產生轉基因禾本科細胞和植物的方法

專利名稱：產生轉基因禾本科細胞和植物的方法
技術領域：
本發明涉及用于產生源自禾本科植物的轉基因細胞以及源自所述轉基因細胞的轉基因組織、器官、植物和種子。本發明也涉及這些轉基因細胞、組織、器官、植物和種子在農業、植物育種中的用途以及工業應用。

背景技術：
概述 本說明書包含用3.3版PatenIn制備出的核酸和氨基酸序列信息。在序列列表中，用數字指示符<210>和緊接其后的序列標識符(例如<210>1、<210>2、<210>3等)標識出每個核苷酸序列。通過在數字指示符部分<211>、<212>和<213>給出的信息分別標識出每個核苷酸序列的序列長度和類型(DNA、蛋白(PRT)等)以及來源生物體。用術語“SEQ ID NO”和緊接其后的序列標識符定義出本說明書提到的核苷酸序列(例如SEQ ID NO1指的是在序列列表中被稱作<400>1的序列)。
對在此提到的核苷酸殘基的命名是IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的命名，其中A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鳥嘌呤，T代表胸腺嘧啶，Y代表嘧啶殘基，R代表嘌呤殘基，M代表腺嘌呤或胞嘧啶，K代表鳥嘌呤或胸腺嘧啶，S代表鳥嘌呤或胞嘧啶，W代表腺嘌呤或胸腺嘧啶，H代表除鳥嘌呤外的其他核苷酸，B代表除腺嘌呤外的其他核苷酸，V代表除胸腺嘧啶外的其他核苷酸，D代表胞嘧啶外的其他核苷酸，以及N代表任一種核苷酸殘基。術語“源自”在此應當用于表示可以從特定來源中獲得所特指的事物，盡管不必一定是從所述來源直接獲得的。
除非上下文中有其他的要求，在本說明書的全文中，詞語“包括”或“包含”都要被理解成表示包括所述的步驟或元件或事物或步驟或元件或事物的組，但是并不排除任何其他的步驟或元件或事物或步驟或元件或事物的組。
除非有特殊的說明或者上下文中有其他的要求，在本說明書的全文中，單一步驟、物質組合物、步驟的組或物質組合物的組都應當包括一個和多個(即一個或多個)這些步驟、物質組合物、步驟的組或物質組合物的組。
除非有其他特定的說明，在此所述的每個實施方式都可以經必要的調整應用到每個其他的實施方式中。
此外，在此所述的關于禾本科植物或其禾本植物或其部分(例如籽粒或種子)或其子代的實施方式都應當經必要的調整應用到小麥(例如小麥植物或小麥植物部分或小麥植物的子代)。
就涉及一種或多種禾本科植物、植物種類或植物種類的品種的任何實施方式而言，在此所述的本發明能夠單獨地涉及和要求保護一種特殊的禾本科植物、植物種類或品種，并可與任何其他禾本科植物、植物種類或品種相區分，而無需具體提及涉及該種具體禾本科植物、植物種類或品種的實施方式。這樣做的條件是該要求保護的所述禾本科植物、植物種類或品種已經在本發明的任何實施方式中被具體地提及。
就涉及細菌用途的任何實施方式而言，在此所述的本發明能夠單獨地涉及和要求保護一種細菌，并可與任何其他細菌相區分，而無需具體提及涉及該種具體細菌的實施方式。這樣做的條件是該要求保護的所述細菌已經在本發明的任何實施方式中被具體地提及。
就涉及用于向胚細胞內引入核酸的任一方法的任何實施方式而言，在此所述的本發明能夠單獨地涉及和要求保護一種用于向胚細胞內引入核酸的具體方法，并可與任何其他用于向胚細胞內引入核酸的方法相區分，而無需具體提及涉及該種用于向胚細胞內引入核酸的具體方法的實施方式。這樣做的條件是該要求保護的所述用于向胚細胞內引入核酸的方法已經在本發明的任何實施方式中被具體地提及。
本領域人員明白在此所述的方法可以進行除了具體描述的那些變化和修飾外的變化和修飾。要明白本發明包括所有的這些變化和修飾。本發明也包括本說明書單個地或共同地提及的或標明的所有步驟、性能、組合物和化合物以及任何兩個或多個所述步驟或性能的任一組合和所有組合。
本發明的范圍并不受在此所述的具體實施方式
的限制，所述具體實施方式
只是用于舉例說明的目的。功能上等效的產品、組合物和方法明顯也在在此所述的本發明的范圍之內。
無需過多的試驗，本發明都用傳統的分子生物學技術、微生物學技術、病毒學技術、重組DNA技術、溶液肽合成技術、固相肽合成技術和免疫學技術進行，除非有其他的說明。例如在下面的文獻中都描述了這些方法，在此通過引用將其并入本申請 1.Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Second Edition(1989)，所有的卷I、II、和III； 2.DNA CloningA Practical Approach，VoIs.I and II(D.N.Glover，ed.，1985)，IRL Press，Oxford，全文； 3.Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach(M.J.Gait，ed.，1984)IRL Press，Oxford，全文；特別是其中Gait，pp 1-22、Atkinson et al，pp35-81、Sproat etal，pp83-115、和Wu et al，pp135-151的內容； 4.Nucleic Acid HybridizationA Practical Approach(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1985)IRL Press，Oxford，全文； 5.Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)； 6.Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology(W.V.Dashek，ed.，1997)CRC Press，全文； 7.Methods of Molecular BiologyPlant Cell and Tissue Culture(J.Polland，ed.，1990)Humana Press，全文
背景技術：
小麥是人類最為豐富的能量和營養來源之一。至今為止，利用傳統的育種技術例如伴有數代選擇和回交的從一系到另一系的漸滲技術已經將大多數造成小麥的植物產量和/或營養價值提高的有益性狀引入到了小麥內。
因為小麥是一種重要的被廣泛種植的農作物，以及因為針對農作物改良的傳統植物育種方法是費時的，因此生產表達相關表型的經遺傳加工過的小麥(即轉基因小麥)是非常吸引人的。但是，當產生轉基因雙子葉植物的現有方法應用于單子葉植物，特別是不同的小麥品種的時候，所述方法不能發揮作用或者不能有效或可靠的發揮作用。
本領域人員要明白術語“轉基因”表示除了植物、細胞或部分中天然存在的核酸外還包括其他遺傳物質的植物或植物細胞或植物部分(例如植物組織或植物器官)。例如，轉基因植物或植物細胞或植物部分的基因組可以包括來自不同生物體例如動物、昆蟲、細菌、真菌或不同植物種類或品種的核酸。或者，轉基因植物或植物細胞或植物部分的基因組可以包括一個或多個附加拷貝的天然存在于同一植物種類或品種中的核酸。或者，轉基因植物或植物細胞或植物部分的基因組可以包括非天然存在的核酸例如RNAi。相對于同基因的或近似同基因的天然存在的植物而言，轉基因植物或植物細胞或植物部分的基因組也可以含有缺失，例如同源重組或重組酶誘導性重組造成的基因缺失。
術語“植物部分”用于表示植物的組織或器官，包括任何繁殖材料例如種子。
一般而言，轉基因植物或植物細胞或植物部分的生產包括 (i)轉化，其中將核酸引入到植物原生質體或植物細胞的核基因組中，以便產生轉化細胞；和 (ii)再生，其中通過器官發生或胚發生的方法從轉化細胞產生了在其細胞的基因組中攜帶有引入核酸的植物組織、器官或整個植物。
術語“器官發生”在此表示從分生組織中心次序地發育出苗和根的過程。
術語“胚發生”在此表示按協同方式(非次序的)從體細胞或配子一起發育出苗和根的過程。
本發明提供了特別用于小麥的改良改造的方法，但所述方法與現有的用于獲得再生的方法結合時，本發明提供了用于可靠地改良這種有價值的農作物的工具。
用于向小麥內引入核酸的方法 原生質體攝取核酸、粒子轟擊介導的轉化以及土壤桿菌(Agrobacterium)介導的轉化都已經被用于轉化小麥。這些方法通常涉及原生質體、花序、胚愈傷組織、或不成熟胚用作轉化原材料的用途。
本領域人員要知道術語“原生質體”表示其中例如通過利用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的組合的酶消化作用已經人為地去除了細胞壁的植物細胞。
在本文的上下文中，“花序”表示花的結構，通常表示不成熟的或發育中的花蕾。
術語“愈傷組織”表示通過培育植物組織或器官一段時間以及在沒有再生的情況下足以發生細胞分裂的條件下產生的未分化細胞的簇或組。在植物組織培養領域，愈傷組織通常被認為是非天然存在的組織。
術語“胚愈傷組織”表示在組織培養中源自胚的愈傷組織，一般是在種子發育的線性籽粒灌漿期(linear grain filling stage)。
術語“胚”表示在萌發過程中產生幼苗的種子部分。本領域人員要知道除了盾片外，來自小麥谷粒的胚還包括包含在胚根鞘內的胚根(胚根(radicle))以及包含在胚芽鞘內的苗端。
術語“不成熟胚”在本領域中表示源自開花期后(d.p.a.)約10到18天的小麥種子，以及更常見的源自約14到15天d.p.a.的小麥種子(見例如Weeks et al，Plant Physiol，1021077-1084，1993；Delporte et al，Plant Cell，Tissue and Organ Culture 80139-149，2005以及發表的國際申請WO97/48814)。在這個發育階段，小麥種子具有以下特征(i)胚乳細胞的快速細胞分裂，例如分裂指數所示；(ii)胚乳的核內復制，例如DAPI染色所示；(iii)胚乳內DNA含量的增加，如DAPI染色所示；(iv)種子鮮重的增加；(v)胚乳中含水量的增加；和(vi)胚乳中淀粉含量的增加。簡單地，種子處于發育的籽粒灌漿期。這些植物材料已經被認為是對轉化最為有用的材料，因為胚細胞在這個階段是快速分裂的。
原生質體攝取核酸 為了產生原生質體，必須要去除植物細胞的細胞壁。用于產生原生質體的方法在本領域是已知的，例如在Potrykus and Shillito，Methods in Enzymology118，449-578，1986中對此有所描述。
通過對原生質體的細胞膜進行物理的或化學的透化作用可以將裸核酸(即非載體、媒介、細胞、噬菌體或病毒所含的核酸)引入到植物原生質體內(Lorz et al，Mol.Gen.Genet.199178-182，1985和Fromm et al，Nature，319791-793，1986)。
用于將核酸引入到原生質體內的優選的物理方法是電穿孔，其包括給原生質體應用短暫的、高電壓的電脈沖，據此在細胞膜上形成納米大小的孔。通過這些孔將核酸攝取到細胞漿內。或者，通過伴有孔閉合的細胞膜組分的再分布可以經細胞膜攝取核酸。核酸可以從細胞漿轉運到細胞核內，在所述核中核酸被整合到基因組內。
用于將核酸引入到原生質體內的優選的化學方法利用了聚乙二醇(PEG)。PEG介導的轉化一般都包括在足以穿透原生質體的細胞膜的條件下，在PEG溶液中，用相關核酸處理原生質體一段足以穿透原生質體的細胞膜的時間。然后通過在細胞膜上產生的孔攝入核酸，并將其保留為游離型質粒或被將其整合到原生質體的基因組內。
不過，這些物理和化學的方法都降低了原生質體的活力并阻礙了它們的分裂能力，據此造成了非常低的轉化效率。此外，只有在這些所測試的植物種類的很小范圍的基因型中實現了轉化原生質體的成功的和可靠的再生。原生質體介導的轉化所需的延長培養條件也會誘導突變，包括體細胞克隆變異，這常常會造成不育植物的再生。
粒子轟擊介導的轉化(Biolistic轉化) 粒子轟擊介導的轉化也可以將裸核酸轉移到植物細胞內(Sanford et al，J.Part.Sd.Technol.527，37，1987)。這個技術包括將致密核酸涂層的微粒例如金粒或鎢粒加速到能夠穿透植物細胞壁和核的有效速度。然后將所引入的核酸整合到植物基因組內，由此產生轉基因的植物細胞。然后用該細胞再產生轉基因植物。
但是，對于大多數種植的小麥品種而言，利用粒子轟擊的轉化效率仍然是低的，一般是約0.1％到約2.5％(Patnaik and Khurana，BMC Plant Biology，35-15，2003)。這意味著需要大量未成熟的胚和/或外植體來產生甚至少數的轉化植物。這就增加了生產費用。
此外，粒子轟擊介導的轉化經常造成多個拷貝的引入核酸被整合到植物細胞的基因組內。這些多拷貝與經抑制或共抑制造成的引入核酸的不需要的表達下調有關(Rakoczy-Trojanowska，Cell and Molecular Biology Letters，7849-858，2002)。多拷貝的外源性引入核酸的存在對于國家監督機構來說通常也是不可接受的，所述機構的批準對于商品化而言是重要的。這一部分是為了確保能夠完全表征出轉基因植物的引入核酸的插入位點及其遺傳性。因此，多個拷貝的引入核酸的存在是不需要的。
粒子轟擊技術也是昂貴的，因為它們需要使用特殊的裝置。
Patnaik和Khurana(BMC Plant Biology，35-15，2003)已經利用粒子接到的轉化技術轉化了來自成熟小麥胚的胚愈傷組織。在這種情況中，從其中盾片已經變硬了的籽粒中分離出胚，并培養約2周，以產生愈傷組織。然后從變硬的盾片中物理地分離出愈傷組織，并再培養1周。轉化愈傷組織，而不是胚，從轉化的愈傷組織中再生出轉基因植物。這個技術的缺點是在轉化之前從胚產生愈傷組織所需的大量時間。
