55頁）W及Christou and Ford，（1995)Annals of Botany 75:407-413(化ristou和化rd，1995年，《植物學年鑒》，第75卷，第407-413頁）（水 稻）；Os joda，et al.，（ 1996)NaUire Biotech. 14:745-750(0s joda等人，1996年，《自然生物 技術》，第14卷，第745-750頁）；農桿菌介導的玉米轉化(美國專利5，981，840);碳化娃晶須 方法(Frame，et al.，（ 1994)Plant J. 6:941-948(Frame等人，1994年，《植物雜志》，第6卷， 第941-948頁））；激光方法(Guo,et al.,(1995)Physiologia Plantarum 93:19-24(Guo等 人，1995年，《植物生理學》，第93卷，第19-24頁））；超聲處理方法（Bao，et al.，（ 1997) 叫trasound in Medicine&Biology 23:953-959(Bao等人，1997年，《超聲在醫學和生物學 中的應用》，第 23 卷，第953-959 頁）；Finer and Finer, (2000 化 ett Appl Microbiol.30: 406-10(Finer和。1116'，2000年，《應用微生物學通訊》，第30卷，第406-410頁）；4111〇日}1，61 al.，（2001) J Exp Bot52 :1135-42(Amoah等人，2001年，《實驗植物學雜志》，第52卷，第 1135-1142頁））；聚乙二醇法化rens，et al.，（1982)Nature 296:72-77化rens等人，1982 年，《自然》，第296卷，第72-77頁））；單子葉植物和雙子葉植物細胞的原生質體可使用電穿 孔（Fromm, et al.,(1985)Proc.化tl .Acad. Sci .USA 82:5824-5828(Fromm等人，1985年， 《美國國家科學院院刊》，第82卷，第5824-5828頁））和顯微注射(Crossway，et al. ,(1986) Mol. Gen. Genet. 202:179-185(Crossway等人，1986年，《分子和普通遺傳學》，第202卷，第 179-185頁））轉化，運些文獻全部W引用的方式并入本文。
[0。0]農桿菌介導的轉化
[0131] 將表達載體引入植物中的最廣泛使用的方法是基于農桿菌的天然轉化系統。根瘤 農桿菌(A.tumefaciens)和毛根農桿菌(A.;rhizogenes)是植物病原性±壤細菌，其能遺傳 轉化植物細胞。根瘤農桿菌和毛根農桿菌各自的Ti和Ri質粒攜帶負責植物的遺傳轉化的基 因。參見例如Kado，（ 1991 )Crit.Rev.Plant Sci . 10: UKado，1991 年，《植物科學評論》，第 10 卷，第1頁）。如下文獻提供了有關用于農桿菌介導的基因轉移的農桿菌載體系統和方法的 描述:Gruber等人（出處同上）；Miki等人（出處同上）和Moloney,et al(1989)Plant Cell R巧orts 8:238(Molon巧等人，1989年，《植物細胞報道》，第8卷，第238頁）。
[0132] 相似地，可將基因插入源于根瘤農桿菌或毛根農桿菌各自的Ti或Ri質粒的T-DNA 區中。因而，可使用運些質粒，如上構建表達盒。已知許多控制序列，其在偶聯至異源編碼序 列并轉化進宿主生物體中時，在原始編碼序列的組織/器官特異性方面顯示出基因表達的 保真性。參見例如Benfey and 化ua,(1989)Science 244:174-81(Benfey和化ua，1989年， 《科學》，第244卷，第174-181頁）。用于運些質粒中的特別合適的控制序列是用于基因在各 種祀植物中的組成型葉特異性表達的啟動子。其他可用的控制序列包括來自姻脂氨酸合酶 基因(N0S)的啟動子和終止子。N0S啟動子和終止子存在于質粒PARC2中，該質粒可得自美國 典型培養物保藏中屯、，指定的ATCC存放號為67238。如果使用運樣一種系統，則來自Ti或Ri 質粒的毒力(vir)基因也必須存在，或者與T-DNA部分一起，或者經由其中vir基因存在于單 獨載體上的雙元系統。運類系統、在其中使用的載體w及轉化植物細胞的方法在w下專利 和文獻中有描述：美國專利No. 4,658，082; 1986年10月1日提交的美國專利申請No. 913， 914,如在1993年11月16日公布的美國專利No. 5,262,306中引用的；和Simpson，et al.， (1986)Plant Mol. Biol. 6 :403-15( Simpson等人，1986年，《植物分子生物學》，第6卷，第 403-415頁）（也在' 306專利中引用）中有所描述，所述文獻全文均W引用方式并入本文。
