療病癥的方法，其中在優選的實施方案中，該組合物包括一種或多 種Toso抗體。
[0172] 在一個具體實施方案中且根據任何上述內容，本發明提供了通過用包括Toso抗體 的組合物治療有需要的受試者來治療病癥的方法。不受理論束縛，Toso抗體有效治療運些 病癥的一種潛在機制是通過調節Toso活性。在某些實施例中，根據本發明治療病癥的方法 包括施用治療有效量的本文中所描述的任何Toso抗體，包括了包含SEQ ID NO: 1-62中的任 何一個或多個或其任何變體的抗體。在其他實施方案中，用于治療病癥(包括糖尿病、多發 性硬化、哮喘和癌癥）的可溶性Toso蛋白包括了包含與SEQ ID NO: 1-28中的任一個具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的 重鏈或輕鏈序列的抗體。所述抗體可W根據本文中所描述的方法進行進一步修飾，包括化 學修飾，W用于治療本文中所描述的任何病癥。
[0173] 在其他方面，本發明設及通過向受試者施用Toso抗體或其變體來治療病癥和疾病 的方法。本發明的抗體可用于治療罹患不限于W下各項疾病的受試者：自身免疫性病癥(包 括但不限于1型糖尿病、多發性硬化或類風濕性關節炎）、2型糖尿病、哮喘、過敏、慢性阻塞 性肺病rCOP護）、高IgM綜合征、狼瘡、癌癥或中性白細胞增多相關病癥(包括但不限于中性 粒細胞減少、嚴重先天性中性粒細胞減少、環形中性粒細胞減少、抗體介導的中性粒細胞減 少、網狀細胞發育不全、白細胞粘附缺陷、家族性骨髓增生性疾病、慢性骨髓性白血病、家族 性冷激性等麻疹和白細胞增多W及慢性肉芽腫病）。如應了解，本文中所描述的任何Toso抗 體可W呈單獨或任何組合形式用于治療運些病癥或疾病中的任一種。
[0174] 如W上所討論，在一些實施方案中，本發明的可溶性Toso蛋白被用于治療癌癥。在 其他實施方案中，根據本發明治療癌癥的方法包括通過調節Toso活性來抑制腫瘤侵襲和/ 或轉移的方法。在示例性實施方案中，本發明的組合物用于在有需要的受試者中治療腺癌、 白血病、淋己瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或崎胎癌組群中任一種。在其他實施方案中，本發明 的組合物用于治療罹患腎上腺、膀脫、骨、骨髓、腦、胸部、頸、膽囊、神經節、胃腸道、屯、臟、 腎、肝臟、肺、肌肉、卵巢、膜臟、副甲狀腺、陰莖、前列腺、唾液腺、皮膚、脾、睪丸、胸腺、甲狀 腺或子宮中的一個或多個中的癌癥的受試者。
[0Π 日]實施例1:人類原生隧菌體scFv文庫構建
[0176] 外周血單核細胞(PBMC)是獲自捐贈和市售血樣。使用Ficoll-paque TM化US(GE Healthcare)分離PBMC。然后使用Trizol分離總RNA與所分離的PBMC，然后使用得自于To化1 RNA Pr巧S(Ambion)的mRNA純化用Dyiiafeeads蠻mRNA純化試劑盒從總RNA中純化mRNA。 [ΟΠ 7]使用RT-PCR用Superscript III第一股合成系統（Invitrogen)由mRNA進行第一股 cDNA合成。匯集cDNA文庫且測量濃度。
[0178] 使用60至90ng cDNA作為模板和2.5μ1所提供的各恒定和可用區DNA引物組1 (F2000，Progen)、2扣12XterraPCR緩沖劑、lμlterra聚合酶混合物，W50μl的總體積分 別擴增可變κ、λ和丫鏈基因。PCR條件:95°C，30秒(變性）；55°C，lmin(退火）；和75°C，lmin (延長），總計30個循環。在第一個循環開始時，將反應混合物在95°C下解育3min且在最后一 個循環結束時在75°C下解育5min。
[0179] 為了引入限制位點，在含有W下各物的總計50μ1中進行PCR:lyl可變基因 PCR產物 (分別使用κ、λ和丫鏈基因作為模板）、2.扣1所提供的各恒定和可變區DNA引物組2(F2000， Progen)、2化1 2XterraPCR緩沖劑、1μ1 terra聚合酶混合物。PCR條件：95°C，30秒（變性）； 57°C，lmin(退火）；和75°C，lmin(延長），總計14個循環。在第一個循環開始時，在95°C下解 育3min且在最后一個循環結束時在75°C下解育5min。使用凝膠DNA提取試劑盒(Clontech) 純化PCR產物。匯集分別經純化的κ、λ和丫 DM。