土壤桿菌介導的轉化 根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)是主要發生在雙子葉植物中的冠癭病的致病菌。在感染過程中，腫瘤誘導性片段或細菌攜帶的Ti質粒被轉移到植物基因組中，其中它被穩定地整合到宿主植物的基因組內(Hooykas and Beijersbergen，Ann.Rev.Phytopathol.，32157-179，1994)。然后通過宿主RNA聚合酶II轉錄被轉移到宿主細胞內的核酸(Kahl and Schell(1982)，Molecular Biology ofPlant Tumors，Academic Press，New York)。
對從根瘤土壤桿菌到植物的基因轉移的研究已經促進了遺傳修飾的細菌菌株的開發，所述菌株容許基因轉移且不會發生疾病。例如，Horsch(Science，2271229-1231，1985)顯示了利用缺乏引起冠癭病的基因的根瘤土壤桿菌將外來核酸成功的轉移到煙草內。從這個研究報道開始，根瘤土壤桿菌已經被用于產生來自多種雙子葉植物的轉基因細胞，從所述轉基因細胞產生轉基因植物。用于轉化植物的土壤桿菌系統提供了一些優于其他轉化方法的優點，例如快速產生轉基因植物，使用多種用于轉化的植物細胞中的任何一種植物細胞，和廉價實施的相當容易的方法。
但是，土壤桿菌介導的轉化還不能容易地應用到單子葉植物，小麥已經被證實對這種方法的轉化是特別抵抗的，例如Birch Annu.Rev.Plant Physiol，48793-797，1997。例如，雖然Mooney等Plant Cell，Tissue and Organ Culture，25209-218，1991報道了對來自約12到16d.p.a.的種子的不成熟小麥胚的土壤桿菌介導的轉化，但是作者不能再生出任何轉基因植物。同樣，雖然Ishida等Nature Biotechnology 14745-750，1996和EP 0 672752報道了對玉米和稻的不成熟胚的土壤桿菌介導的轉化，但是他們不能證實對其他谷類農作物的成功轉化，特別是小麥的成功轉化。這兩種方法的其他缺點是需要不成熟的胚組織。這些組織在全年中均不容易得到，并要求使用特殊的裝置以及獲得足夠多的資源例如勞動力以便確維持續的供應原材料。
Amoah等Journal of Experimental Botany.521135-1142，2001闡述了對源自小麥花序的愈傷組織的土壤桿菌介導的轉化，但是當用沒有預處理過的花序組織產生愈傷組織時，這并不能獲得轉基因細胞。在這個報道中，在愈傷組織組織而不是在花序組織中發現了轉基因細胞。此外，Amoah等不能從轉基因愈傷組織中再生出任何的轉化植物。
在本領域中，對用于產生能夠被再產生具有所需表型例如提高產量和/或抗蟲性和/或抗旱性的轉基因組織、器官或整個植物的轉基因的小麥細胞的快速的和廉價的方法有著非常明顯的需求。


發明內容
本發明提供了用于轉化禾本科植物的細胞(即禾本科植物細胞)的可靠的和有效的細菌介導的方法，其可應用于大量不同的植物包括例如小麥。本發明人已經發現來自成熟籽粒的胚可以被直接用作對來自禾本科植物的細胞的細菌介導的轉化的原材料，這就克服了對產生胚愈傷組織的組織培養步驟的需要。在這個方面，發明者已經證實了不同于常規認識的看法，即愈傷組織形成本身并非成功轉化禾本科植物細胞所必需的。通過避免這些步驟，本發明人也降低了與愈傷組織形成所需的組織培養相關的轉基因細胞和植物中的體細胞克隆變體的機會。此外，由于使用成熟的種子，這相對于未成熟胚或愈傷組織是可大量供應的，因此本發明提供了優于現有技術方法的顯著的時間和費用的節省。本發明人已經正式了這種細菌介導的轉化方法在大量小麥品種和大麥、稻和玉米的廣泛應用性，據此顯示這是一種用于不依賴于其基因型來轉化禾本科植物的穩健系統。
在這個方面，本發明人已經用小麥作為禾本科植物的模式系統，因為至今為止小麥植物被普遍地證實為抗細菌介導的轉化，特別是土壤桿菌介導的轉化。
本發明人也已經通過產生轉基因小麥細胞、轉基因大麥細胞、轉基因稻細胞和轉基因玉米細胞證實了用于轉化禾本科植物的方法的普遍可應用性。
根據在此所述的發明方法產生的轉化禾本科植物細胞能夠進行隨后的再生，以便再產生帶有引入核酸的植物部分、小植物和整個植物，即轉化的植物部分和轉化的整個植物。對于本領域人員顯而易見的是，本發明的方法可用于產生例如由于具有內源性基因的修飾表達或者引入基因的比較表達而表達一種或多種所需的表型例如增強了的抗旱性和/或抗真菌病原體的繁殖種群。
因此，本發明提供了用于產生轉基因的禾本科植物細胞的方法，所述方法包括 (i)從成熟的禾本科籽粒獲得胚細胞；和 (ii)用能夠轉化植物細胞的細菌接觸所述胚細胞，所述細菌包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，所述接觸是在足以使得所述細菌將所述轉移核酸引入到一個或多個細胞內的條件下接觸一段時間，由此產生轉基因的禾本科植物細胞。
術語“禾本科”在此應取其最廣泛的含義，表示任何單子葉的真草或其部分，優選地來自禾本科。合適的植物種類對于本領域人員是顯而易見的。合適的禾本科植物的實例包括例如來自山羊草屬(Aegilops)、冰草屬(Agropyron)、剪股穎屬(Agrostis)、看麥娘屬(Alopecuris)、須芒草屬(Andropogon)、燕麥草屬(Arrhenatherum)、蘆竹屬(Arundo)、燕麥屬(Avena)、雀麥屬(Bromus)、垂穗草屬(Bouteloua)、野牛草屬(Buchloe)、拂子茅屬(Calamagrostis)、蒺藜草屬(Cenchrus)、虎尾草屬(Chloris)、蒲葦屬(Cortaderia)、狗牙根屬(Cynodon)、鴨茅屬(Dactylis)、龍爪茅屬(Dactyloctenium)、馬唐屬(Digitaria)、稗屬(Echinocloa)、蟋蟀草屬(Eleusine)、野麥屬(Elymus)、畫眉草屬(Eragrostis)、蔗茅屬(Erianthus)、羊茅屬(Festuca)、甜茅屬(Glyceria)、絨毛草屬(Holcus)、大麥屬(Hordeum)、濱麥屬(Leymus)、黑麥草屬(Lolium)、亂子草屬(Muhlenbergia)、稻屬(Oryza)、落芒草屬(Oryzopsis)、黍屬(Panicum)、雀稗屬(Paspalum)、狼尾草屬(Pennisetum)、草蘆屬(Phalarus)、梯牧草屬(Phleum)、茶軒竹屬(Pseudosasa)、總序竹屬(Racemobambos)、赤竹屬(Sasa)、葸勞竹屬(Schizostachium)、鬣刺屬(Spinifex)、針茅屬(Stipa)、Teinostachywn、筱竹屬(Thamnocalamus)、三齒稃屬(Triodia)、小麥屬(Triticum)、玉山竹屬(Yushania)或玉蜀黍屬(Zea)的植物。其他合適的屬對于本領域人員也是顯而易見的。例如，禾本科植物是裸麥草(即黑麥草屬)或大麥(即大麥屬)或稻(例如稻屬)或玉米(例如玉蜀黍屬)或小麥。
因此，本發明提供了用于產生轉基因的裸麥草細胞的方法，所述方法包括 (i)從成熟的裸麥草籽粒獲得胚細胞；和 (ii)用能夠轉化植物細胞的細菌接觸所述胚細胞，所述細菌包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，所述接觸是在足以使得所述細菌將所述轉移核酸引入到一個或多個所述細胞內的條件下接觸一段時間，由此產生轉基因的裸麥草細胞。
術語“裸麥草”在此應當表示屬于禾本科的黑麥草屬或叢生草的任一植物。裸麥草通常是二倍體，2n＝14，與羊茅屬非常接近。黑麥草類一般分成遠系繁殖種類例如浮床黑麥草(L.multiflorum)或多年生黑麥草(L.perenne)以及近系繁殖種類例如毒麥(L.temulentum)或歐毒麥(L.persicum)。
因此，本發明也提供了用于產生轉基因的大麥細胞的方法，所述方法包括 (i)從成熟的大麥籽粒獲得胚細胞；和 (ii)用能夠轉化植物細胞的細菌接觸所述胚細胞，所述細菌包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，所述接觸是在足以使得所述細菌將所述轉移核酸引入到一個或多個所述細胞內的條件下接觸一段時間，由此產生轉基因的大麥細胞。
術語“大麥”在此應當表示大麥屬的任一植物。大麥類為一年生或多年生植物，其多倍體水平范圍是從2x、4x到6x，基礎染色體數目x＝7。術語大麥屬包括例如球莖大麥(H.bulbosum)、濱海大麥(H.murinum)、H.brachyantherum、H.patagonicum、H.euclaston、H.flexuosum或大麥(H.vulgare)這些種類。優選地，大麥屬植物是大麥。
因此，本發明也提供了用于產生轉基因的稻細胞的方法，所述方法包括 (i)從成熟的稻籽粒獲得胚細胞；和 (ii)用能夠轉化植物細胞的細菌接觸所述胚細胞，所述細菌包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，所述接觸是在足以使得所述細菌將所述轉移核酸引入到一個或多個所述細胞內的條件下接觸一段時間，由此產生轉基因的稻細胞。
術語“稻”應當表示稻屬或菰屬(zizania)的植物。術語稻包括例如稻(O.sativa)、普通野生稻(O.ruflpogon)、高桿野生稻(O.alta)、澳洲野生稻(O.australiensis)、短舌野稻(O.barthii)、O.brachyanih、緊穗野生稻(O.eichingeri)、非洲栽培稻(O.glaberrima)、大穎野生稻(O.grandiglumis)、顆粒野生稻(O.granulata)、闊葉野生稻(O.latifolia)、長護穎野稻(O.longiglumis)、長藥野生稻(O.longistaminata)、小粒野生稻(O.minuta)、尼瓦拉野生稻(O.nivara)、藥用野生稻(O.officinalis)、斑點野生稻(O.punctata)、馬來野生稻(O.ridleyi)、沼生菰(Z.palustris)、水生菰(Z.aquatica)、德克薩斯野生稻(Z.texana)或茭白(Z.latifolia)。優選地，稻是稻。
因此，本發明也提供了用于產生轉基因的玉米細胞的方法，所述方法包括 (i)從成熟的玉米籽粒獲得胚細胞；和 (ii)用能夠轉化植物細胞的細菌接觸所述胚細胞，所述細菌包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，所述接觸是在足以使得所述細菌將所述轉移核酸引入到一個或多個所述細胞內的條件下接觸一段時間，由此產生轉基因的玉米細胞。
術語“玉米”在此應當表示玉蜀黍屬的植物。優選地，術語玉米包括玉米種類中的任一植物。術語玉米包括例如硬粒玉米(Z.mays indurate)、Z.maysindenta、Z.mays everta、甜玉米(Z.mays saccharata)、粉質玉米(Z.maysamylacea)、Z.mays tunicata和/或糯玉米(Z.mays Ceratina Kulesh)這些種類。
因此，本發明也提供了用于產生轉基因的小麥細胞的方法，所述方法包括 (i)從成熟的小麥籽粒獲得胚細胞；和 (ii)用能夠轉化植物細胞的細菌接觸所述胚細胞，所述細菌包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，所述接觸是在足以使得所述細菌將所述轉移核酸引入到一個或多個所述細胞內的條件下接觸一段時間，由此產生轉基因的小麥細胞。
在一個實例中，本發明提供了用于產生轉基因小麥細胞的方法，所述方法包括 (i)從成熟小麥籽粒獲得胚細胞；和 (ii)用包括核酸構建體的土壤桿菌接觸所述胚細胞，所述構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，所述接觸是在足以使得所述土壤桿菌將所述轉移核酸引入到一個或多個所述細胞內的條件下接觸一段時間，由此產生轉基因的小麥細胞。
術語“小麥”在此取其最廣泛的含義，其表示能夠產生直立花穗及亮褐色籽粒并屬于山羊草屬-小麥屬組例如小麥和山羊草的一年生或多年生植物。根據在此所述的描述，合適的種類和/或品種對于本領域人員是顯而易見的。
術語“小麥”也包括任一四倍體、六倍體和異源多倍體(例如異四倍體和異六倍體)的山羊草或小麥，其攜帶有異六倍體小麥或其變體的A基因組和/或B基因組和/或D基因組。這包括A基因組二倍體(例如一粒小麥(Triticum monococcum)和烏拉爾圖小麥(T.urartu))、B基因組二倍體(例如斯佩特狀山羊草(Aegilops speltoides)和斯氏麥草(T.searsii))和非常接近的S基因組二倍體(例如沙融山羊草(Aegilops sharonensis))、D基因組二倍體(例如節節麥(T.tauschii)和節節麥(Aegilops squarrosa))、四倍體(例如波斯小麥(Triticum turgidum)和提莫非維小麥(T.dicoccum)(AABB)、節節麥(Aegilops tauschii)(AADD))、和六倍體(例如普通小麥(Triticumaestivum)和密穗小麥(T.compactum))。術語“小麥”可以包括山羊草或小麥的品種、栽培品種和品系，但是并不限定于其任何特定的品種、栽培品種和品系，除非有特定的說明。在一個實例中，小麥是冬小麥。在這個方面，小麥是在冬季之前(例如凍土發生之前)發芽、然后處于休眠狀態直到春天土壤暖和的小麥。在另一個實例中，小麥是夏小麥或春小麥。在這種情況中，夏小麥或春小麥是在春天播種并在夏天成熟的小麥。本領域人員知道冬小麥的品種(例如Tennant或Brennan或Warbler或Currawong或Whistler)和/或夏小麥的品種(例如Satu或Turbo或Nandu或Opal或Gaby)。