[0133] -旦轉化，可將運些細胞用于再生轉基因植物。例如，可通過使該植物產生傷口， 然后將載體引入該傷口位點中來用運些載體感染整個植物。可使植物的任何部分產生傷 口，所述部分包括葉、莖和根。或者，可將外植體形式的植物組織諸如子葉組織或葉圓片用 運些載體接種，并在促進植物再生的條件下培養。可將根或苗用作植物組織的來源，所述根 或苗通過用毛根農桿菌或根瘤農桿菌(含有編碼伏馬毒素降解酶的基因）接種植物組織而 轉化，W經由體細胞胚胎發生或器官發生來再生伏馬毒素抗性轉基因植物。再生植物組織 的此類方法的例子公開于化址 111，（1985)化6〇'.4991.661161.69:235-40(5}1曰}1111，1985年， 《理論和應用遺傳學》，第69卷，第235-240頁）；美國專利No. 4，658，082; Simpson等人，出處 同上；W及均于1986年10月1日提交的美國專利申請No. 913,913和No. 913,914,如公布于 1993年11月16日的美國專利No. 5，262，306所引用，將上述文獻的全部公開內容W引用方式 并入本文。
[0134] 直接基因轉移
[0135] 盡管農桿菌介導的轉化的宿主范圍廣泛，但一些主要的谷類作物物種和裸子植物 總體上對該基因轉移模式而言是頑樹的，盡管最近已在水稻中獲得了一定的成功化iei，et al.，（1994)The Plant Journal 6:271-82化iei等人，1994年，《植物雜志》，第6卷，第271- 282頁））。已開發了植物轉化的幾種方法(統稱為直接基因轉移)作為對農桿菌介導的轉化 的替代方案。
[0136] 一般適用的植物轉化方法是微拋射體(mi cropro jectile)介導的轉化，其中DNA攜 帶在測量為約的微拋射體的表面上。用基因槍裝置(biolistic device)將表達載體 引入植物組織中，該基因槍裝置將微拋射體加速至300-600m/s的速度，該速度足W穿透植 物細胞壁和膜（Sanford，et al .，（ 1987)Part. Sci . Technol. 5: 27(Sanford等人，1987年， 《顆粒科學與技術》，第5卷，第27頁）；Sanford，（ 1988 )Trends Biotech 6: 299 (Sanford， 1988 年，《生物技術趨勢》，第6卷，第 299頁）；Sanford, (1990 )Physiol. Plant 79:206 (Sanford, 1990年，《植物生理學》，第79卷，第206 頁）和Klein, et al .，（ 1992) Biotechnology 10:268化lein等人，1992年，《生物技術》，第10卷，第268頁））。
[0137] 物理遞送DNA至植物的另一種方法是如Zang,et al. , (1991)BioTechnology 9: 996 (Zang等人，1991年，《生物技術》，第9卷，第996頁）中所述的對祀細胞的超聲處理。或者， 脂質體或原生質球融合已用于將表達載體引入植物中。參見例如Deshayes，et al.，（1985) EMBO J.4:2731(Deshayes等人，1985年，《歐洲分子生物學組織雜志》，第4卷，第2731頁）和 Qiristou, et al. , (1987)P;roc.化tl. Acad. Sci . USA84:3962(Qiristou等人，1987年，《美國 國家科學院院刊》，第84卷，第3962頁）。利用化Cl2沉淀、聚乙締醇或聚-k鳥氨酸直接將DNA 攝入原生質體中也已有報道。參見例如化in，et al.，（1985)Mol .Gen.Genet. 199:161化ain 等人，1985年，《分子和普通遺傳學》，第199卷，第161頁）和Draper，etal.，（1982)Plant Cell Physiol. 23:451 (Draper等人，1982年，《植物細胞生理學》，第23卷，第451頁）。