[0180] 通過W下方式將輕鏈DNA克隆到隧菌粒載體PSEX81中：通過添加25μ1緩沖液Η、化1 Notl (40ιι/μ1)和0.化1 RNA酶Α( lOyg)消化lOyg隧菌粒載體PSEX81 (Progen)，總體積是22化 1。混合并且在37°C下解育8min，隨后加入20μ1 MluI(lOuAU)，在37°C下解育6min。在那之 后，添加堿性憐酸酶（CIP)且在37°C下繼續解育15分鐘。然后，添加0.25μ1 0.5M pH 8.0EDTA，隨后在65°C下解育20min。使混合物在凝膠上跑電泳且切下含有MluI/NotI- pSEXSl片段的凝膠帶并使用凝膠DM提取試劑盒進行提取。然后通過添加7.化1緩沖液Η、 0.9μ1 Notl (40ιι/μ1)分別消化1.扣g所匯集的Κ和所匯集的λ鏈PCR產物，在37°C下解育 2〇111111，然后添加化111111(1〇11/41)，隨后在37°(：下進一步解育40分鐘。用1.5%瓊脂糖凝膠 對反應產物進行跑電泳且切下40化P的條帶并使用凝膠DNA提取試劑盒進行純化。使用介于 1:1與1:3之間的摩爾比將經消化的載體(PSEX81)和插入物(K或λ可變鏈基因）連接。反應混 合物包括50ng DNA、1U Τ4連接酶、連接緩沖劑和此0，最終體積是15μ1。在16 °C下解育過夜 之后，通過添加1 /10體積的3M乙酸鋼、20yg糖原、2.5倍體積的絕對乙醇使DNA沉淀。在-20°C 下解育1.5小時，隨后通過在13，000巧m下離屯、30分鐘使沉淀物沉降。用80%乙醇將球粒洗 涂至少兩次，然后允許球粒在室溫下干燥。使經過干燥的球粒再懸浮于2至化1肥0中。
[0181] 然后通過W下方式將重鏈DNA克隆到含有輕鏈DNA的PSEX81載體中：分別用10μ1 Hindlll(lOu/μΙ)、25μ1緩沖液Η、0.扣1 RNA酶Α(lOyg)消化lOyg含輕鏈的載體(Κ-Ρ沈Χ81 和 λ-pSEXSl)，總體積是230μ1，在37°C下解育20min，然后添加10μ1 NcoKlOu/μΙ)，然后在37 °C下解育90分鐘。用于消化載體的其余程序與上文所述相同。為了消化重鏈插入物，用 7.5ul 10X緩沖液H、2.7ul Hindm(10u/ul)、4ul Ncol(10u/ul)消化化g所匯集的丫鏈 PCR產物，總體積是7扣1，隨后在37°C下解育4小時，然后在65°C下解育20min。使用凝膠DNA 提取試劑盒純化經過消化的DNA。如上所述完成DNA的連接和沉淀。
[0182] 通過W下方式建立文庫儲備液:將1.扣1的一種連接反應物用于40μ1電感受態大 腸桿菌化-藍(Stratagene)的電穿孔。將連接DNA文庫的各轉化接種到S0B-GA瓊脂板上且在 30°C下解育過夜。將6ml2XYT-GA培養基添加至各板并且將細菌刮到培養基中。匯集細胞并 且制成甘油儲備液。
[0183] 實施例2:文庫的生物淘選
[0184] 在37°C下在W25化pm振蕩的情況下使接種培養物生長，直至達到Asgg為0.1。添加 M13K07輔助隧菌體，然后在37°C下在不振蕩的情況下將培養物解育15分鐘，然后在37°C下 在W25化pm振蕩的情況下解育1小時。在1500g下使細胞球粒化lOmin，然后再懸浮于400ml 2 X YT-AK培養基中。在30°C下在W25化pm振蕩的情況下使懸浮液生長過夜。旋轉培養物，然 后使用PEG溶液使隧菌體沉淀。測定隧菌體的效價。可W制造甘油儲備液或文庫可W直接用 于淘選。
[018引 nunc 96孔板中兩個孔涂布有200μ1/孔含100μg/ml經純化的Toso-Fc的PBS溶液； 兩個孔涂布有 200μ1 100μg/ml rhIgG Fc(Sino Biological Inc.);向另2個孔中添加 200μ 1 5%牛奶PBS(MPBS)(無抗原），并且在4°C下將板解育過夜。
[0186] 從原生文庫中取出0.6ml l〇i2p化/ml隧菌體到1.5ml管中，向管中加入蛋白G珠粒， 然后在4Γ下在旋轉下將管子解育過夜。
[0187] 次日早晨倒空Toso-Fc涂布的孔且用PBST洗涂3次，并且用250ul 5%MPBS阻斷，隨 后在室溫下解育2小時。
[0188] 將rhIgG Fc(Sino Biological Inc.)涂布的孔倒空。對隧菌體-蛋白G珠粒溶液進 行離屯、并且將10化1上清液轉移到兩個rhIgG化涂布的孔中的每一個中。W10化1/孔加入 lOOug/ml rhIgG Fc(Sino Biological Inc.)，且在室溫下解育 1 小時。
[0189] 將未經蛋白質涂布的孔倒空且將隧菌體溶液個別地轉移到未經蛋白質涂布的孔 并且在室溫下解育1小時。
[0190] 從Toso-Fc涂布的孔中去除阻斷緩沖液，然后用PBST洗涂若干次。將20化1隧菌體 溶液轉移到Toso-Fc涂布的孔并且在室溫下解育1.5小時。
[0191] 將Toso-Fc涂布的孔倒空，并且用PBST洗涂若干次。通過向兩個孔中的每一個中加 入20化1 1 ΟΟπιΜΞ乙胺隨后解育10分鐘來洗脫隧菌體。