在本發明的上下文中，術語成熟籽粒應當表示其中籽粒灌漿是完全的或接近完全的籽粒。例如，術語“成熟小麥籽粒”指的是其中籽粒灌漿是完全的或接近完全的小麥籽粒或種子，優選地還具有以下特征 (i)存在沒有可檢測到的分裂的胚乳細胞(例如分裂指數為0或接近0)；和/或 (ii)已經停止核內復制的胚乳細胞；和/或 (iii)具有低含水量胚乳的胚乳細胞，即已經開始了種子的干燥。
例如，術語“成熟大麥籽粒”指的是其中籽粒灌漿是完全的或接近完全的大麥籽粒或種子，優選地還具有以下特征 (i)存在沒有可檢測到的分裂的胚乳細胞(例如分裂指數為0或接近0)；和/或 (ii)具有低含水量胚乳的胚乳細胞，即已經開始了種子的干燥；和/或 (ii)粒(kernel)含水量不超過約40％。
術語“成熟稻籽粒”指的是其中籽粒灌漿是完全的或接近完全的稻籽粒或種子，優選地還具有以下特征 (i)圓錐花序(panicle)或籽粒的顏色為黃色；和/或 (ii)具有低含水量胚乳的胚乳細胞，即已經開始了種子的干燥。
術語“成熟玉米籽粒”指的是其中籽粒灌漿是完全的或接近完全的玉米籽粒或種子或粒，優選地還具有以下特征 (i)存在沒有可檢測到的分裂的胚乳細胞(例如分裂指數為0或接近0)；和/或 (ii)在玉米籽粒或種子或粒內形成了黑色細胞層；和/或 (iii)粒含水量不超過約35％。
要明白的是，對于使用本發明的方法而言，成熟籽粒實際上沒有完成籽粒灌漿和/或進行果皮(pericarp)的枯萎和/或具有硬的盾片、或者能夠完成萌發，這并非是至關重要的。事實上，本發明的一個實例清楚地包括應用沒有完成籽粒灌漿的成熟籽粒。對于小麥而言，這些籽粒通常具有圓形外觀，這說明籽粒灌漿是接近完全的，優選地還具有綠色的果皮。
對于本領域人員顯而易見的是，術語“成熟小麥籽粒”在本發明的上下文中一般表示齡期為至少約30d.p.a.以及優選地至少約35d.p.a.或者至少約40d.p.a.，其中完成或接近完成了種子發育的籽粒灌漿期。術語“成熟大麥籽粒”在本發明的上下文中一般表示齡期為至少約30d.p.a.以及優選地至少約35d.p.a.或者至少約40d.p.a.，其中完成或接近完成了種子發育的籽粒灌漿期。術語“成熟稻籽粒”在本發明的上下文中一般表示齡期為至少約25d.p.a.以及優選地至少約30d.p.a.或者至少約35d.p.a.，其中完成或接近完成了種子發育的籽粒灌漿期。術語“成熟玉米籽粒”在本發明的上下文中一般表示齡期為至少約35d.p.a.以及優選地至少約40d.p.a.或者至少約45d.p.a.，其中完成或接近完成了種子發育的籽粒灌漿期。
在一個實例中，本發明的方法利用了由干籽粒或種子組成的成熟籽粒。在干種子中，儲存蛋白和淀粉的蓄積是完全的，果皮開始與母源上皮融合，種皮細胞被壓縮，以及糊粉開始產生與滲透保護和/或抗旱性相關的蛋白。
本領域人員知道來自其他禾本科植物例如黑麥草屬的成熟籽粒的特征。
利用在此所述的描述可以容易地鑒定并區分開成熟種子或籽粒和未成熟種子。
在本發明的上下文中，術語“成熟籽粒的胚細胞”應當包括任一數目的胚細胞或整個胚，可以有或沒有周圍的非胚組織例如果皮、胚乳、糊粉。優選地，術語“來自成熟籽粒的胚細胞”應當包括任一數目的胚細胞或整個胚，基本上沒有果皮和/或胚乳和/或糊粉。“基本上沒有”在本文中表示不到約5-10％重量的污染，優選地不到約10-20％重量的污染，更優選地不到約20-40％重量的污染。
用于本發明中的優選的胚細胞是來自上胚層或盾片的細胞。因此，本發明清楚地涉及包括上胚層和/或盾片細胞或組織的胚組織的用途。
術語“成熟籽粒的胚細胞”在本文中也應當表示天然存在的胚細胞，即不是通過組織培養方法直接產生的胚細胞。因此，在缺少誘導愈傷組織形成或者去分化胚細胞或者從胚細胞產生去分化的細胞的步驟時，這些胚細胞就存在于胚內。因此，在一個實例中，在足以容許所述胚細胞形成愈傷組織的條件下，來自成熟種子的胚細胞接觸細菌一段時間。這意味著例如本發明所用的胚組織沒有在含有合成植物生長素例如2，4-二氯苯氧乙酸的介質中預培育或保存一段相當長的時間例如至少約2周。但是這并不排除在接觸細菌之前將成熟種子或其所形成的胚細胞在組織培養基中進行短期保存，例如不到約3天，優選地不到約2天，更優選地不到約1天，以及仍更優選地不到約8個小時。
術語“從成熟籽粒獲得胚細胞”應當包括從在此上面所定義的成熟籽粒的細胞中分離或分選出胚細胞。用于獲得胚細胞的優選方法包括例如切下胚組織。在一個實例中，本發明的方法包括例如用解剖刀切下成熟種子的胚組織(例如上胚層和/或盾片或其片段)。
能夠將核酸引入到植物細胞中的合適的細菌對于本領域人員是顯而易見的。優選地，細菌是能夠將核酸引入到植物細胞內和/或轉化植物細胞的土壤傳播的細菌。在這種情況中，術語“土壤傳播”只要求細菌種或屬最初是從土壤來源中鑒定到的或分離出的或者天然存在于土壤中的。這個術語并不要求本發明的轉化方法所用的細菌確實是在土壤內的。
優選地，細菌是任一細菌，例如土壤桿菌屬或根瘤菌屬或大豆根瘤菌屬或中間根瘤菌屬的細菌。優選地，細菌是土壤桿菌種。不需要過多的試驗，“土壤桿菌”的多種種類或菌株都適用于實施本發明的方法，只要它們能夠將轉移核酸轉運到植物細胞內。優選的種類包括根瘤土壤桿菌和毛根土壤桿菌(A.rhizogenes)。依據在此所述的描述，本領域人員對于優選的土壤桿菌菌株是顯而易見的。
“接觸”表示細菌例如土壤桿菌與成熟籽粒的胚細胞進行物理接觸或者共培養。這些方法包括將組織浸泡到包括細菌的溶液內，或者將細菌滴到成熟籽粒的胚細胞上。在此包括所有本領域已知的用于用細菌特別是土壤桿菌接種植物組織的方法，包括隨后植物組織與細菌共培養的方法，條件是胚細胞在其接種細菌之前沒有進行誘導愈傷組織形成的組織培養步驟。
優選的足以使得細菌將轉移核酸引入到胚細胞內的條件包括在足以使得所述細菌結合或連接到所述胚細胞的條件下用細菌接觸胚細胞一段時間。在一個實例中，這些條件也足以使得所述細菌將轉移核酸引入到胚細胞內(即共培養)。合適的共培養方法是本領域已知的和/或在此描述的方法。
術語“核酸構建體”應當表示任何包括能夠被細菌轉運到成熟籽粒的胚細胞內的轉移核酸的核酸。例如，核酸構建體可以包括載體例如包括相關轉基因的Ti載體或Ri載體。
術語“轉移核酸”在此指的是通過細菌(優選地是土壤桿菌)被引入到植物細胞內的核酸構建體的區域或組分。例如，轉移核酸可以包括來自Ti載體或Ri載體的轉移DNA(T-DNA)，即在轉化期間被轉移到植物細胞內的Ti載體或Ri載體的一部分。轉移核酸通常位于Ti載體或Ri載體的左邊界(LB)和右邊界(RB)之間，以及任選地包括LB和/或RB系列以及包括所謂“轉基因”的插入DNA。本領域人員要知道在細菌介導的轉化期間多個拷貝到LB和/或RB可以被引入到植物細胞內。因此，轉移核酸可以包括多個拷貝的LB和/或RB。
出于命名的目的，左邊界的核苷酸序列被設定為SEQ ID NO1，右邊界的核苷酸序列被設定為SEQ ID NO2。
術語“轉基因”在此應當表示需要被引入到禾本科植物細胞內并由此產生轉基因的禾本科植物細胞的轉化核酸的一個區域。本發明的普遍可應用性并不受轉基因的性質或者其是否表達或者甚至產生或修飾表型的限制。根據在此所述的描述，合適的轉基因對于本領域人員而言是顯而易見的。
要明白的是，轉基因并不一定要在其所引入的轉基因細胞或植物內表達。例如，轉基因可以包括能夠誘導轉錄基因沉默的核苷酸序列(例如轉錄同源性依賴的基因沉默)，或者包括由有助于變體鑒別的分子標簽例如特殊DNA系列組成的核苷酸序列。
在一個實例中，轉基因在蛋白或RNA水平的表達可以賦予、誘導或增強轉基因細胞或植物的表型。示例的轉基因能夠表達能夠降低或阻止基因在植物細胞內的表達的干擾RNA、抗體酶或核酶。或者，轉基因能夠表達肽、多肽或蛋白例如報告子分子或選擇標記物或者僅僅是有助于變體鑒定的標簽。術語“表達”在此應當表示至少轉錄核苷酸序列產生了RNA分子。在本發明的一些實施例中，術語“表達”還表示翻譯所述RNA分子產生了肽、多肽或蛋白。對于可表達的轉基因而言，優選地是轉基因與在禾本科植物細胞內可操縱的啟動子相連接，所述禾本科植物細胞優選地是小麥細胞。
術語“啟動子”在此取其最廣泛的含義，并包括基因組基因的轉錄調節序列，包括TATA框或啟動子元件，這都是正確的轉錄啟動所需的元件，可有或沒有附加的調節元件(例如上游活化序列、轉錄因子結合位點、增強子和沉默子)，所述附加的調節元件例如應答于發育和/或外界的刺激或以組織特異性方式改變核酸(例如轉基因)的表達。在本文中，術語“啟動子”被用于描述賦予、激活或增強與其可操縱連接的核酸(例如轉基因和/或選擇標記物基因和/或可檢測標記物基因)的重組的、合成的或融合的核酸或衍生物。優選的啟動子可以包含附加拷貝的一種或多種特殊的調節元件，以便進一步增強表達和/或改變所述核酸的空間表達和/或短暫表達。
術語“可操縱的連接”“相連接”“可操縱地連接于”表示啟動子相對于核酸(例如轉基因)的定位，使得核酸的表達受到啟動子的控制。例如，啟動子通常位于核酸的5’端(上游)，其控制所述核酸的表達。為了構建出異源的啟動子/核酸組合(例如啟動子/轉基因和/或啟動子/選擇標記物基因組合)，優選地是啟動子距離基因轉錄起點的距離與啟動子和其在天然環境中控制的核酸(即啟動子所來源的基因)之間的距離近似相等。和本領域已知的那樣，可以對這個距離進行一些變異，且不喪失啟動子功能。
如在此所舉例說明的那樣，本發明人通過在轉化之前去除胚細胞的糊粉和/或種皮已經增強了本方法的轉化效率。因此，在一個實例中，本發明的方法還包括在用細菌接觸所述細胞之前從胚細胞去除種皮和/或糊粉。本領域人員知道劃破(scarification)或去除種皮的方法例如酸蝕作用或機械去除。如果需要特異地轉化盾片細胞，可能需要使用不具有硬盾片的種子，以便當去除種皮時能夠容許保留這些細胞。當轉化上胚層時，這就不是主要的問題。
如在此舉例說明的那樣，本發明人通過在接種和/或共培養培養基即其中接種細菌和/或共培養胚細胞和細菌的培養基中包含氮源例如從大豆中分離到的氮源已經附加地增加了轉化效率。因此，對于在存在提供氮源的化合物中進行的接種和/或共培養而言，優選地使用細菌，優選地是土壤桿菌。本文中優選的氮源包括例如蛋白胨，即植物或動物蛋白的酶消化物或酸水解物。例如，在存在源自大豆的蛋白胨例如大豆蛋白胨時進行接種和/或共培養。其他的蛋白胨對于本領域人員是顯而易見的，并包括例如從源自或分離自土壤桿菌能夠感染的植物中產生的蛋白胨。
在一個實例中，本發明的方法還包括提供、生產或獲得包括核酸構建體的細菌。例如，本發明的方法包括利用本領域已知的方法例如電穿孔或三親株交配將核酸構建體引入到細菌內。
再者或另外，本發明的方法還包括例如利用本領域已知的或在此所述的方法提供、生產或獲得核酸構建體。例如，本發明的方法還包括放置與在禾本科植物細胞內可操縱的啟動子可操縱連接的轉基因。然后將這種轉基因插入到例如克隆到合適的核酸載體內，例如Ti載體或Ri載體。
優選地，本發明的方法還包括刪除和/或選擇轉基因的禾本科植物細胞。為了促進這種選擇和/或刪除，被引入到禾本科植物細胞內的轉移核酸優選地包括在禾本科植物的細胞內可操縱的選擇標記物基因和/或可檢測的標記物基因。或者，用包括可檢測和/或可選擇的標記物基因的另一種轉移核酸轉化(即共轉化)轉移核酸。根據在此所述的描述，合適的可檢測的和/或可選擇的標記物對于本領域人員是顯而易見的。
例如，在存在D氨基酸例如D-丙氨酸和/或D-絲氨酸時，可選擇標記物可以促進禾本科植物細胞或植物的生長(例如可選擇標記物是D-氨基酸氧化酶；DAAO)。通過在存在D-丙氨酸和/或D-絲氨酸時生長所述細胞可以選擇出表達這種標記物的禾本科植物細胞，這兩種氨基酸對于不表達D-氨基酸氧化酶的植物細胞都是有毒的。
本發明還提供了經任一實施方式所述的本發明的方法直接產生的轉基因的禾本科植物細胞。
本發明人也舉例說明了在利用本發明的方法轉化之后，在禾本科植物的轉基因細胞內表達異源核酸。因此，本發明的方法還提供了本發明的方法用于生產表達轉基因的禾本科植物細胞的用途。例如，本發明的方法還提供了用于在禾本科植物細胞內表達轉基因的方法，所述方法包括 (i)產生轉基因植物細胞，所述細胞包括與可在禾本科植物細胞內操縱的啟動子可操縱連接的轉基因，所述的轉基因的禾本科植物細胞是通過實施任一實施方式所述的方法產生的。
(ii)在足以能夠表達所述轉基因的條件下維持所述轉基因細胞一段時間。
根據前面的描述對于本領域人員顯而易見的是，本發明也提供了用于產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞的方法，所述方法包括 (i)從成熟小麥籽粒或從成熟大麥籽粒或從成熟稻籽粒或從成熟玉米粒獲得胚細胞； (ii)用包括核酸構建體的土壤桿菌在足以使得所述土壤桿菌結合或附著于所述胚細胞的條件下接觸胚細胞一段時間，所述核酸構建體包括待引入胚細胞內的轉移核酸；和 (iii)在足以使得所述土壤桿菌將轉移核酸引入到一種或多種細胞內的條件下維持胚細胞和結合的土壤桿菌一段時間，由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞。
