dT-DNA插入位 點的相鄰基因在野生型和bgl-D突變體之間的相對表達水平沒有顯著差異。基于運些結果， 假設0s03g0175800為負責bgl-D突變體的基因并將該基因稱為BG1。用5'和3'RACE試劑盒克 隆BG1的全長cDNA。結果表明BG1全長cDNA為1162bp長并包含編碼第330位氨基酸的933bp開 放閱讀框(0RF)。蛋白質數據庫的BLAST研究顯示，BG1與來自其他高等植物的蛋白質具有相 似性。系統發育分析表明，BG1及其22個結構同源物可被分成兩個子組:BG1雙子葉植物特異 性組和BG1單子葉植物特異性組。
[0200] 在擬南芥中，有四種與BG1顯示出高度序列相似性的類BG1蛋白，在水稻和擬南芥 中，BG1的N端和C端區中的一些殘基是高度保守的（圖16)。在單子葉植物中，BG1與來自短柄 草的化adi lg72920、來自玉米的GRMZM2G007134和GRMZM2G438606密切相關，表明BG1在整個 植物物種中是進化保守的。BGl可充當谷物顆粒尺寸的新型植物特異性調控子。
[0201] 通過實時PCR和啟動子GUS測定來檢測BG1的表達模式，結果顯示，BG1在包括根、 莖、葉、葉銷和穗在內的所有組織中廣泛表達。但它在幼穗(l-5cm長)和莖中高度表達，并且 表達水平隨著穗成熟而逐漸降低。BG1PR0:GUS轉基因植物的組織化學分析顯示，在所檢測 組織的維管組織中優先檢測到GUS活性（圖5)。
[0202] BG1基因的克隆：使用已知技術分離水稻基因組DNA。利用SiteFinding PCR方法， 基于熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)識別Bgl-D中的T-DNA插入序列的3'-側區。用于 SiteFinding PCR的引物在表S2中列出。通過Invitrogen 5'和3'34〔6系統擴增861的全長 cDNA。
[020引 表S1. T1代轉基因陽性和陰性植物的Bg 1-D表型測定
[0204] Bgl( + )和Bgl(-)分別代表Τι代轉基因陽性和陰性植物。所列出的值均為平均值± 沈。
[0205]
[0206] 表S2.用于Site-Finding PCR和RACE的引物（SEQ ID Ν0:28-38,下表按連續順序 列出）。
[0207]
[0208] RNA提取和定量實時RT-PCR:使用TRIzol試劑（Invitrogen)從各個水稻組織分離 總RNA。經RNase free面ase(Promega)處理之后，取化g RNA，使用寡核巧酸(肌）引物和AMV 逆轉錄酶（Promega)進行逆轉錄。通過使用SsoFast EvaGreen S叫e;rmix(Biorad)和Bio Rad CFX96實時PCR儀進行定量實時PCR(qRT-PCR)實驗。使用水稻ACTINl基因（OsACTl)作為 內對照物。用于qRT-PCR中的基因特異性引物在表S3中列出。
[0209] 載體構建和植株轉化：由野生型植株的cDNA來擴增BG1全長編碼序列，并將其克隆 到pCAMBIA 2300肌動蛋白中，生成pCAMBIA 2300-肌動蛋白：BG1過表達構建體。將含有化b 天然啟動子的3.化b基因組片段和具有3'UTR的整個BGl編碼區克隆到pCAMBIA 2300載體 中，得到pCAMBIA 2300-ProBGl :BG1過表達構建體。為了生成BGl-RNAi構建體，使用先前所 述的方法擴增BG1編碼序列的44化P基因特異性片段(SEQ ID ^:75)并將其克隆到9〔4181八 2300肌動蛋白載體中化in et al.，2012，Plant Physiol.158:451-464化in等人，2012年， 《植物生理學》，第158卷，第451-464頁））。而在啟動子-GUS測定中，則擴增BGl基因翻譯起始 密碼子的2-化基因組片段上游并將其克隆到PCAMBIA2391Z中。對于亞細胞定位，將BG1與由 35S啟動子驅動的C端GFP標記進行框內融合。確認序列后，用已知的根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)介導的轉化方法將所得的全部構建體轉化到水稻基因組 中。然后將轉基因植物轉移至稻田，進行正常的生長和種子收獲。用于載體構建的引物序列 在表S4中列出。 腳0] 表S3.用于實時PCR的引物(SEQ ID N0:39-64,下表按連續順序列出了每個基因的 正向引物和反向引物）。
