61/892， 218,2014年7月18日提交的美國臨時申請62/026,243,和2014年9月9日提交的美國臨時申 請62/047,916的優先權。所有優先權申請的全部內容通過引用納入本文。 發明領域
[0003] 本發明設及結合人類免疫球蛋白化部分并遞送活化信號的嵌合受體。本發明的嵌 合受體包括高親和性V158FCGR3A變體、CD8a的較鏈區和跨膜區、CD3C和4-1BB的信號傳導 區。本發明的嵌合受體對利妥昔單抗、曲妥珠單抗、hul4.18K322A和其他治療性抗體具有高 親和力，使其可用于增強針對多種癌癥的抗體療法的療效。
[0004] 發明【背景技術】
[0005] 免疫治療具備規避耐藥性的基因和細胞機制，祀向腫瘤細胞的同時能保留正常組 織的潛能，因此是癌癥治療的有前途的選擇。對血液惡性腫瘤的異體造血干細胞移植 化SCT)的結果證明T-淋己細胞可W起到主要的抗腫瘤作用，其中T-細胞介導的移植物抗宿 主病(GvHD)與疾病復發呈負相關，并且免疫抑制停藥或輸注供體淋己細胞可W包括疾病復 發。Weiden 等，N. Engl. J. Med. ,1979; 1979( 19) :1068-1073 ; Porter 等，N. Engl. J. Med.， 1994;330(2) :100-106;Κο化等，Blood 1995;86(5) :2041-2050;Slavin等，Blood 1996;87
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[0006]癌癥免疫治療的另一個方法是施用單克隆抗體，其可W通過多種機制發揮細胞毒 性，包括促細胞調亡信號、補體結合和抗體依賴細胞毒性（ADCC)。Yu等， N. Engl. J.Med. 2010; 363(14) :1324-1334 ;尸6'甘13等，1(：1111.011。〇1.2010;28(28):4390- 4399;Maloney,N.Engl.J.Med.2012;366(21):2008-2016;Scott等，Nat.Rev.(Mincer 2012; 12(4):278-287;Weiner等，Cell 2012;148(6):1081-1084;Galluzzi等，Oncoimmunology 2012; 1 (1): 28-37.后一種機制發揮主要作用，是源自于通過抗體Fc部分與表達于天然殺傷 細胞（NK細胞）和其他細胞（如中性粒細胞和巨隧細胞）表面的Fc受體（Fc 丫 R)的銜接。 Nimmerjahn等，化t.Rev. Immunol .2008;8(1) :：34-47。化丫 R基因的多態性可W具有明顯的 功能性結果，進而影響對抗體治療的反應。為此，NK細胞表達的編碼Fc 丫 RIIIa(FCRG3A或 CD16)的基因的同種型可導致受體在158位具有苯丙氨酸(F)或鄉氨酸(V)殘基;在少數個體 上，CD16158V/V具有更高的Fc結合力并與腫瘤細胞殺傷增加和優越的患者反應相關。 Ferris 等，J. Clin. Oncol. 2010; 28(28) :4390-4399 ;1(〇6116等，81〇〇(11997;90(3):1109- 1114; Cadron等，Blood 2002; 99 (3): 754-758; Weng等，J. Cl in. Oncol. 2003; 21 (21): 3940- 3947;Dair〇zzo等，Cancer Res. 2004;64( 13) :4664-4669;Hatjiharissi等，Blood 2007; 110(7) :2561-2564 ;Musolino 等，J.Clin.Oncol. 2008; 26( 11): 1789-1796 ;Bibeau 等， J.Clin.Oncol.2009;27(7):1122-1129;Ahlgrimm等，Blood 2011;118(17):4657-4662; Veeramani等，Blood 2011; 118( 12):3347-3:349。
[0007] 本領域迫切需要研發癌癥治療的新方法和新試劑。 發明概要
[0008] 本發明，至少部分發明，是基于對用于例如癌癥治療的新型嵌合受體的開發。因 此，本文提供了嵌合受體，編碼它的核酸，包含該編碼核酸的載體，表達該嵌合受體的宿主 細胞，和該宿主細胞在增強個體（如癌癥患者）中基于抗體的癌癥療法和/或ADCC效果中的 應用。