本發明也提供了用于產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞的方法，所述方法包括 (i)從成熟小麥籽粒或從成熟大麥籽粒或從成熟稻籽粒或從成熟玉米粒獲得胚細胞； (ii)從胚細胞去除種皮和/或糊粉； (iii)用包括核酸構建體的土壤桿菌在足以使得所述土壤桿菌結合或附著于所述胚細胞的條件下接觸胚細胞一段時間，所述核酸構建體包括待引入胚細胞內的轉移核酸；和 (iv)在足以使得所述土壤桿菌將轉移核酸引入到一種或多種細胞內的條件下維持胚細胞和結合的土壤桿菌一段時間，由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞。
此外，本發明提供了用于產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞的方法，所述方法包括 (i)從成熟小麥籽粒或從成熟大麥籽粒或從成熟稻籽粒或從成熟玉米粒獲得胚細胞； (ii)從胚細胞去除種皮和/或糊粉； (iii)用包括核酸構建體的土壤桿菌在足以使得所述土壤桿菌結合或附著于所述胚細胞的條件下接觸胚細胞一段時間，所述核酸構建體包括待引入胚細胞內的轉移核酸；其中在存在蛋白胨時實施所述接觸；和 (iv)在足以使得所述土壤桿菌將轉移核酸引入到一種或多種細胞內的條件下維持胚細胞和結合的土壤桿菌一段時間，其中在存在蛋白胨時實施所述維持；由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞。
本發明還提供了經任一實施方式中所述的本發明的方法直接產生的轉基因小麥細胞。
本發明人也清楚地舉例說明了在利用本發明的方法轉化之后在轉基因小麥細胞內表達異源核酸。因此，本發明還提供了本發明的方法用于生產表達轉基因的轉基因小麥細胞的用途。例如，本發明的方法還提供了在小麥細胞中表達轉基因的方法，所述方法包括 (i)產生包括與在小麥細胞內可操縱的啟動子可操縱連接的轉基因小麥細胞，所述的轉基因小麥細胞是通過實施在任一實施方式中所述的方法產生的；和 (ii)在足以使所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因細胞一段時間。
用于在禾本科植物中表達轉基因的合適條件取決于例如所用的啟動子和/或禾本科植物細胞和/或轉基因，例如依據在此所述的描述，這些對于本領域人員都是顯而易見的。
本領域人員要知道合適的轉基因。例如，合適轉基因編碼誘導或賦予禾本科植物例如小麥植物所需特性例如改良的抗旱性和/或真菌抗性的肽、多肽或蛋白。再者或另外，轉基因編碼提高植物產量或賦予抗殺蟲劑或除草劑的抗性的肽、多肽或蛋白。
本發明還提供了本發明的方法調控禾本科植物細胞中核酸表達的用途。例如，本發明提供了用于調控禾本科植物細胞中核酸表達的方法，所述方法包括 (i)產生包括能夠調控核酸表達的轉基因的轉基因禾本科植物細胞，所述轉基因細胞是通過實施在任一實施方式中所述的方法產生的；和 (ii)在足以調控核酸表達的條件下維持所述轉基因細胞一段時間。
例如，轉基因能夠表達抑制禾本科植物細胞中核酸表達(例如細胞內的內源基因或轉基因)的核酸。在本發明的一些實施例中，轉基因的禾本科植物細胞表達誘導內源基因的共抑制的核酸和/或表達短干擾RNA(siRNA)的核酸和/或表達發夾RNA和/或表達微RNA。在一個實例中，本方法包括在足以表達轉基因據此調控核酸表達的條件下維持轉基因禾本科植物細胞一段時間。
但是，轉基因不必一定要在禾本科植物細胞中有所表達以便據此調控禾本科植物細胞中核酸的表達。例如，如上討論的那樣，本發明包括將能夠誘導轉錄基因沉默(例如轉錄同源依賴性基因沉默)的轉基因引入到植物細胞內。
在本發明的這些實施例中，方法任選地還包括檢測轉基因的表達和/或選擇包括和/或表達所述轉基因的細胞。
本發明也可用于產生轉基因的禾本科植物或小植物或植物部分(例如轉基因的小麥植物或小植物或植物部分)。因此，在一個實例中，本發明提供了用于產生轉基因的禾本科植物或小植物或植物部分的方法，所述方法包括 (i)通過實施在任一實施方式中所述的本發明的方法產生轉基因禾本科植物細胞； (ii)從在(i)中產生的轉基因禾本科植物細胞再生出轉基因禾本科植物或小植物或植物部分，由此產生轉基因植物或小植物或植物部分。
在一個實例中，方法包括在足以產生愈傷組織和/或去分化細胞和/或未分化細胞的條件下，用誘導愈傷組織形成和/或誘導轉基因細胞(或其所衍生出的細胞)的分化和/或誘導從所述轉基因細胞產生未分化細胞的化合物接觸所形成的轉基因禾本科植物細胞一段時間。合適的化合物對于本領域人員是顯而易見的，例如化合物是選自由2，4-二氯苯氧乙酸、3，6-二氯-o-茴香酸、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸及其混合物組成的組。
優選地，在足以使得苗能夠發育的條件下，用誘導苗形成的化合物接觸愈傷組織和/或去分化細胞和/或未分化細胞一段時間，由此產生小植物。
優選地，在足以啟動根生長產生小植物的條件下，用誘導根產生的化合物接觸接觸愈傷組織和/或去分化細胞和/或未分化細胞一段時間。在這種情況中，可以用誘導苗形成的化合物和產生根形成的化合物同時或連續地接觸愈傷組織和/或去分化細胞和/或未分化細胞。
優選地，誘導苗形成和/或根產生的化合物選自由吲哚-3-乙酸、芐基腺嘌呤、吲哚丁酸、玉米素、α-萘乙酸、6-芐氨基嘌呤、塞苯隆、激動素、2iP及其混合物組成的組。
優選地，用于產生轉基因植物的方法還包括在足以使得小植物發育成整個植物(例如生根或發芽或生長成熟)的條件下維持小植物。
優選地在植物再生時或期間選擇包括和/或表達轉基因的細胞。因此，在一個實例中，用于產生轉基因禾本科植物的方法還包括選擇包括轉移核酸以及優選地包括轉基因的細胞。例如，在轉化后和/或在轉化后至少約1周、或3周或5周時選擇包括轉移核酸的細胞。例如，在轉化后至少約1周時選擇包括轉移核酸的細胞。例如，在轉化后至少約3周時選擇包括轉移核酸的細胞。例如，在轉化后至少約5周時選擇包括轉移核酸的細胞。根據在此所述的描述，用于選擇包括轉基因的細胞的方法對于本領域人員是顯而易見的。
因為本發明的轉化方法優先將轉移核酸引入到上胚層或盾片的細胞內，優選地在選擇之前或期間分離出這些細胞，以減少未轉化細胞的數目。在這個方面，在轉化禾本科植物細胞期間(例如接種之后)或轉化之后(例如共培養之后)或再生之前或期間分離出這些細胞。因此，用于產生本發明的轉基因植物的方法還優選地包括在從成熟種子獲得胚細胞之后和/或在接種所述胚細胞之后和/或在共培養所述胚細胞之后分離出上胚層細胞和/或盾片細胞。
優選地，在此所述的用于產生轉基因禾本科植物的本發明的方法還包括選擇其中單個轉移核酸或轉基因已經整合到所述細胞、或所述愈傷組織細胞、小植物或植物的基因組內的轉基因禾本科植物細胞或愈傷組織或小植物或植物。如在此所述的那樣，包括具有單一拷貝的轉基因(或轉移核酸)的細胞的轉基因植物對于育種和/或生長的調節體例如農夫而言是優選的。用于選擇包括具有單一拷貝的轉移核酸或轉基因的細胞的轉基因植物細胞或愈傷組織或小植物或植物的方法對于本領域人員是已知的。例如，進行Southern雜交以便確定出所述細胞、或所述愈傷組織、小植物或植物的細胞的基因組中的所述轉移核酸或轉基因的拷貝數。
通過在此所述的描述，對于本領域人員顯而易見的是，本發明提供了用于產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的方法，所述方法包括 (i)通過實施如下方法產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞，所述方法包括以下步驟 (a)從成熟小麥籽粒或成熟大麥籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒獲得胚細胞；和 (b)用包括核酸構建體的土壤桿菌在足以使得所述土壤桿菌將轉移核酸引入到一種或多種細胞內的條件下接觸所述胚細胞一段時間，所述核酸構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸；由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞；和 (ii)通過實施如下方法從在(i)中產生的轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞再生出轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物，所述方法包括以下步驟 (a)在足以產生愈傷組織的條件下，用誘導愈傷組織形成的化合物接觸轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞一段時間； (b)在足以產生苗的條件下，用誘導苗形成的化合物接觸愈傷組織一段時間； (c)在足以啟動根產生的條件下，用誘導根產生的化合物接觸愈傷組織一段時間，由此產生小植物；和 (d)在足以產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的條件下，生長小植物一段時間。
本發明也提供了用于產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的方法，所述方法包括 (i)通過實施如下方法產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞，所述方法包括以下步驟 (a)從成熟小麥籽粒或成熟大麥籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒獲得胚細胞；和 (b)從胚細胞去除種皮和/或糊粉； (c)在足以使得所述土壤桿菌結合和/或附著于所述胚細胞的條件下，用包括核酸構建體的土壤桿菌接觸所述胚細胞一段時間，所述核酸構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸；和 (d)在足以使得所述土壤桿菌將所述轉移核酸引入到一種或多種細胞內的條件下維持胚細胞和結合的土壤桿菌一段時間，由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞；和 (ii)通過實施如下方法從在(i)中產生的轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞再生出轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物，所述方法包括以下步驟 (a)在足以產生愈傷組織的條件下，用誘導愈傷組織形成的化合物接觸轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞一段時間； (b)在足以產生苗的條件下，用誘導苗形成的化合物接觸愈傷組織一段時間； (c)在足以啟動根產生的條件下，用誘導根產生的化合物接觸愈傷組織一段時間，由此產生小植物；和 (d)在足以產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的條件下，生長小植物一段時間。
本發明也提供了用于產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的方法，所述方法包括 (i)通過實施如下方法產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞，所述方法包括以下步驟 (a)從成熟小麥籽粒或成熟大麥籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒獲得胚細胞；和 (b)從胚細胞去除種皮和/或糊粉； (c)在足以使得所述土壤桿菌結合和/或附著于所述胚細胞的條件下，用包括核酸構建體的土壤桿菌接觸所述胚細胞一段時間，所述核酸構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，其中在存在蛋白胨時實施所述接觸；和 (d)在足以使得所述土壤桿菌將所述轉移核酸引入到一種或多種細胞內的條件下維持胚細胞和結合的土壤桿菌一段時間，其中在存在蛋白胨時實施所述維持，由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞；和 (ii)通過實施如下方法從在(i)中產生的轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞再生出轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物，所述方法包括以下步驟 (a)在足以產生愈傷組織的條件下，用誘導愈傷組織形成的化合物接觸轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞一段時間； (b)在足以產生苗的條件下，用誘導苗形成的化合物接觸愈傷組織一段時間； (c)在足以啟動根產生的條件下，用誘導根產生的化合物接觸愈傷組織一段時間，由此產生小植物；和 (d)在足以產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的條件下，生長小植物一段時間。
本發明也可用于生產具有所需特性的轉基因禾本科植物。例如，轉基因禾本科植物包括編碼誘導和/或增強和/或賦予所需特性的肽、多肽或蛋白的轉基因禾本科植物。再者或另外，轉基因調控禾本科植物中與所述特性相關的核酸的表達。用于利用在任一實施方式中所述的本發明的方法產生轉基因禾本科植物的方法可以經必要的調整被應用于本發明的這個實施方式。