[0211]
[0213] 表S4.用于載體構建的引物。（SEQ ID NO: 65-74,下表按連續順序列出了正向引 物和反向引物）
[0214] (帶標記的序列指示酶裂解位點）。
[0215]
[0216] 組織學分析和顯微鏡觀察：用光學顯微鏡(BX51;01ympus)分析穎殼的橫截面。用 福爾馬林:冰醋酸:70%乙醇（1:1:18)固定穎殼，然后在乙醇梯度溶液中進行脫水。將固定 的組織嵌入化raplast Plus片（憐片狀切片石蠟KSigma)中，用超薄切片機切成10WI1厚的 節段，然后置于多聚賴氨酸涂片(Sigma)上，隨后在二甲苯中脫蠟，充分再水合并干燥，之后 進行甲苯胺藍染色，W便用光學顯微鏡觀察。用Olympus stream軟件測定穎殼的外薄壁組 織層中的細胞數和細胞面積。用掃描電鏡(S-3000N;Hitachi)分析穎殼的縱向剖面，如前文 所述進行樣品預處理化i et al.，2010，Cell Res.20:838-849(Li等人，2010年，《細胞研 究》，第20卷，第838-849頁））。測量野生型和Bgl-D兩者中的細胞長度。
[0217] 實例3-BG1是控制谷物顆粒尺寸的新型正向調控子
[0218] 為了進一步驗證BG1作為谷物顆粒尺寸調控子的功能W及BG1的過表達對于增大 的谷物顆粒尺寸表型是否必要，我們用驅動BGlcDNA的表達載體在水稻ACTIN1啟動子的控 制下轉化野生型水稻。如圖6所示，BG1過表達植株表現出各種程度的谷物顆粒尺寸增大表 型和穗伸長（圖6A、B、C)。表型變化的大小與BG1表達水平明顯相關（圖抓）dBG1-過表達株系 的每1000粒重量顯著增加，運是因為與野生型相比，轉基因植物的谷物顆粒長度和谷物顆 粒寬度增大（圖6E、F、G)。相反，用RNAi抑制BG1導致水稻中產生明顯表型。植株高度更矮，穗 長和谷物顆粒尺寸大大減小（圖7A、B、C、D)，從而導致其每1000粒重量低于野生型植株。（圖 7F)。所有運些表型在一定程度上符合BG1在莖和穗中高度表達的結果。結論是，BG1為負責 bgl-D顯性突變體的基因。此外，由花挪菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子驅動的表達OsBGl的經 轉化野生型擬南芥(Col-0)表現出，擬南芥中OsBGl的過表達還導致種子尺寸增大，運表明 OsBGl可在單子葉植物和雙子葉植物之間共享某些共同的調控機制（圖17)。
[0219] 實例4-定位于質膜的BG1
[0220] 為了研究BG1對谷物顆粒尺寸調控的作用，探索了BG1的亞細胞定位。用先前所述 的基于網絡的工具進行的預測顯示，BG1蛋白不包含限定特定亞細胞定位或細胞外分泌的 推定序列基序。然后，將BG1的0RF與增強的綠色巧光蛋白（BGl-eGFP)融合，生成PC2300- 35S:BGl-eGFP載體。轉基因植物顯示出與bgl-D突變體相同的表型，諸如增大的谷物顆粒尺 寸和植株高度，運表明融合的BGl-eGFP與單獨的BG1具有相同的功能。觀察轉基因幼苗的 根，BGl-eGFP的巧光主要定位于質膜（圖8A)，運符合我們對水稻原生質體中的BGl-eGFP的 瞬時表達測定。為了進一步確認該結果，分離含有BGl-eGFP的轉基因植物的微粒體，觀察到 可通過微粒體顆粒中的GFP抗體來檢測到BG-eGFP，但在可溶性級分中只檢測到非常微弱的 信號。雙相分配測定進一步確認，富含質膜的級分中高度富含BG1-GFP蛋白，但其他膜的級 分中則不含BG1-GFP蛋白（圖8B)。所有運些結果表明，BG1為主要定位于質膜的新型蛋白質。