[0192] 將洗脫的隧菌體轉移到2X1.5ml含有800ul 1Μ化is-HCl(抑7.5)的管中^中和 抑值。
[0193] 使用2 XlOul洗脫的隧菌體來進行滴定。將其余洗脫的隧菌體用于感染10ml新鮮 TG1細胞(0〇6〇〇 = 0.4)。將200ul的運種樣品散布在含有lOOul/ml氨節青霉素和1%葡萄糖的 2χΥΤ瓊脂板上，在32°C下生長過夜。在37°C下在W25化pm振蕩的情況下將其余被感染的細 胞解育1小時，此后用含有lOOug/ml amp的2χΥΤ培養基將體積增至110ml，隨后在37°C下在 W 25化pm振蕩的情況下解育。
[0194] 將M13K07輔助隧菌體（100μΙ l〇i2p化)加入到被感染的培養物中且也在37°C下生 長，還向培養物中加入卡那霉素，最終濃度是50μg/ml。在37°C下在W25化pm振蕩的情況下 將運種培養物解育過夜，W用于下一輪淘選。
[0195] 盡管上文已經在某種詳細程度上或參考一個或多個個別方面描述了運種技術的 不同方面，但本領域技術人員可W對所公開的方面進行許多變化而不背離此技術的精神或 范圍。因為許多方面可W在不背離本發明所描述的技術的精神和范圍的情況下進行，但適 當的范圍存在于W下所附的權利要求書中。因此涵蓋其他方面。此外，應理解，除非另外明 確要求或權利要求書的措辭內在地使得有必要按特定順序，否則任何操作都可W按任何順 序進行。意在W上描述中所含有的和附圖中所示出的所有物質都應解釋為僅說明具體方面 且不限于所示的實施方案。除非從上下文顯而易見或明確陳述，否則本文中所提供的任何 濃度值一般相對于混合物值或百分比給出，而不考慮添加混合物的特定組分時或之后發生 的任何轉化。在未明確并入本文中的程度上，本公開內容中所提及的所有公開參考文獻和 專利文件都出于所有目的W全文引用的方式并入本文中。可W在細節或結構上進行變化而 不背離如W下權利要求書中所定義的本發明技術的基本要素。
【主權項】
1. 一種抗體，其包含含有SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57 中的任一個的重鏈可變區。2. -種抗體，其包含具有與SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、 31、 33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57 中的任一個具有至少約 95% 序列同一性的 序列的重鏈可變區，其中所述抗體結合Toso。3·-種抗體，其包含含有SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58中的任一個的輕鏈可變區。 4·一種抗體，其包含具有與SEQIDN0 :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58中的任一個具有至少約95%序列同一 性的序列的輕鏈可變區，其中所述抗體結合Toso。5. -種抗體，其包含:第一重鏈⑶R，其包含表1中所列出的⑶R1序列中的任一個;第二 重鏈⑶R，其包含表1中所列出的⑶R2序列中的任一個;第三重鏈⑶R，其包含表1中所列出的 ⑶R3序列中的任一個;第一輕鏈⑶R，其包含表2中所列出的⑶R1序列中的任一個;第二輕鏈 CDR，其包含表2中所列出的CDR2序列中的任一個;和第三輕鏈CDR，其包含表2中所列出的 ⑶R3序列中的任一個，其中所述抗體結合Toso。6. 如上述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。7. -種核酸，其編碼如上述權利要求中任一項所述的抗體。8. -種表達載體，其中所述表達載體編碼根據權利要求1至5所述的抗體。9. 一種制造根據權利要求1至5所述的抗體的方法，所述方法包括提供包含編碼所述抗 體的核酸的細胞，其中在適合于表達所述抗體的條件下培養所述細胞。10. -種治療Toso相關疾病的方法，所述方法包括用根據權利要求1至5所述的抗體治 療有需要的受試者。
【專利摘要】本發明提供了用于調節TOSO活性以及治療牽涉TOSO的疾病和病癥的方法和組合物。所述方法和組合物包括使用一種或多種結合TOSO蛋白或TOSO蛋白配體的抗體。
【IPC分類】A61K39/395, C07K16/28, C07K16/46, C12P21/08, C12N15/63, C12N15/13
【公開號】CN105683218
【申請號】
【發明人】T.W.馬克, X.賴, M.W.圖舍
【申請人】大學保健網絡
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年7月2日