[0138] 原生質體和完整細胞和組織的電穿孔也已有描述。參見例如Donn，et al. ,(1990) Abstracts of the Vllth Int'1.Congress on Plant Cell and Tissue Culture lAPTC, A2-38，p. 53(Donn等人，1990年，《第Vn屆植物細胞與組織培養lAPTC會議摘要》，A2-38，第 53頁）；D'化lluin，et al.，（1992)Plant Cell4:1495-505(D'化Iluin等人，1992年，《植物 細胞》，第4卷，第 1495-1505 頁）和Spencer，et al.，（1994)Plant Mol. Biol. 24:51-61 (Spencer等人，1994年，《植物分子生物學》，第24卷，第51-61頁）。
[0。9] 1.基于多核巧酸的方法:
[0140] 在本公開的一些實施例中，用表達盒轉化植物，該表達盒能夠表達抑制本公開的 OsBGl表達的多核巧酸。本文所用的術語"表達"指基因產物的生物合成，包括所述基因產物 的轉錄和/或翻譯。例如，出于本公開的目的，能夠表達多核巧酸的表達盒(所述多核巧酸抑 審IJ至少一種硝酸鹽攝取相關的多膚的表達)是能夠產生RNA分子的表達盒(所述RNA分子抑 制本公開的至少一種硝酸鹽攝取相關的多膚的轉錄和/或翻譯）。蛋白質或多膚從DNA分子 的"表達"或"產生"指該編碼序列的轉錄和翻譯W產生該蛋白質或多膚，而蛋白質或多膚從 RNA分子的"表達"或"產生"指該RNA編碼序列的翻譯W產生蛋白質或多膚。
[0141] 可抑制OsBGl表達的多核巧酸的例子在下面給出。
[01創 i.有義抑制/共抑制
[0143] 在本公開的一些實施例中，OsBGl表達的抑制可通過有義抑制或共抑制來獲得。對 于共抑制，將表達盒設計為表達運樣的RNA分子，該RNA分子有義"取向對應于編碼OsBGl 的信使RNA的全部或部分。該RNA分子的過表達可導致天然基因的表達減少。因此，對用該共 抑制表達盒轉化的多個植株系進行篩選W鑒別那些顯示出對硝酸鹽攝取相關的多膚表達 的最大抑制的植株。
[0144] 用于共抑制的多核巧酸可對應于編碼硝酸鹽攝取相關多膚的序列的全部或部分、 OsBGl轉錄物的5'和/或3'非翻譯區的全部或部分、或者編碼OsBGl的轉錄物的編碼序列和 非翻譯區二者的全部或部分。在其中該多核巧酸包含硝酸鹽攝取相關多膚的編碼區的全部 或部分的一些實施例中，將表達盒設計為消除該多核巧酸的起始密碼子，使得不會翻譯出 蛋白質產物。
[0145] 共抑制可用來抑制植物基因的表達W產生對于由運些基因編碼的蛋白質而言具 有不可檢測的蛋白質水平的植物。參見例如化〇in，et al.，（2002)Plant Cell 14:1417- l432(Broin等人，2002年，《植物細胞》，第14卷，第1417-1432頁）。共抑制還可用來抑制同一 植物中的多種蛋白質的表達。參見例如美國專利No. 5，942，657、使用共抑制來抑制植物中 的內源性基因的表達的方法在W下文獻和專利中有描述：Flavell，et al.，（1994) Proc. Nat 1. Acad. Sci . USA91:3490-3496 (Flave 11 等人，1994年，《美國國家科學院院刊》，第 91卷，第3490-3496頁）；Jorgensen，et al.，（1996)Plant Mol.Biol.31:957-973 (Jorgensen等人，1996年，《植物分子生物學》，第31卷，第957-973頁）；Johansen and Carrington, (2001 )Plant F*hysiol. 126:930-938(Johansen和化rrington，2001 年，《植物 生理學》，第126卷，第930-938頁）；化oin，et al.，（2002)Plant Cell 14:1417-1432(^oin 等人，2002年，《植物細胞》，第14卷，第1417-1432頁）；Stout jesdUk，et al.，（2002)Plant 曲 ysiol. 129 :1723-1731 (Stout jesdijk 等人，2002年，《植物生理學》，第 129卷，第 1723- 1731 頁）；化，et al.，（2003)Phytochemistry 63:753-763(化等人，2003年，《植物化學》，第 63卷，第 753-763頁）W及美國專利No. 5，034，323、No. 5，283，184和No. 5，942，657，將運些文 獻和專利的每一個W引用方式并入本文。共抑制的效率可通過在表達盒中在有義序列的3 ' 位置和多腺巧酸化信號的5'位置包括poly-dT區來提高。參見第2002/0048814號美國專利 公布，將其W引用的方式并入本文。通常，運種核巧酸序列與內源性基因的轉錄物的序列具 有基本上的序列同一性，優選的是大于約65%的序列同一性，更優選的是大于約85%的序 列同一性，最優選的是大于約95 %的序列同一性。參見第5，283，184號和第5，034，323號美 國專利，將它們W引用的方式并入本文。