[0221] BG1的亞細胞定位：用eGFP蛋白在35S啟動子的控制下對BGlcDNA序列進行框內克 隆。對于共聚焦顯微鏡法而言，通過使用激光共聚焦掃描顯微鏡化eica TCS SP5)對BG1: eGFP轉基因株系的7天齡幼苗的根尖和水稻原生質體進行成像來檢測BGl:eGFP的定位模 式。eGFP在488nm波長處被激發，發射濾波器為500-530nm。根據經過略微修改的先前所述的 方法（Zhang et al.，2011，Plant Methods 7.21(Zhang等人，2011 年，《植物方法》，第7卷， 第21頁））進行水稻原生質體的制備和有效轉染。根據先前所述的方案進行微粒體分饋和雙 相膜分配實驗。用SDS-PAGE分析全部微粒體和富含PM的上層相中的等量蛋白質，并用抗GFP (Roche)、抗PIP2(Agrisera)、抗陽PC(Agrisera)和抗LHCII(Agrisera)抗體進行免疫印跡。 帷。實例5-BGl是初級生長素應答基因
[0223]植物激素在植物的生長和發育中起到非常重要的作用。為了確定BG1是否能響應 于外源植物激素，在不同處理條件下通過實時PCR來研究BG1的相對mRNA水平。結果顯示，在 施加2小時之后，BG1可被IAA特異性誘導，但不會被其他植物激素誘導（圖9A)。野生型植株 中的時程IAA誘導顯示，BG ImRNA水平在IAA施加的30分鐘內快速提高，最高水平比4小時后 在未誘導植株中觀察到的水平高大約8倍，然后表達下降并逐漸降至初始水平（圖9B)。在蛋 白質合成抑制劑放線菌酬(CHX)的存在下發生BGlmRNA被IAA誘導，運表明BG1轉錄物的積聚 與蛋白質合成無關（圖9C)。此外，另外兩種生長素化合物，糞乙酸(NAA)和2,4-二氯苯氧乙 酸（2-4-D)也能誘導BG1的表達。然而，色氨酸（一種在結構上類似于IAA但不具有生長素活 性的分子)不能誘導BGlmRNA積聚（圖9D)。運些結果均符合在BG1翻譯起始位點上游1500bp 范圍內發現兩種生長素響應元件(TGTCTC)的情況。基于運些結果，預測BG1為新型初級生長 素應答基因。為了測試外源IAA的敏感性，用10-3μΜ IAA處理野生型和Bgl-D的7天齡幼苗的 葉銷，與野生型植株的葉銷相比，Bgl-D突變體表現出葉銷伸長，運表明BG1的活性導致IAA 敏感性提高（圖9E)。
[0。4] 實例6-Bgl-D突變體表現出改變的IAA分布和傳輸
[0225] 為了進一步闡明負責由BG1過表達賦予的表型的機制，觀察了提高的BG1活性對生 長素傳輸的影響。當DR5-GUS植株與Bgl-D雜交時，雙突變體中的GUS表達模式改變。在野生 型植株中，GUS表達主要積聚在根尖區域處。然而，在DR5-GUS/Bgl-D雙突變體中，GUS表達在 根伸長區更強烈并覆蓋更大的面積（圖10B)。此外，當直接測定向基部運輸的IAA時發現，在 黑暗中生長的Bgl-D幼苗的胚芽銷中觀察到向基部進行的IAA傳輸提高大約50%，運表明向 基部進行的PAT增強導致Bgl-D突變體植株中的內源IAA分布改變（圖10A)。因此，Bgl-D表現 出對NPA(外源IAA傳輸抑制劑)增強的抗性，顯示BG1能特異性地響應于IAA并伴隨增強的極 性生長素傳輸(圖18)。