[0009] -方面，本發明提供了一種嵌合受體，其包含：（a)CD16分子的細胞外配體結合區； (b)CD8a的較鏈區和跨膜區；和山)包括4-1BB信號傳導區和CD3C信號傳導區的胞漿區。在一 些實施方式中，CD 16分子為F158FCGR3A，其胞外配體-結合區可包含(例如，由W下組成)SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。在其他實施方式中，CD16分子為V158FCGR3A變體，其胞外配 體-結合區可包含(例如，由W下組成)SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0010] 本文公開的任一嵌合受體中，CD8a的較鏈區和跨膜區可包含(例如，由W下組成） SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列;4-1BB信號傳導區可包含(例如，由W下組成)SEQ ID N0:4 所示的氨基酸序列，和/或CD3C信號傳導區可包含(例如，由W下組成）SEQ ID N0:5所示的 氨基酸序列。
[0011] 本文公開的任一嵌合受體可進一步包含CD8a的信號膚，其位于該嵌合受體的N端。 在一實施例中，該CD8a的信號膚可包含（例如，由W下組成）SEQ ID N0:6所示的氨基酸序 列。
[0012] 在一些實施方式中，所述嵌合受體可包含沈Q ID NO: 1或沈Q ID NO: 15的殘基22- 436所示的氨基酸序列。在一實施例中，所述嵌合受體包含(例如，由W下組成)SEQ ID N0:1 或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
[0013] 在另一方面，本發明提供了一種分離的多核巧酸，其包含編碼本文公開的任一嵌 合受體的核巧酸序列。在一些實施方式中，編碼所述嵌合受體的多核巧酸可包含SEQ ID N0:10或沈Q ID N0:18所示的核巧酸序列，SEQ ID N0:11所示的核巧酸序列，SEQ ID N0:12 所示的核巧酸序列，SEQ ID N0:14所示的核巧酸序列，或它們的組合。在一【具體實施方式】 中，編碼所述嵌合受體的多核巧酸包含SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 17所示的核巧酸序列。
[0014] 在另一方面，本發明提供了一種載體，其包含編碼本文所公開的任一嵌合受體的 多核巧酸，其中，所述多核巧酸可操作性地與至少一個調控元件連接W便表達嵌合受體。在 一實施例中，所述載體是病毒載體(例如，逆轉錄病毒載體或慢病毒載體）。
[0015] 進一步地，本發明提供了一種分離的宿主細胞，其包含本文公開的任一嵌合受體。 在一【具體實施方式】中，所述宿主細胞是τ淋己細胞或NK細胞。在一【具體實施方式】中，所述宿 主細胞是離體活化和/或擴增的T淋己細胞或NK細胞，（例如，T淋己細胞可在有一種或多種 選自下組的試劑存在下被活化：抗-C D 3 / C D 2 8，I L - 2，和植物凝集素 (phytohemoagglutinin);例如，NK細胞可在有一種或多種選自下組的試劑存在下被活化： CD137配體蛋白，CD137抗體，化-15蛋白，比-15受體抗體，化-2蛋白，比-12蛋白，比-21蛋白 和K562細胞系）。在一【具體實施方式】中，所述宿主細胞是分離自癌癥患者的自體T淋己細胞 或自體NK細胞。在一【具體實施方式】中，所述宿主細胞是同種異體T淋己細胞或同種異體NK細 胞。在一【具體實施方式】中，所述宿主細胞是抑制了或消除了內源性T細胞受體表達的同種異 體T淋己細胞。
[0016] 在另一方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含（i)編碼本文公開的任一嵌合 受體的多核巧酸或包含該多核巧酸的載體，或表達該嵌合受體的宿主細胞;和（ii)藥學上 可接受的載體或賦形劑。所述藥物組合物進一步可包含對癌細胞產生毒性的抗體(如與腫 瘤細胞結合并具有與人CD16結合的人或人源化Fc部分的抗體，或利妥昔單抗，或曲妥珠單 抗，或者hu 14.18K322A，或依帕珠單抗，西妥昔單抗，或拉貝珠單抗）。
[0017] 在另一方面，本發明提供了一種增強有此需要的個體中基于抗體的癌癥免疫治療 的療效的方法。所述個體可用與癌細胞結合的抗體治療。該方法可包括將治療有效量的T淋 己細胞或NK細胞引入該個體，該T淋己細胞或NK細胞表達本文描述的任一嵌合受體。
[0018] 此外，本發明提供了一種增強個體中T淋己細胞或NK細胞抗體一依賴細胞毒性 (ADCC)的方法，所述方法包括將治療有效量的T淋己細胞或NK細胞引入該個體，該T淋己細 胞或NK細胞表達本文描述的嵌合受體。在一【具體實施方式】中，所述個體正在接受與癌細胞 結合的抗體治療。
[0019] 在本文所述的任一方法中，所述個體可用抗體治療，該抗體具有與人CD16結合的 人或人源化Fc部分。在一【具體實施方式】中，所述個體用選自下組的抗體治療:利妥昔單抗、 曲妥珠單抗、hul4.18K322A、依帕珠單抗、西妥昔單抗和拉貝珠單抗。在一【具體實施方式】中， 所述癌癥選自下組:上皮癌、淋己瘤、肉瘤、母細胞瘤和白血病。在一【具體實施方式】中，所述 癌癥選自下組:B-細胞來源的癌癥(例如，B細胞急性淋己細胞白血病、B細胞慢性淋己細胞 白血病、B細胞非霍奇金淋己瘤），乳腺癌，胃癌，神經母細胞瘤，骨肉瘤，肺癌，黑色素瘤，前 列腺癌，結腸癌，腎細胞癌，卵巢癌，橫紋肌肉瘤，白血病，和霍奇金氏淋己瘤。在一具體實施 方式中，所述T淋己細胞或NK細胞為從所述個體分離的自體T淋己細胞或自體NK細胞。在一