例如，轉基因編碼與提高禾本科植物例如小麥的產量相關的蛋白，例如通過賦予和/或誘導和/或增強其中表達所述轉基因的禾本科植物對植物病原體的抗性(例如，蛋白是小麥奇甜蛋白樣蛋白或小麥線條花葉病毒外殼蛋白)。或者，轉基因誘導和/或增強和/或賦予其中表達所述轉基因的禾本科植物(例如小麥)的抗旱性和/或耐干性和/或耐鹽性和/或耐寒性。例如，轉基因是擬南芥DREB1A基因。
再者或另外，轉基因編碼提高或修飾其中表達所述轉基因的轉基因禾本科植物的產物的營養品質的蛋白，例如轉基因提高或修飾其中表達所述轉基因的轉基因小麥植物產生的面粉的營養品質。例如，轉基因是高分子量麥谷蛋白亞基1Ax1基因。
再者或另外，轉基因表面修飾禾本科植物的產物的營養品質的核酸。例如，轉基因表達降低或阻止小麥顆粒結合性淀粉合酶I基因表達的siRNA。
在另一種情況中，轉基因賦予了來自其中表達所述轉基因的禾本科植物的產物的營養食品質量。術語“營養食品”在此應當表示任何可以被當作食品或食品一部分以及提供醫療或保健益處包括預防和治療疾病的物質。
例如，轉基因編碼B型肝炎病毒表面抗原。
在一個實例中，本發明產生轉基因禾本科植物的方法還包括在足以產生種子的條件下生長轉基因植物一段時間。優選地，方法還包括獲得所述種子。因此，本發明還提供了用于從禾本科植物優選地從小麥植物產生轉基因種子的方法。
在另一個實例中，本發明的產生轉基因禾本科植物的方法還包括從所述植物獲得植物部分(例如生殖材料或繁殖材料或種質)。
在一個實例中，用于產生轉基因禾本科植物的方法還包括提供所述植物和/或其子代和/或其種子和/或其繁殖材料和/或其生殖材料和/或其種質。
本發明還包括用于產生轉基因禾本科植物子代的方法。因此，本發明還提供了用于繁殖轉基因禾本科植物的方法，所述方法包括 (i)通過實施在任一實施方式中所述的方法產生轉基因禾本科植物；和 (ii)繁殖在(i)中產生的轉基因植物，由此產生所述植物的子代。
在這種情況中，可以用轉基因或非轉基因植物繁殖轉基因植物，即所產生的子代可以是轉基因的純合子或雜合子。
優選地，方法包括選擇或鑒定轉基因植物的子代，所述子代包括在此所述的轉移核酸，優選地包括轉基因。
很清楚，本發明還包括利用在任一實施方式中所述的本發明的方法產生的轉基因植物、轉基因植物的子代、轉基因植物的種子或轉基因植物的繁殖材料或轉基因植物的繁殖材料或轉基因植物的種質。優選地，植物是小麥植物。
本發明還包括用于繁殖轉基因禾本科植物的方法，所述方法包括 (i)利用任一實施方式中所述的方法產生轉基因禾本科植物或轉基因禾本科植物的子代或轉基因禾本科植物的種子或轉基因禾本科植物的繁殖材料；和 (ii)提供了用于繁殖目的的植物、子代、種子或繁殖材料。
在另一個實例中，本發明提供了用于繁殖轉基因禾本科植物的方法，所述方法包括 (i)獲得通過實施在任一實施方式中所述的方法產生的轉基因禾本科植物或轉基因禾本科植物的子代；和 (ii)繁殖轉基因植物或子代； 或者，方法包括 (i)獲得通過實施在任一實施方式中所述的方法產生的轉基因禾本科植物的種子或轉基因禾本科植物的繁殖材料； (ii)利用種子或繁殖材料生長或產生轉基因植物；和 (iii)繁殖在(ii)中產生的轉基因植物。
用于繁殖禾本科植物的方法對于本領域人員是顯而易見的，并在此有所描述。
本發明也提供了用于生產在任一實施方式中所述的轉基因禾本科植物細胞或轉基因禾本科植物的方法在植物育種中的用途。優選地，禾本科植物是小麥植物。
對于本領域人員顯而易見的是，用于產生轉基因禾本科植物的方法也可用于在植物中表達轉基因。因此，本發明提供了用于在禾本科植物中表達轉基因的方法，所述方法包括 (i)產生包括與在禾本科植物細胞中可操縱的啟動子可操縱連接的轉基因的轉基因禾本科植物或其子代，所述植物是通過實施在任一實施方式中所述的方法產生的或子代；和 (ii)在足以使所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因植物一段時間。
在此描述了合適的轉基因，并且將其經必要的調整應用于本發明的實施方式中。本發明也提供了用于調控禾本科植物中核酸表達的方法，所述方法包括 (i)產生包括能夠調控所述核酸表達的轉基因的轉基因禾本科植物或其子代，所述植物是通過實施在任一實施方式中所述的方法產生的或子代； (ii)在足以調控所述核酸表達的條件下維持所述轉基因一段時間。
在一個實例中，轉基因被放置于與啟動子可操縱的連接，并表達能夠調控核酸表達的核酸(例如siRNA或微RNA)。在這個實施方式中，方法包括在足以表達轉基因并據此調控核酸表達的條件下維持轉基因植物一段時間。
在此描述了合適的轉基因，并且將其經必要的調整應用于本發明的實施方式中。
對于本領域人員顯而易見的是，用于在禾本科植物中表達轉基因的方法、或用于調控禾本科植物中核酸表達的方法也可用于賦予禾本科植物表型或者調控禾本科植物的特性。因此，本發明也提供了在任一實施方式中所述的用于在禾本科植物中表達轉基因的方法用于賦予禾本科植物的特性或者調控禾本科植物的特性的用途。例如，本發明提供了用于賦予禾本科植物的特性或調控禾本科植物的特性的方法，所述方法包括 (i)產生包括能夠賦予或調控所述特性的轉基因的轉基因禾本科植物或其子代，所述植物是通過實施在任一實施方式中所述的方法產生的； (ii)在足以賦予或調控特性的條件下維持所述轉基因一段時間。
例如，轉基因表達能夠賦予或提高或增強特性的肽、多肽或蛋白。在本實施方式中，方法包括在足以使所述轉基因表達并據此賦予或調控所述特性的條件下維持轉基因植物一段時間。
或者，轉基因能夠調控禾本科植物中與特性相關的核酸的表達。
優選的特性包括例如禾本科植物例如小麥植物的產量、禾本科植物的抗旱性、病原體抗性、禾本科植物產物例如糠的營養品質或者禾本科植物的營養食品質量。在此描述了與這些質量相關的轉基因，并經必要的調整將其應用到本發明的實施方式中。
本發明也提供了用于提高禾本科植物的產量的方法，所述方法包括 (i)產生包括編碼與提高產量相關的蛋白的轉基因的轉基因禾本科植物或其子代，所述轉基因與在禾本科植物細胞中可操縱的啟動子可操縱相連，所述植物是通過實施在任一實施方式中所述的方法產生的； (ii)在足以使所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因一段時間；和 (iii)在足以產生籽粒的條件下生長所述轉基因植物一段時間，據此增強禾本科植物的產量。
本發明也提供了用于提高禾本科植物的籽粒的營養品質的方法，所述方法包括 (i)產生包括編碼營養蛋白的轉基因的轉基因禾本科植物或其子代，所述轉基因與在禾本科植物細胞中可操縱的啟動子可操縱相連，所述植物是通過實施在任一實施方式中所述的方法產生的； (ii)在足以使所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因一段時間；和 (iii)獲得所述植物的籽粒，所述籽粒具有提高了的營養品質。
此外，本發明提供了用于調控禾本科植物的籽粒的營養品質的方法，所述方法包括 (i)產生包括編碼能夠調控與禾本科植物的營養品質相關的核酸的轉基因的轉基因禾本科植物或其子代，所述轉基因與在禾本科植物細胞中可操縱的啟動子可操縱相連，所述植物是通過實施在任一實施方式中所述的方法產生的； (ii)在足以調控所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因一段時間；和 (iii)獲得所述植物的籽粒，所述籽粒具有提高了的營養品質。
本發明也提供了用于賦予禾本科植物的營養食品質量的方法，所述方法包括 (i)產生包括編碼治療性或預防性或免疫原性蛋白的轉基因的轉基因禾本科植物或其子代，所述轉基因與在禾本科植物細胞中可操縱的啟動子可操縱相連，所述植物是通過實施在任一實施方式中所述的方法產生的； (ii)在足以使所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因一段時間；和 (iii)獲得其中表達轉基因的植物部分，據此增強禾本科植物的營養食品質量。
任選地，本發明的方法還包括給對象(例如動物或人類對象)喂食所獲得的植物部分。
因為禾本科植物例如小麥是(例如人類)消費品的主要來源，因此本發明還包括含有本發明的或利用本發明的方法產生的轉基因植物的植物材料的產品。優選地，標識所述產品以指示出產品的性質。
術語“標識以便指示出產品的性質”應當表示標識產品，以便指示出其包括轉基因禾本科植物例如源自其中的小麥或植物材料，或者指示出產品包括來自利用細菌介導的轉化例如土壤桿菌介導的轉化產生的轉基因禾本科植物的植物材料或者產品包括來自利用本發明的方法產生的轉基因禾本科植物的植物材料。



圖1是顯示在任一實施方式中所述的用于轉化小麥胚的方法的一個實例的示意圖。簡單地，所述的方法包括表面消毒成熟小麥籽粒，從籽粒中分離出胚，用合適的土壤桿菌菌株接種胚以及共培養胚和土壤桿菌。
圖2A是一份顯示成熟小麥籽粒的照片圖，從中分離出胚，并用于在任一實施方式中所述的用于產生轉基因小麥細胞或轉基因小麥植物的方法。
圖2B是一份顯示成熟小麥籽粒的放大圖的照片圖，從中分離出胚，并用于在任一實施方式中所述的用于產生轉基因小麥細胞或轉基因小麥植物的方法。
圖2C是一份顯示從干燥的小麥籽粒穎果中切下來的胚組織(用箭頭標出)的照片圖。然后用分離的胚進行接種和共培養，例如如圖1所示。
圖2D是一份顯示利用圖所示的方法經載體pCAMBIA1305.2轉化并在接種3天后被染色以檢測出gusA活性的胚的照片圖，深染細胞表達gusA(用箭頭標出)。
圖2E是一份顯示利用圖1所示的方法經載體pLM301(pSB1_Ubi1::DsRed2-nos)轉化的胚的照片圖。
圖2F是一份顯示在圖2E所示的胚內表達DsRed2的照片圖。表達DsRed2的細胞顯示為灰色區域，用箭頭標出其實例。
圖2G是一份顯示利用圖1所示的方法經載體pLM301(pSB1_Ubi1::DsRed2-nos)轉化的胚的照片圖。
圖2H是一份顯示在圖2E所示的胚內表達DsRed2的照片圖。表達DsRed2的細胞顯示為灰色區域，用箭頭標出其實例。
圖3A是顯示在任一實施方式中所述的用于從轉化的小麥胚再生出小麥植物的方法的實施例的示意圖。簡單地，所述的方法包括在所述的愈傷組織誘導培養基中誘導愈傷組織誘導；在所述的再生培養基中誘導再生以及在所述的根誘導培養基中誘導根誘導。
圖3B是一份顯示進行再生的小麥植物的照片圖。
圖3C是一份顯示進行根誘導的T0小麥植物的照片圖。
圖3D是一份顯示生長在苗圃基質中的T1小麥植物的照片圖。
圖3E是一份顯示生長在苗圃基質中的T1小麥植物的照片圖。
圖4A是顯示用于檢測T1植物中是否存在潮霉素選擇標記物的定量聚合酶鏈反應(PCR)結果的示意圖。檢測來自T1系SE36的植物，在圖的右側標識出來自這些檢測的結果。來自陽性和陰性對照的結果也被標識在圖的右側。在X軸上顯示出所進行的循環次數以及在Y軸上顯示出熒光單位。
圖4B是顯示用于檢測T1植物中是否存在土壤桿菌菌株EHA105的virC基因的定量聚合酶鏈反應(PCR)結果的示意圖。檢測來自T1系SE36的植物，在圖的右側標識出來自這些檢測的結果。來自陽性和陰性對照的結果也被標識在圖的右側。在X軸上顯示出所進行的循環次數以及在Y軸上顯示出熒光單位。
圖4C是是顯示用于檢測T1植物中是否存在潮霉素選擇標記物的定量聚合酶鏈反應(PCR)結果的示意圖。檢測來自T1系DV92-88的植物，在圖的右側標識出來自這些檢測的結果。來自陽性和陰性對照的結果也被標識在圖的右側。在X軸上顯示出所進行的循環次數以及在Y軸上顯示出熒光單位。
圖4D是顯示用于檢測T1植物中存在潮霉素選擇標記物的定量聚合酶鏈反應(PCR)結果的示意圖。檢測來自T1系DV100-92的植物，在圖的右側標識出來自這些檢測的結果。來自陽性和陰性對照的結果也被標識在圖的右側。在X軸上顯示出所進行的循環次數以及在Y軸上顯示出熒光單位。
圖5是其中可以檢測到gusA表達灶的經實施例1所述的方法轉化的各種小麥基因型的外植體的百分比。X軸顯示出每種基因型(即小麥品種)的名字。Y軸顯示出具有gusA表達灶的外植體的百分比。
圖6A是一份顯示經載體pCAMBIA1305.2轉化并被染色以檢測出gusA活性的小麥胚(Carinya品種)的照片圖。深染細胞表達gusA(用箭頭標出)。
圖6B是一份顯示經載體pCAMBIA1305.2轉化并被染色以檢測出gusA活性的小麥胚(Chara品種)的照片圖。深染細胞表達gusA(用箭頭標出)。
圖6C是一份顯示經載體pCAMBIA1305.2轉化并被染色以檢測出gusA活性的小麥胚(Diamondbird品種)的照片圖。深染細胞表達gusA(用箭頭標出)。
圖6D是一份顯示經載體pCAMBIA1305.2轉化并被染色以檢測出gusA活性的小麥胚(Sapphire品種)的照片圖。深染細胞表達gusA(用箭頭標出)。
圖6E是一份顯示經載體pCAMBIA1305.2轉化并被染色以檢測出gusA活性的小麥胚(W12332品種)的照片圖。深染細胞表達gusA(用箭頭標出)。
圖6F是一份顯示經載體pCAMBIA1305.2轉化并被染色以檢測出gusA活性的小麥胚(RAC 1262品種)的照片圖。深染細胞表達gusA(用箭頭標出)。
圖6G是一份顯示經載體pCAMBIA1305.2轉化并被染色以檢測出gusA活性的小麥胚(Krichauff品種)的照片圖。深染細胞表達gusA(用箭頭標出)。
圖6H是一份顯示經載體pCAMBIA1305.2轉化并被染色以檢測出gusA活性的小麥胚(Ventura品種)的照片圖。深染細胞表達gusA(用箭頭標出)。