[0226] 生長素傳輸測定：用黑暗中生長的水稻幼苗的5天齡胚芽銷進行極性生長素傳輸 測定，方法如先前所述但經過略微修改化i et al.，2007，Cell Res.l7,402-410(Li等人， 2007年，《細胞研究》，第 17卷，第402-410頁）；Qi et al.，2008，Plant I%ysiol.l47，1947- 1959(Qi等人，2008年，《植物生理學》，第147卷，第1947-1959頁））：將2.0cm長的頂端胚芽銷 片段(切掉距離尖端0.2cm)放入1/2MS培養基中，在50rpm下振搖2小時，進行預培養。然后將 胚芽銷片段的頂端浸入1.5mL微量離屯、管內的15化1/2MS液體培養基中，該培養基包含 0.2 %組培凝膠、500nM 3H-IAA和50化Μ游離IAA，在黑暗中于室溫下放置3小時。加入NPA和 3Η-ΒΑ，作為ΙΑΑ傳輸對照物。經過3小時傳輸測定后，從所述片段的未浸沒端上切取0.5cm， 并用1/2MS液體培養基洗涂Ξ次。然后將所述片段分成五組，并在2.OmL通用閃爍液中溫育 1她。用液體閃爍計數器（1450Mic;roBeta Trixjerkin-Elmer)對放射性進行計量。基于浸 入緩沖液中的胚芽銷片段的取向，還測定了向頂生長素傳輸，W作為陰性對照。
[0。7] 實例7:器官尺寸相關基因在Bgl-D突變體中被上調
[02%]已確定一些基因的特征為控制擬南芥的器官尺寸，尤其是負責細胞增殖和細胞擴 張的基因，諸如AI肥GUMENTA(ANT)、AtEXP10、ARG0S、切cD3;l、AtGIF巧PAtGRFl。為了研究 BG1與調控水稻中植物細胞增殖和細胞擴張的基因之間的關系，使用定量RT-PCR來分析突 變體和野生型植株兩者中核細胞周期和細胞擴張調控子的轉錄水平。與野生型植株相比， Bgl-D幼穗中的調控細胞周期的G1至SI階段的基因和細胞擴張基因顯著上調（圖11)。運些 結果表明，BG1可通過調控生長素信號轉導或傳輸在細胞增殖和細胞擴張的控制中發揮新 的正向調控作用。
[0229] 實例8-BG1的表達提高增加了生物量并提高了谷物顆粒產量
[0230] 由于bgl-D中BG1的激活導致谷物顆粒尺寸增大和谷物顆粒重量增加，因此測試通 過BG1過表達是否可提高生物量和谷物顆粒產量。在稻田中生長時，過表達BG1的轉基因水 稻植株表現出成熟器官的干重顯著增加。相比之下，兩種獨立的BGl-RNAi轉基因植株(Ril 和化2)表現出生物量減小（圖19)。為了避免BG1的異位過表達，我們用由其天然啟動子驅動 的BG1基因組DNA過表達野生型植株中的BG1。與非轉基因對照植株相比，過表達BG1的轉基 因水稻表現出具有增大的谷物顆粒尺寸和更大的穗，但沒有其他顯著的罰分性狀(圖12A、B 和C)。轉基因株系0E-5、0E-7的每1000粒重量分別增加了 15.48%和25.38%，單株谷物顆粒 產量分別提高了6.69%和16.65%。（圖12D和E)。產量測試顯示，BG1表達提高的植株的谷物 顆粒產量比日本晴提高了約15 %至20 % (表A2)。總體看來，運些結果證明水稻中的BG1過表 達與生物量的增加和谷物顆粒產量的提高呈正相關。
[0231] 蛋白質序列和系統發育分析:水稻和擬南芥的BG1序列分別得自水稻標注項目數 據庫（http://rapdb.dna.aff;rc.go.jp/)和擬南芥信息資源（http:// WWW. arabidopsis . org/index. jsp)。使用ClustalX 1.83對蛋白質序列進行比對，并用 GeneDoc顯示保守的殘基化ttp: //www. nrbsc. org/gfx/genedoc/)。對于植株中的BG1同源 物的系統發育分析而言，通過國家生物技術信息中屯、（National Center for Biotechnology Informat ion, NCBI) BLAST研究獲得總共23個獨特的蛋白質序列，并用 Clus化1W程序進行比對。使用MEGA 4.0基于鄰接法來構建系統發育樹。利用500個平行測定 通過靴值分析來評估形貌穩定性。 腳。總體同一性（同一性％)-表2
[0233]空位形成罰分:8,空位延伸罰分:2
[02：34]_
[0237]~已結合各個具體的和優選的實施例和技術描述了本公開。然而，應當理解，在保持I 在本公開的實質和范圍內的情況下可W作出許多變化和修改。
【主權項】