【具體實施方式】中，在引入個體之前，所述自體T淋己細胞或自體NK細胞經離體活化或擴增。 在一【具體實施方式】中，所述T淋己細胞或NK細胞為同種異體T淋己細胞或同種異體NK細胞。 在一【具體實施方式】中，所述同種異體T淋己細胞為抑制或消除了內源性T細胞受體表達的T 淋己細胞。在一【具體實施方式】中，所述同種異體T淋己細胞或同種異體NK細胞先經離體活化 和/或擴增，再引入個體。在一【具體實施方式】中，用選自下組的方法將所述嵌合受體引入T淋 己細胞或NK細胞:逆轉錄病毒轉導，慢病毒轉導，DNA電穿孔和RNA電穿孔。
[0020] 在本文所公開的任一設及T淋己細胞活化的方法中，所述T淋己細胞可在有選自下 組的一種或多種試劑存在下被活化:抗-CD3/CD28，比-2，和植物凝集素。在本文所公開的任 一設及NK細胞活化的方法中，所述NK細胞可在有選自下組的一種或多種試劑存在下被活 化:CD137配體蛋白質、CD137抗體、比-15蛋白、比-15受體抗體、比-2蛋白、比-12蛋白、比-21 蛋白和K562細胞系。
[0021 ]本文所公開的任一方法可進一步包括給個體施用治療有效量的IL-2。
[0022] W下方面也在本發明的范圍內：（i)用于增強癌癥患者的ADCC效果或用于治療癌 癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含本文公開的編碼本文所公開嵌合受體的任一多核巧 酸，包含該多核巧酸的載體，或表達所述嵌合受體的宿主細胞，和藥學上可接受的載體或賦 形劑;和（ii)所述藥物組合物在用于生產用于癌癥治療的藥物中的應用。所述藥物組合物 可進一步包含抗癌癥抗體，例如本領域已知的或本文公開的。
[0023] 本發明的一個或多個實施方式在下文中詳述。從如下附圖和幾個實施方式的具體 描述W及所附權利要求中可W明顯看出本發明的其他特征或優點。
[0024] 附圖簡述
[0025] 本專利申請文件包含至少一幅彩色附圖。只要提出請求和繳納必要的費用，專利 局可提供附有彩色附圖的本發明申請文件的副本。
[00%] 圖1顯示了 T細胞中CD16V-BB-C受體的表達。A.CD16V-BB-C受體構建物的示意圖。 B.外周血T淋己細胞中CD 16V-BB-C受體的表達。流式細胞散點圖說明在用單獨包含GFP (模 擬）或包含GFP和CD16V-BB-C的載體轉導的活化的T淋己細胞中CD16(B73.1抗體）與GFP或 CD3C的組合表達。在每個象限示出了陽性細胞百分比。C.用GFP單獨或CD16V-BB-C轉導的T 淋己細胞的細胞裂解物的蛋白質印跡。膜用抗CD3C抗體探測。
[0027] 圖2顯示了 T細胞亞群中CD16V-BB-C受體的表達。A.活化的CD3巧淋己細胞用單獨 包含GFP的載體(模擬)和用包含CD16V-BB-C構建物的載體轉導。用流式細胞儀檢測CD4+和 CD8+細胞中CD 16的表達。散點圖顯示了典型試驗的結果。B. Ξ個獻血者的T淋己細胞獲得的 結果概要(平均值±SD)(P = N.S.)。
[002引圖3顯示了CD16V-BB-C受體的抗體結合力。A.用包含GFP(模擬)或GFP和CD16V-BB- ζ的載體轉導的T淋己細胞與利妥昔單抗溫育30分鐘；用與藻紅蛋白偶聯的羊抗人IgG抗體 (GAH IgG)和流式細胞術目測觀察結合于細胞表面的抗體量。B.用CD16V-BB-C(V158)或 CD16F-BB-C(F158)轉導的化rkat細胞與利妥昔單抗溫育30分鐘。該圖比較了從表達運兩個 受體的細胞獲得的GFP平均巧光強度(MFI)和GAH IgG MFI之間的關系。C.在利妥昔單抗存 在下，將經模擬轉導或用CD16V-BB-C轉導的化rkat細胞與經巧黃綠素 AM澄紅(calcein AM orange-red)標記的化udi細胞共同培養。定量測定各散點圖的右上象限中的細胞聚集物。 D.C.欄所示聚集實驗的概要顯示了 Ξ個實驗的平均值±50。在利妥昔單抗（"Ab")存在下， 用CD16V-BB-C轉導的化rkat細胞測得的聚集明顯更高于其他Ξ種培養條件下測得的聚集 。<0.001，采用*檢測）。
[00巧]圖4顯示了 CD16V-BB-C和CD16F-BB-C受體對曲妥珠單抗和人IgG的相對結合力。經 CD16V-BB-C(V158，黑色符號）或CD16F-BB-C(F158，白色符號）轉導的化rkat細胞與曲妥珠 單抗或人IgG溫育30分鐘。該圖比較了從表達任一受體的細胞中獲得的GFP平均巧光強度 (MFI)和與藻紅蛋白（PE)偶聯的羊抗人(GAH)IgG MFI之間的關系（曲妥珠單抗和