[0146] ii.反義抑制
[0147] 在本公開的一些實施例中，對硝酸鹽攝取相關多膚表達的抑制可通過反義抑制獲 得。對于反義抑制，將表達盒設計為表達與編碼該硝酸鹽攝取相關多膚的信使RNA的全部或 部分互補的RNA分子。該反義RNA分子的過表達可導致天然基因的表達減少。因此，對用反義 抑制表達盒轉化的多個植株系進行篩選W鑒別那些顯示出對硝酸鹽攝取相關多膚表達的 最大抑制的植株。
[014引 iii.雙鏈RNA干擾
[0149] 在本公開的一些實施例中，對OsBGl表達的抑制可通過雙鏈RNA(dsRNA)干擾來獲 得。對于dsRNA干擾，有義RNA分子(如上文針對共抑制所描述)和與該有義RNA分子完全或部 分互補的反義RNA分子在同一細胞中表達，從而導致對應的內源性信使RNA的表達的抑制。
[0150] 有義和反義分子的表達可通過將表達盒設計為同時包含有義序列和反義序列來 實現。或者，可將單獨的表達盒分別用于有義序列和反義序列。使用dsRNA干擾來抑制內源 性植物基因的表達的方法在W下文獻和專利中有描述：Waterhouse, et al. ,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci . USA 95:13959-13964(Waterhouse等人，1998年，《美國國家科學院院 刊》，第95卷，第 13959-13964頁），Liu，et al.，（2002)Plant 曲ysiol. 129:1732-1743(Liu 等人，2002年，《植物生理學》，第129卷，第 1732-1743頁）W及W099/49029、W0 99/53050、W0 99/61631和WO 00/49035，將每個文獻和專利W引用方式并入本文。
[0巧。i V.發夾RNA干擾和含內含子的發夾RNA干擾
[0152] 在本公開的一些實施例中，對OsBGl表達的抑制可通過發夾RNA化pRNA)干擾或含 內含子的發夾RNA(ihpRNA)干擾來獲得。運些方法在抑制內源性基因表達方面是高度有效 的。參見Waterhouse and Helliwell, (2003)化t. Rev .Genet. 4: 29-38(Wate;rhouse和 化11 iwel 1，2003年，《自然綜述遺傳學》，第4卷，第29-38頁)及其中引用的參考文獻。
[0153] 對于hpRNA干擾，將表達盒設計為表達運樣的RNA分子，該RNA分子自身雜交而形成 包括單鏈環區和堿基配對莖的發夾結構。該堿基配對莖區包含對應于編碼要對其表達進行 抑制的基因的內源性信使RNA的全部或部分的有義序列和與該有義序列完全或部分互補的 反義序列。或者，堿基配對莖區可對應于控制待抑制的基因的表達的啟動子序列的一部分。 因此，該分子的堿基配對莖區通常確定了 RNA干擾的特異性。hpRNA分子在抑制內源性基因 表達中很高效，它們誘導的RNA干擾被植物后代繼承。參見例如畑uang and Meyerowitz (2000)Proc. Nat 1. Acad. Sci . USA 97:4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美國國家 科學院院刊》，第97卷，第4985-4990頁）；Stoutjesdi jk，et al .，（2002)Plant 曲 ysiol. 129 :1723-1731 (Stout jesdijk 等人，2002年，《植物生理學》，第 129卷，第 1723- 1731頁）W及Waterhouse and Helliwell, (2003)化t .Rev.Genet .4: 29-38(Wate;rhouse和 化11 iwel 1，2003年，《自然綜述遺傳學》，第4卷，第29-38頁）。使用hpRNA干擾來抑制或沉默 基因表達的方法在例如W下文獻和專利中有描述：Chuang and Meye;rowitz,(2000) Proc.化tl. Acad. Sci . USA97 :4985-4990(化uang和Meyerowitz，2000年，《美國國家科學院 院刊》，第97卷，第4985-4990頁）；Stout jesdi_jk，et al.，（2002)Plant I^ysiol. 