1. 一種改善植物的農學特性的方法，所述方法包括調節以下多核苷酸的表達：（i)編碼 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 1中的一者具有至少95%同一性的氨基酸 序列的多核苷酸，（ii)在嚴格的雜交條件下與包含SEQ ID NO: 2的多核苷酸的片段雜交的 多核苷酸，其中所述片段包含SEQ ID N0:2的至少100個連續核苷酸，（iii)編碼與SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性的氨基酸序列的多核苷酸，（iv)編碼多肽的多核苷酸，與SEQ ID NO: 1相比所述多肽包含氨基酸的一個或多個缺失或插入或替換。2. 根據權利要求1所述的方法，其中通過用可操作地連接至異源啟動子的重組多核苷 酸轉化所述植物來提高編碼多肽的所述多核苷酸的表達，所述多肽與SEQ ID NO: 1具有至 少95%的同一性。3. 根據權利要求1所述的方法，其中通過上調與所述內源性多核苷酸可操作地結合的 調控元件的基因表達來提高編碼多肽的內源性多核苷酸的表達，所述多肽與SEQ ID NO: 1 具有至少95%的同一性。4. 根據權利要求1所述的方法，其中通過在SEQ ID N0:3的調控元件的調控下表達所述 多核苷酸來提高所述多核苷酸的表達。5. 根據權利要求1所述的方法，其中所述農學特性選自：（i)谷物顆粒尺寸增大，（ii)谷 物顆粒重量增加，（iii)穗長增大，（iv)谷物顆粒產量提高，（v)籽粒灌漿速率提高，（vi)生 物量增加。6. 根據權利要求1所述的方法，其中所述農學性能為在營養生長期和/或生殖期中的植 物生物量的增加。7. 根據權利要求1所述的方法，其中相對于所述多核苷酸的表達未提高的對照植物，所 述谷物顆粒重量增加。8. 根據權利要求1所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。9. 根據權利要求1所述的方法，其中所述植物是水稻或玉米。10. 根據權利要求1所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。11. 根據權利要求1所述的方法，其中所述植物是大豆。12. -種提高植物產量的方法，所述方法包括提高編碼多肽的多核苷酸的所述表達，所 述多肽包含選自SEQIDN0:1、SEQIDN0 :4-SEQIDN0:27的氨基酸序列或它們的等位基 因變體。13. -種提高水稻顆粒產量的方法，所述方法包括表達編碼多肽的多核苷酸，所述多肽 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其變體。14. 一種用于提高產量的植物標記輔助選擇方法，所述方法包括： a. 進行植物的標記輔助選擇，所述植物在編碼蛋白質的基因組區域中具有一個或多個 變異，所述蛋白質包含SEQ ID NO: 1或其變體或其調控序列；以及 b. 識別表現出更高產量的所述植物。15. -種識別一組水稻植株中與谷物顆粒產量提高相關的一個或多個等位基因的方 法，所述方法包括： a.評估一組水稻植株中的下列區域中的一個或多個等位基因變異：（i)基因組區域，所 述基因組區域編碼多肽或（ii)控制所述多肽的表達的所述調控區，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 1具有95%同一性的序列； b.獲得所述組中一個或多個水稻植株的提高的產量的表型值； C.將所述基因組區域中的所述等位基因變異與所述表型相關聯；以及 d.識別與產量提高相關的所述一個或多個等位基因。