圖7是顯示利用圖3A所示的方法進行的各種小麥基因型的植物再生的頻率。根據具有再生出整個植物的外植體的比例計算出再生頻率。X軸顯示出小麥基因型(即品種)，Y軸顯示出再生頻率百分比。
圖8A是一份顯示根據圖3A所示的方法進行再生的Bobwhite品種的小麥外植體的照片圖。
圖8B是一份顯示根據圖3A所示的方法進行再生的Fame品種的小麥外植體的照片圖。
圖8C是一份顯示根據圖3A所示的方法進行再生的Carinya品種的小麥外植體的照片圖。
圖8D是一份顯示根據圖3A所示的方法進行再生的Kirchauff品種的小麥外植體的照片圖。
圖8E是一份顯示根據圖3A所示的方法進行再生的Ventura品種的小麥外植體的照片圖。
圖9是顯示SoytoneTM對轉化效率的作用的示意圖。在不同濃度的SoytoneTM中，用攜帶pCAMBIA1305.2載體的土壤桿菌接種并共培養小麥胚，確定出接種3天后gusA表達染色陽性的表達灶的數目。在圖的下方顯示出SoytoneTM的濃度。
圖10是顯示SoytoneTM和/或種皮去除對轉化效率的作用的示意圖。在各種條件下(有或沒有種皮和/或存在SoytoneTM或者存在糖)，用攜帶pCAMBIA1305.2載體的土壤桿菌接種并共培養小麥胚，確定出接種3天后gusA表達染色陽性的表達灶的數目。在圖的下方顯示出所用的處理。
圖11A是一份顯示來自其中分離出用于在任一實施方式中所述的用于產生轉基因大麥細胞或轉基因大麥植物的方法中的胚的成熟大麥籽粒的照片圖。
圖11B是一份顯示來自其中分離出用于在任一實施方式中所述的用于產生轉基因大麥細胞或轉基因大麥植物的方法中的胚的成熟大麥籽粒的放大圖像的照片圖。
圖11C是一份顯示從干的大麥籽粒穎果中切下來的胚組織(用箭頭標出)的照片圖。所分離到的胚然后被用于合適細菌的接種和共培養，由此產生轉基因大麥細胞。
圖11D是一份顯示從干的大麥籽粒穎果中切下來的胚組織(用箭頭標出)的照片圖。所分離到的胚然后被用于合適細菌的接種和共培養，由此產生轉基因大麥細胞。
圖11E是一份顯示已經土壤桿菌懸浮液直接接種并共培養的大麥胚組織的照片圖。
圖11F是一份顯示經載體pCAMBIA1305.2轉化并被染色以檢測出gusA活性的大麥胚。深染細胞表達gusA(用箭頭標出)。
圖12是一份顯示從利用土壤桿菌介導的轉化方法所轉化的成熟大麥胚再生出大麥植物的照片圖。
圖13A是一份顯示來自其中分離出用于在任一實施方式中所述的用于產生轉基因稻細胞或轉基因稻植物的方法中的胚的成熟稻籽粒的照片圖。
圖13B是一份顯示來自其中分離出用于在任一實施方式中所述的用于產生轉基因稻細胞或轉基因稻植物的方法中的胚的成熟稻籽粒的放大圖像的照片圖。
圖13C是一份顯示從干的稻籽粒穎果中切下來的胚組織(用箭頭標出)的照片圖。所分離到的胚然后被用于合適細菌的接種和共培養，由此產生轉基因稻細胞。
圖13D是一份顯示從干的稻籽粒穎果中切下來的胚組織(用箭頭標出)的照片圖。所分離到的胚然后被用于合適細菌的接種和共培養，由此產生轉基因稻細胞。
圖13E是一份顯示已經土壤桿菌懸浮液直接接種并共培養的稻胚組織的照片圖。
圖13F是一份顯示經載體pCAMBIA1305.2轉化并被染色以檢測出gusA活性的稻胚。深染細胞表達gusA(用箭頭標出)。
圖14A是一份顯示來自其中分離出用于在任一實施方式中所述的用于產生轉基因玉米細胞或轉基因玉米植物的方法中的胚的成熟玉米粒(籽粒)的照片圖。
圖14B是一份顯示來自其中分離出用于在任一實施方式中所述的用于產生轉基因玉米細胞或轉基因玉米植物的方法中的胚的成熟玉米粒(籽粒)的放大圖像的照片圖。
圖14C是一份顯示從干的玉米粒中切下來的胚組織(用箭頭標出)的照片圖。所分離到的胚然后被用于合適細菌的接種和共培養，由此產生轉基因玉米細胞。
圖14D是一份顯示對切的玉米胚的照片圖。對切胚然后被用于合適細菌的接種和共培養，由此產生轉基因玉米細胞。
圖14E是一份顯示在載體LM227轉化后再生出玉米外植體的照片圖。
圖14F是一份顯示圖14E所示的外植體中的DsRed2表達水平的照片圖。更亮的細胞為表達DsRed2的組織，用箭頭標出其實例。
圖15是pBPS0054載體的示意圖。該載體包括驅動雙丙氨膦抗性基因(bar)表達的玉米遍在蛋白啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。bar基因與nos多腺苷酸化信號可操縱的連接。pBPS0054載體也包括用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因。標出了限制性內切酶切割位點。
圖16是pBPS0055二元載體的示意圖。該載體包括驅動gusA報告子基因表達的稻肌動蛋白1 1D啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。gusA基因與花椰菜花葉病毒35S多腺苷酸化信號可操縱的連接。pBPS0055載體也包括用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因。標出了限制性內切酶切割位點。
圖17是pBPS0056二元載體的示意圖。該載體包括驅動改良綠色熒光蛋白(sGFP)報告子基因表達的稻肌動蛋白1 1D啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。sGFP基因與花椰菜花葉病毒35S多腺苷酸化信號可操縱的連接。pBPS0056載體也包括用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因。標出了限制性內切酶切割位點。
圖18是pBPS0057二元載體的示意圖。該載體包括驅動改良gusA報告子基因表達的稻肌動蛋白1 1D啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。gusA基因與花椰菜花葉病毒35S多腺苷酸化信號可操縱的連接。也位于LB和RB之間的是被放置與玉米遍在蛋白啟動子和nos終止子可操縱的連接的植物選擇性bar基因。pBPS0057載體也包括用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因。標出了限制性內切酶切割位點。
圖19是pBPS0058二元載體的示意圖。該載體包括驅動改良sGFP報告子基因表達的稻肌動蛋白1 1D啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。sGFP基因與花椰菜花葉病毒35S多腺苷酸化信號可操縱的連接。也位于LB和RB之間的是被放置與玉米遍在蛋白啟動子和nos終止子可操縱的連接的植物選擇性bar基因。pBPS0058載體也包括用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因。標出了限制性內切酶切割位點。
圖20是pPZPMV T2 R4R3二元基礎載體的示意圖。該載體包括兩個分離的T-DNA，并已經被構建成有助于標記物切除。一個T-DNA含有適用于模塊表達框的多個克隆位點，另一個T-DNA含有R4R3多位點重組盒。多個克隆位點是由13個六核苷酸限制性位點、6個八核苷酸限制性位點和5個罕見的歸巢內切酶位點組成的，以便促進模塊化。
圖21是pBPS0059載體的示意圖。該載體包括驅動bar抗性基因表達的玉米遍在蛋白啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。bar基因與nos終止子可操縱的連接。pBPS0059載體也包括用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因以及用于同源重組到超二元受體載體pSB1內的區域。標出了限制性內切酶切割位點。
圖22是pBPS0060載體的示意圖。該載體包括驅動gusA報告子基因表達的稻肌動蛋白1 1D啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。gusA基因與花椰菜花葉病毒35S終止子可操縱的連接。pBPS0060載體也包括用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因以及用于同源重組到超二元受體載體pSB1內的區域。標出了限制性內切酶切割位點。
圖23是顯示pBPS0061載體的示意圖。該載體包括驅動sGFP報告子基因表達的稻肌動蛋白1 1D啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。sGFP基因與花椰菜花葉病毒35S終止子可操縱的連接。pBPS0061載體也包括用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因以及用于同源重組到超二元受體載體pSB1內的區域。標出了限制性內切酶切割位點。
圖24是顯示pBPS0062載體的示意圖。該載體包括驅動改良gusA報告子基因表達的稻肌動蛋白1 1D啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。gusA基因與花椰菜花葉病毒35S多腺苷酸化信號可操縱的連接。也位于LB和RB之間的是被放置與玉米遍在蛋白啟動子和nos終止子可操縱的連接的植物選擇性bar基因。pBPS0062載體也包括用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因以及用于同源重組到超二元受體載體pSB1內的區域。標出了限制性內切酶切割位點。
圖19是pBPS0063載體的示意圖。該載體包括驅動改良sGFP報告子基因表達的稻肌動蛋白1 1D啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。sGFP基因與花椰菜花葉病毒35S多腺苷酸化信號可操縱的連接。也位于LB和RB之間的是被放置與玉米遍在蛋白啟動子和nos終止子可操縱的連接的植物選擇性bar基因。pBPS0063載體也包括用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因以及用于同源重組到超二元受體載體pSB1內的區域。標出了限制性內切酶切割位點。
圖26是超二元載體pSB1的示意圖。該載體包括一組源自土壤桿菌菌株A281的pTiBo542質粒的一組致病基因(virG、virB和virC)。該載體能夠與根瘤土壤桿菌中pBPS0059到pBPS0063的任一質粒重組，以產生雜合載體。pSB1載體也包括用于細菌選擇的四環素耐藥基因。標出了限制性內切酶切割位點。
圖27是顯示含有兩個分離T-DNA的pSB11 T2 R4R3超二元供體基礎載體的示意圖。一個T-DNA含有適用于選擇標記物盒的多個克隆位點，另一個T-DNA含有R4R3多位點重組盒。標出了限制性內切酶切割位點。
圖28是顯示含有兩個分離T-DNA的pSB11ubnT2R4R3超二元供體基礎載體的示意圖。一個T-DNA含有適用于選擇標記物盒的多個克隆位點，另一個T-DNA含有R4R3多位點重組盒。ubi::bar-nos選擇標記物盒已經被克隆到了該載體的多個克隆位點內。標出了限制性內切酶切割位點。
圖29是顯示pPZP200ubi::bar-nos R4R3基礎載體的示意圖。該載體包括驅動雙丙氨膦抗性基因(bar)表達的玉米遍在蛋白啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。bar基因與nos多腺苷酸化信號可操縱的連接。pPZP200ubi::bar-nos R4R3載體也含有多位點重組盒以及用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因。標出了限制性內切酶切割位點。
圖30是顯示pPZP200 ubi::dao1-nos R4R3基礎載體的示意圖。該載體包括驅動D-氨基酸氧化酶基因(dao1)表達的玉米遍在蛋白啟動子兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。dao1基因與nos多腺苷酸化信號可操縱的連接。pPZP200ubi::bar-nos R4R3載體也含有多位點重組盒以及用于細菌選擇的壯觀霉素耐藥基因。標出了限制性內切酶切割位點。
圖31是顯示pPZP200ubidao1-nos_act1D::rfa-RGA2-rfa(as)-35ST RNAi基礎載體的示意圖。該載體包括ubi::dao1-nos選擇標記物盒和act1D::rfa-RGA2-rfa(as)-35ST盒兩側的左邊界(LB)和右邊界(RB)區。RGA2是小麥內含子序列，以及rfa和rfa(as)是用于有義和反義克隆RNAi沉默序列的重組位點。