129:1723- 1731 (Stout jesdijk 等人，2002年，《植物生理學》，第 129卷，第 1723-1731頁）；Waterhouse and Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然綜 述遺傳學》，第4卷，第29-38頁）；Pandolfini et al.,BMC Biotechnology 3:7(Pandolfini 等人，《BMC生物技術》，第3卷，第7頁）W及美國專利申請公布No. 2003/0175965，每個文獻和 專利W引用方式并入本文。hpRNA構建體沉默體內基因表達的效率的瞬時測定法已在W下 文獻中描述：Panstruga，et al.，（2003)Mol.Biol.R邱.30:135-140(Panstruga等人，2003 年，《分子生物學報道》，第30卷，第135-140頁），所述專利和文獻W引用方式并入本文。
[0154] 對于ihpRNA，干擾分子具有與hpRNA相同的總體結構，但該RNA分子另外包含內含 子，該內含子能夠在表達該ihpRNA的細胞中被剪接。內含子的使用使得發夾RNA分子中的環 的大小在剪接后最小化，運提高了干擾的效率。參見例如，Smith，et al.，（ 2000)化ture 407:319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320頁）。事實上，Smith等人展示 了使用化pRNA介導的干擾百分之百抑制了內源性基因表達。使用ihpRNA干擾來抑制內源性 植物基因的表達的方法例如在W下文獻和專利中有描述：Smi th，et a 1.，（ 2000) Nature 407:319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320頁）；Wesl巧，et al. ,(2001) Plant J.27:581-590(Wesl巧等人，2001 年，《植物雜志》，第27卷，第581-590頁）；Wang and Waterhouse, (2001 )Qi;r;r. Opin. Plant Biol. 5:146-150(Wang和Waterhouse，2001年，《植物 生物學新見》，第5卷，第146-150頁）；Wate;rhouse and Helliwell(2003)化t.Rev.Genet.4: 29-38 (Waterhouse和Hell iwell ,2003年，《自然綜述遺傳學》，第4卷，第29-38頁）； Helliwell and Waterhouse,(2003)Methods 30:289-295巧elliwell和Waterhouse,2003 年，《方法》，第30卷，第289-295頁）W及美國專利申請公布No. 2003/0180945，每個文獻和專 利W引用方式并入本文。
[0155] 還可對用于hpRNA干擾的表達盒進行設計，使得有義序列和反義序列不對應于內 源性RNA。在運個實施例中，該反義和有義序列在運樣的環序列的旁側，該環序列包含對應 于祀基因的內源性信使RNA的全部或部分的核巧酸序列。因而，是環區決定了 RNA干擾的特 異性。參見例如W002/00904;Mette，etal.，（2000化MB0J 19:5194-5201(Mette等人，2000 年，《歐洲分子生物學組織雜志》，第19卷，第5194-5201頁）；Matzke，et al.，（2001) Qirr.Opin.Genet.Devel. 11:221-227(Matzke等人，2001年，《遺傳學與發育新見》，第11卷， 第221-227頁）；Scheid，et al.，（2002)Proc.化tl.Acad.Sci.，USA 99:13659-13662 (Scheid等人，2002年，《美國國家科學院院刊》，第99卷，第13659-13662頁）；Aufsaftz，et al.，（2002)Proc.化t'l.Acad.Sci.99(4):16499-16506(Aufsaftz等人，2002年，《美國國家 科學院院刊》，第99卷，第4 期，第16499-16506頁）；Sijen，et al.，Curr.Biol. (2001)11: 436-440(Sijen等人，《當代生物學》，2001年，第11卷，第436-440頁）），運些文獻和專利W引 用方式并入本文。 郵]V.擴增子介導的干擾
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