16. -種分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸（i)編碼包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4-SEQ ID N0:27中的一者的氨基酸序列或與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27中 的一者具有至少95%同一性的氨基酸序列，（ii)在嚴格的雜交條件下與選自SEQ ID N0:2 的多核苷酸的片段雜交，其中所述片段包含SEQ ID N0:2的至少100個連續核苷酸，（iii)編 碼與SEQ ID N0:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，（iv)編碼多肽的多核苷酸，與SEQ ID NO: 1相比所述多肽包含氨基酸的一個或多個缺失或插入或替換，其中所述多核苷酸編碼參 與谷物顆粒寬度、重量或產量調節的多肽。17. -種重組表達盒，所述重組表達盒包含根據權利要求16所述的多核苷酸，其中所述 多核苷酸可操作地連接至調控元件，其中所述表達盒在植物細胞中是有功能的。18. -種宿主細胞，所述宿主細胞包含根據權利要求17所述的表達盒。19. 一種轉基因植物，所述轉基因植物包含根據權利要求18所述的重組表達盒。20. -種轉基因植物部件，所述轉基因植物部件包括植物調控元件，所述植物調控元件 可操作地調控編碼多肽的多核苷酸的所述表達，所述多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列 或其變體或其同源物，其中所述調控元件與所述多核苷酸是異源的。21. 根據權利要求20所述的多核苷酸，其中調控所述表達的所述多核苷酸包含選自SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8的序列或其功能啟動子片段。22. -種用于提高產量的玉米植物標記輔助選擇方法，所述方法包括： a. 檢測多個玉米植株中的基因組區域或調控序列中的一個或多個基因變異，所述基因 組區域包含編碼選自SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 14的蛋白質或其變體的多核苷酸，所述調 控序列控制其所述多核苷酸的表達;以及 b. 將所述一個或多個變異與產量提高相關聯，從而選擇具有與更高產量相關的所述一 個或多個變異的所述玉米植株。23. -種識別一組玉米植株中與產量提高相關的一個或多個等位基因的方法，所述方 法包括： a. 評估一組玉米植株中的下列區域中的一個或多個基因變異：（i)編碼多肽的基因組 區域或（ii)控制所述多肽的表達的調控區，其中所述多肽包含選自SEQ ID N0:12-SEQ ID NO: 14的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 14具有95%同一性的序列； b. 獲得所述組中的一個或多個玉米植株的產量數據； c. 將編碼所述多肽的所述基因組區域中的或控制所述多肽的表達的所述調控區中的 所述一個或多個基因變異與產量相關聯，從而識別與產量提高相關的一個或多個等位基 因。24. 根據權利要求23所述的方法，其中所述一個或多個基因變異存在于所述多核苷酸 的編碼區中。25. 根據權利要求23所述的方法，其中所述調控區是啟動子元件。26. 根據權利要求23所述的方法，其中所述產量是谷物顆粒產量或種子產量。
【專利摘要】本發明公開了影響植物產量和其他農學特性的方法和組合物。還公開了提高水稻顆粒尺寸和顆粒產量的轉基因調節方法和標記輔助育種方法。BG1的表達提高導致谷物顆粒尺寸增大和產量提高。
【IPC分類】C07K14/415, C12N15/113, A01H5/00, C12N15/29, C12N15/82
【公開號】CN105683213
【申請號】
【發明人】儲成才, 劉林川, 童紅寧, 胡斌, 梁成真, 車榮會, 徐凡
【申請人】中國科學院遺傳與發育生物學研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年8月8日