優選實施方式詳述 1、合適的植物株和栽培品種 本發明人已經證實任一實施方式中所述的用于產生轉基因禾本科植物細胞或植物的方法普遍地適用于各種禾本科植物株。因此，本發明包括任一種類/株/系/品種/栽培品種的禾本科植物。例如，本發明包括產生選自由Acamptoclados、Achlaena、芨芨草屬、尖稃草屬、酸竹屬、細無脊草屬、尖稃草屬、亂毛穎草屬、鳳頭黍屬、射枝竹屬、山羊草屬、羊須草屬、獐茅屬、非洲虎尾草屬、童顏草屬、Agnesia、冰草屬、冰草屬(Agropyropsis)、剪股穎屬、銀須草屬(Aira)、銀須草屬(Airopsis)、Alexfloydia、非洲奇草屬、奇鱗草屬、毛穎草屬、看麥娘屬、阿爾芬竹屬、無芒山羊草屬、燥地砂草屬、Ammophila、藤帶禾屬、濕燕麥屬、雙果雀稗屬、澳三芒草屬(Amphipogon)、兄弟草屬、兄弟草屬、鉤草屬、Ancistragrostis、須芒草屬、翼穎草屬、風羽針茅屬、溝稃草屬、Amsopogon、畸苞草屬、擬銀鱗草屬、銀鱗草屬、柄花草屬、花禾屬、黃花茅屬、浮燕麥屬、Apera、隱血草屬、水蔗草屬、離穎草屬、離枝竹屬、瑞氏楔穎草、阿波[竹+禾]屬、寒翦股穎屬、喜極禾屬、三芒草屬、燕麥草屬、北澳黍屬、藎草屬、節芒草屬、內門竹屬、青衡竹屬、野古草屬、蘆竹屬、克萊東蘆竹屬、柔草屬、阿司吹禾屬、密穗竹屬、紡錘花竹屬、牧笛竹屬、澳麥草屬、澳洲虎尾草屬、Austrodanthonia、澳羊茅屬、澳針茅屬、Avellinia、燕麥屬、地毯草屬、Bambusa、染軸粟屬、Bealia、Beckeropsis、菵草屬、Bellardiochloa、非洲千金子屬、印比草屬、荒漠草屬、肋禾屬、糙雀麥屬、Boivinella、北風箭竹屬、孔穎草屬、垂穗草屬、臂形草屬、短毛草屬、非洲矮草屬、短穎草屬、短柄草屬、Briza、雀麥草屬、雀麥屬、扁穗草屬、野牛草屬、野牛草屬(Buchlomimus)、伊里安[竹+禾]屬、拂子茅屬、沙茅屬、絲柄穗頂草屬、Calosteca、昆士蘭隱草屬、Camusiella、細柄草屬、堡壘草屬、沿溝草屬、小沿溝草屬、實心草屬、繩柄草屬、Cathestechum、蒺藜草屬、酸模芒屬、巴西雀稗屬、白霜草屬、空竹屬、Chaboissaea、剛毛草屬、南非雀麥屬、東非早熟禾屬、剛須草屬、Chaetostichium、短針狗尾草屬、喀拉拉草屬、Chasechloa、開口草屬、假葉柄草屬、隱節草屬、山澗草屬、剛竹屬、葫蘆草屬、白穗茅屬、Chloachne、虎尾草屬、東非綠苞草屬、金草屬、金須茅屬、Chumsriella、丘斯夸竹屬、單蕊草屬、木本畫眉草屬、閉穗草屬、閉殼草屬、澳隱黍屬、Cliffordiochloa、Cockaynea、小麗草屬、Coelachyropsis、天殼草屬、空軸茅屬、薏米、短序竹屬、莎禾屬、鞘柄茅屬、Commelinidium、Cornucopiae、蒲葦屬、棒芒草屬、寇蒂禾屬、Craspedorhachis、Crinipes、類大麥屬、隱花草屬、隱藏[竹+禾]屬、櫛茅屬、Ctenopsis、海濱草屬、錫金杯禾屬、匍匐圓穗草屬、香茅屬、Cymbosetaria、狗牙根屬、洋狗尾草屬、薹草禾屬、駝蜀黍屬、Cypholepis、弓果黍屬、鴨茅屬、Dactylocteninm、Dahiopholis、Dallwatsonia、Danthonia、Danthoniastrum、Danthonidium、Danthoniopsis、Dasyochloa、Dasypoa、Dasypyrum、Davidsea、Decaryella、Decaryochloa、Dendrocalamus、Dendrochloa、Deschampsia、Desmazeria、Desmostachya、Deyeuxia、Diandrochloa、Diandrolyra、Diandrostachya、Diarrhena、Dichaetaria、Dichanthelium、Dichanthium、Dichelachne、Diectomis、Dielsiochloa、Digastrium、馬唐屬、Digitariopsis、Dignathia、Diheteropogon、Dilophotriche、Dimeria、Dimorphochloa、Dinebra、Dinochloa、Diplachne、Diplopogon、Dissanthelium、Dissochondrus、Distichlis、Drake-Brochnania、Dregeochloa、Drepanostachyum、Dryopoa、Dupontia、Duthiea、Dybowskia、Eccoilopus、Eccoptocarpha、Echinaria、Echinochloa、Echinolaena、Echinopogon、Ectros[iota]a、Ectrosiopsis、Ehrharta、Ekmanochloa、蟋蟀草屬、Elionurus、Efymandra、野麥屬、Elytrigia、Elytrophorus、Elytrostachys、Enneapogon、Enteropogon、Entolasia、Entoplocamia、Eragrostiella、Emgrostis、Eremium、Eremochloa、Eremopoa、Eremopogon、Eremopyrum、Eriachne、Erianthecium、蔗茅屬、Eriochloa、Eriochrysis、Erioneuron、Euchlaena、Euclasta、Eulalia、Eulaliopsis、Eustachys、Euthryptochloa、Exotheca、Fargesia、Farrago、Fasciculochloa、羊茅屬、Festucella、Festucopsis、Fingerhuthia、Froesiochloa、Garnotia、Gastridium、Gaudinia、Gaudiniopsis、Germainia、Gerritea、Gigantochloa、Gilgiochloa、Glaziophyton、甜茅屬、Glyphochloa、Gouinia、Gouldochloa、Graphephorum、Greslania、Griffithsochloa、Guaduella、Gymnachne、Gymnopogon、Gynerium、Habrochloa、Hackelochloa、Hainardia、Hakonechloa、Halopyrum、Harpachne、Harpochloa、Helictotrichon、Helleria、Hemarthria、Hemi sorghum、Henrardia、Hesperostipa、Heterachne、Heteranthelium、Heteranthoecia、Heterocarpha、Heteropholis、Heteropogon、Hibanobambusa、Hickelia、Hierochloe、Hilaria、Hitchcockella、Holcolemma、絨毛草屬、Homolepis、Homopholis、Homozeugos、Hookerochloa、Hordelymus、大麥屬、Hubbardia、Hubbardochloa、Humbertochloa、Hyalopoa、Hydrochloa、Hydrothauma、Hygrochloa、Hygroryza、Hylebates、Hymenachne、Hyparrhenia、Hyperthelia、Hypogynium、Hypseochloa、Hystrix、Ichnanthus、Imperata、Indocalamus、Indopoa、Indosasa、Isachne、Isalus、Ischaemum、Ischnochloa、Ischnurus、Iseilema、Ixophorus、Jansenella、Jardinea、Jouvea、Joycea、Kampochloa、Kaokochloa、Karroochloa、Kengia、Kengyilia、Kerriochloa、Koeleria、Lagurus、Latnarckia、Lamprothyrsus、Lasiacis、Lasiorhachis、Lasiurus、Lecomtella、Leersia、Lepargochloa、Leptagrostis、Leptaspis、Leptocarydion、Leptochloa、Leptochlopsis、Leptocoryphium、Leptoloma、Leptosaccharum、Leptothrium、Lepturella、Lepturidium、Lepturopetium、Lepturus、Leucophrys、Leucopoa、濱麥屬、Libyella、Limnas、Limnodea、Limnopoa、Lindbergella、Linkagrostis、Lintonia、Lithachne、Littledalea、Loliolum、黑麥草屬、Lombardochloa、Lophacme、Lophatherum、Lopholepis、Lophopogon、Lophopyrum、Lorenzochloa、Loudetia、Loudetiopsis、Louisiella、Loxodera、Luziola、Lycochloa、Lycurus、Lygeum、Maclurolyra、Maillea、Malacurus、Maltebrunia、Manisuris、Megalachne、Megaloprotachne、Megastachya、Melanocenchris、Melica、Melinis、Melocalamus、Melocanna、Merostachys、Merxmuellera、Mesosetum、Metasasa、Metcalfia、Mibora、Micraira、Microbriza、Microcalamus、Microchloa、Microlaena、Micropyropsis、Micropyrum、Microstegium、Mildbraediochloa、Milium、Miscanthidium、Miscanthus、Mnesithea、Mniochloa、Molinia、Monachather、Monanthochloe、Monelytrum、Monium、Monocladus、Monocymbium、Monodia、Mosdenia、亂子草屬、Munroa、Myriocladus、Myriostachya、Narduroides、Nardus、Narenga、Nassella、Nastus、Ne畫眉草屬、Neesiochloa、Nematopoa、Neobouteloua、Neohouzeaua、Neostapfia、Neostapfiella、Nephelochloa、Neurachne、Neurolepis、Neyraudia、Notochloe、Notodanthonia、Ochlandra、Ochthochloa、Odontelytrum、Odyssea、Olmeca、Olyra、Ophiochloa、Ophiuros、Opizia、Oplismenopsis、Oplismenus、Orcuttia、Oreobambos、Oreochloa、Orinus、Oropetium、Ortachne、Orthoclada、稻屬、Oryzidium、落芒草屬、Otachyrium、Otatea、Ottochloa、Oxychloris、Oxyrhachis、Oxytenanthera、黍屬、Pappophorum、Parafestuca、Parahyparrhenia、Paraneurachne、Parapholis、Paratheria、Parectenium、Pariana、Parodiolyra、Pascopyrum、Paspalidium、雀稗屬、狼尾草屬、Pentameris、Pentapogon、Pentarrhaphis、Pentaschistis、Pereilema、Periballia、Peridictyon、Perotis、Perrierbambus、Perulifera、Petriella、Peyritschia、Phacelurus、Phaenanthoecium、Phaenosperma、草蘆屬(Phalaris)、Phar us、Pheidochloa、Phippsia、梯牧草屬、Pholiurus、Phragmites、Phyllorhachis、Phyllostachys、Pilgerochloa、Piptatherum、Piptochaetium、Piptophyllum、Piresia、Piresiella、Plagiantha、Plagiosetum、Planichloa、Plectrachne、Pleiadelphia、Pleioblastus、Pleuropogon、Plinthanthesis、Poa-Bluegrass(grass)、Pobeguinea、Podophorus、Poecilostachys、Pogonachne、Pogonarthria、Pogonatherum、Pogoneura、Pogonochloa、Pohlidium、Poidium、Polevansia、Polliniopsis、Polypogon、Polytoca、Polytrias、Pommereulla、Porteresia、Potamophila、Pringleochloa、Prionanthium、Prosphytochloa、Psammagrostis、Psammochloa、Psathyrostachys、Pseudanthistiria、Pseudarrhenatherum、Pseudechinolaena、Pseudobrornus、Pseudochaetochloa、Pseudocoix、Pseudodanthonia、Pseudodichanthium、Pseudopentameris、Pseudophleum、Pseudopogonatherum、Pseudoraphis、Pseudoroegneria、茶軒竹屬、Pseudosorghum、Pseudostachyum、Pseudovossia、Pseudoxytenanthera、Pseudozoysia、Psilathera、Psilolemma、Psilurus、Pterochloris、Ptilagrostis、Puccinellia、Puelia、總序竹屬、Raddia、Raddiella、Ratzeburgia、Redfieldia、Reederochloa、Rehia、Reimarochloa、Reitzia、Relchela、Rendlia、Reynaudia、Rhipidocladum、Rhizocephalus、Rhomboelytrum、Rhynchelytrum、Rhynchoryza、Rhytachne、Richardsiella、Robynsiochloa、Rottboellia、Rytidosperma、Saccharum、Sacciolepis、Sartidia、赤竹屬、Sasaella、Sasamorpha、Saugetia、Schaffnerella、Schedonnardus、Schenckochloa、Schismus、Schizachne、Schizachyrium、葸勞竹屬(Schizostachyum)、Schmidtia、Schoenefeldia、Sclerachne、Sclerochloa、Sclerodactylon、Scleropogon、Sclerostachya、Scolochloa、Scribne[eta]a、Scrotochloa、Scutachne、Secale、Sehima、Semiarundinaria、Sesleria、Sesleriella、Setaria、Setariopsis、Shibataea、Silentvalleya、Simplicia、Sinarundinaria、Sinobambusa、Sinochasea、Sitanion、Snowdenia、Soderstromia、Sohnsia、Sorghastrum、Sorghum、Spartina、Spartochloa、Spathia、Sphaerobambos、Sphaerocaryum、Spheneria、Sphenopholis、Sphenopus、鬣刺屬、Spodiopogon、Sporobolus、Steinchisma、Steirachne、Stenotaphrum、Stephanachne、Stereochlaena、Steyermarkochloa、Stiburus、Stilpnophleum、針茅屬、Stipagrostis、Streblochaete、Streptochaeta、Streptogyna、Streptolophus、Streptostachys、Styppeiochloa、Sucrea、Suddia、Swallenia、Swa[iota]lenochloa、Symplectrodia、Taeniatherum、Taeniorhachis、Tarigidia、Tatianyx、Teinostachyum、Tetrachaete、Tetrachne、Tetrapogon、Tetrarrhena、筱竹屬、Thaumastochloa、Thelepogon、Thellungia、Themeda、Thinopyrum、Thrasya、Thrasyopsis、Thuarea、Thyridachne、Thyridolepis、Thyrsia、Thyrsostachys、Thysanolaena、Torreyochloa、Tovarochloa、Trachypogon、Trachys、Tragus、Tnbolium、Tricholaena、Trichoneura、Trichoptet[gamma]x、Tridens、Trikeraia、Trilobachne、Triniochloa、三齒稃屬、Triplachne、Triplasis、Triplopogon、Tripogon、Tripsacum、Triraphis、Triscenia、Trisetum、Tristachya、小麥屬、Tsvelevia、Tuctoria、Uniola、Uranthoecium、Urelytrum、Urochloa、Urochondra、Vahlodea、Vaseyochloa、Ventenata、Vetiveria、Vietnamochloa、Vietnamosasa、Viguierella、Vossia、Vulpia、Vulpiella、Wangenheimia、Whiteochloa、Willkommia、Xerochloa、Yakirra、Ystia、玉山竹屬、Yvesia、玉蜀黍屬、Zenkeria、Zeugites、Zingeria、菰屬、Zizaniopsis、Zonotriche、Zoysia、Zygochlo組成的組中的屬的轉基因植物或細胞。
在一個實例中，禾本科植物是大麥屬屬。大麥屬屬中的合適種類對于本領域人員是顯而易見的，并包括例如H.chilense、H.cordobense、H.euclaston、H.flexuosum、H.intercedens、H.muticum、H.pusillum、H.stenostachys、H.arizonicum、H.comosum、H.jubatum、H.lechleri、H.procerum、H.pubiflorum、H.bulbosum、H.bulbosum、H.bulbosum、H.bulbosum、H.murinum ssp glaucum、H.murinum ssp leporinum、H.murinum ssp murinum、H.vulgare ssp spontaneum、H.vulgare ssp vulgare、H.bogdanii、H.brachyantherum ssp brachyantherum、H.brachyantherum ssp californicum、H.brevisubulatum ssp brevisubulatum、H.capense、H、depressum、H.erectifolium、H.guatemalense、H.marinum ssp marinum、H.marinum ssp gussoneanum、H.parodii、H.patagonicum ssp magellanicum、H.patagonicum ssp mustersii、H.patagonicum ssp patagonicum、H.patagonicum ssp santacrucense、H.patagonicum ssp setifolium、H.roshevitzii、H.secalinum或H.tetraplodum。
在另一個實例中，禾本科植物是裸麥草。合適的裸麥草種類對于本領域人員也是顯而易見的。例如，合適的裸麥草種類包括多年生黑麥草、浮床黑麥草、L.rigidum或毒麥。
在另一個實例中，禾本科植物是稻。合適的稻種類和/或變體對于本領域人員也是顯而易見的。例如，合適的稻變體包括koshihikari、opus、millin、amaroo、jarrah、illabong、langi、doongara、kyema、basmati、bombia、carnaroli、baldo、roma、nero或Arborio。
在另一個實例中，禾本科植物是玉米。合適的玉米種類和/或變體對于本領域人員也是顯而易見的。例如，合適的玉米變體包括algans、aldante、avenir、Hudson、loft、tasilo、GH128、GH390、QK694和Hycorn 1、General和PX75。
優選地，禾本科植物是小麥。例如，小麥是二倍體小麥例如一粒小麥。
或者，小麥是四倍體小麥，例如波斯小麥(例如品種硬粒小麥(T.durum)、波蘭小麥(T.polonicum)、歐毒麥、東方小麥(T.turanicum)或波斯小麥)或硬粒小麥。
優選地，小麥是六倍體小麥。例如，小麥株/系/品種/栽培品種是冬小麥株/系/品種/栽培品種和/或春小麥株/系/品種/栽培品種。
在一個實例中，小麥株/系/品種/栽培品種是例如在澳大利亞生長或生產的株/系/品種/栽培品種。例如，小麥株或品種選自由Halberd、Cranbrook、Chuan Mai18(CmI8)、Vigour18(Vl8)、Gba Sapphire、Wyalkatchem、Annuello、Wawht2499、Ega Eagle Rock、Gba Ruby、Gba Shenton、Carnamah、Arrino、Babbler、Barunga、Batavia、Baxter、Blade Older、、Brookton、Cadoux、Calingiri、Camm、Carnamah、Cascades、Chara、Condor、Cunningham、Dollarbird、Diamondbird、Eradu、Excalibur、Frame、Goldmark、Goroke、H45、Hartog、Hybrid Mercury、Janz、Kelalac、Kennedy、Krichauff、Lang、Machete、Meering、Mitre、Ouyen、Petrie、Silverstar、Spear Older、Stiletto、Strzelecki、Sunbri、Sunbrook、Sunco、Sunlin、Sunstate、Sunvale、Trident、Westonia、Whistler、Worrakatta、Wylah、Yitpi及其雜交體和雜合體組成的組。
在另一個實例中，小麥株/系/品種/栽培品種是通常生長在北美的株/系/品種/栽培品種，例如，Fielder、Wawawai、Zak、Scarlet、Tara、Neeley、UC1036、Karl、Jagger、Tam106、Bobwhite、Crocus、Columbus、Kyle、Chinese Spring、Alpowa、Hank、Edwall、Penawawa、Calorwa、Winsome、Butte86、Challis、Maron、Eden、WPB926、WA7839、WA7859、WA7860、WA7875、WA7877、WA7883、WA7884、WA7886、WA7887、WA7890、WA7892、WA7893、WA7900、WA7901、WA7904、WA7914或WA7915。
在另一個實例中，小麥株/系/品種/栽培品種是通常生長在歐洲的株/系/品種/栽培品種，例如，Terra、Brigadier And Hussar、Hunter、Riband、Mercia、Hereward、Spark、Pastiche、Talon、Rialto、Shiraz、FAP75141、Boval、Renan、Derenb Silber、FAP75337、Iena、Cappelle、Champlein、Roazon、VPM、Kanzler、Monopol、Carstacht、Vuka、Tamaro、M.Huntsman、Rektor、Bernina、Greif、Caribo、Ares、Kraka、Kronjuwel、Granada、Apollo、Basalt、FAP75527、FAP75507、Galaxie、Obelisk、Forno、Heinevii、Kormoran、Merlin、Bussard、Sperber、FAP75517、Arina、Zenith、FAP754561、Probus、FAP75468、FAP62420、Bezostaja、Kavkas、Timmo、Maris Butler、Sicco、Broom Highbury、Avalon、Fenman、Bounty、Copain、Baron、Norman、Hustler、Kador、Sentry、Flanders、Armada、Brigand或Rapier。
在進一步的實施例中，小麥株/系/品種/栽培品種是良種的株/系/品種/栽培品種。在這個方面，“良種”株/系/品種/栽培品種一般顯示出改良了的生長特性例如對植物病原體的抗性或抗旱性或抗干性。
在另一個實例中，小麥株/系/品種/栽培品種是小麥的合成衍生物。利用通過培育小麥與非培育小麥的雜交產生這種合成衍生物，據此提高或增強所述小麥的遺傳多樣性。大量的合成小麥衍生物是本領域已知的，并包括例如波斯小麥和T.taschii之間的雜交體。這種雜交模擬了天然發生的產生了現有的六倍體面包小麥的雜交過程。這些合成小麥衍生物的合適來源對于本領域人員是顯而易見的，并包括例如CIMMYT(國際玉米和小麥改良中心；Km.45，Carretera Mexico-Veracruz.El Batan，Texcoco，Edo.de Mexico，CP56130 Mexico)。
合成小麥衍生物的實例包括例如CIGM90.590、CIGM88.1536-0B、CIGM90.897、CIGM93.183、CIGM87.2765、CIGM87.2767、CIGM90.561、CIGM88.1239、CIGM88.1344、CIGM92.1727、CIGM90.845、CIGM90.846、CIGM90.257-1、CIGM91.61-1、CIGM90.462、CIGM90.248-1、CIGM90.250-2、CIGM90.412、CIGM90.590、CIGM87.2765-1B-0PR-0B、CIGM88.1175-0B、CIGM87.2767-1B-0PR-0B、CIGM87.2775-1B-0PR-0B、CIGM87.2768-1B-0PR-0B、CIGM86.946-1B-0B-0PR-0B、CIGM87.2770-1B-0PR-0B、CIGM88.1194-0B、CIGM87.2771-1B-0PR-0B、CIGM88.1197-0B、CIGM88.1200-0B、CIGM86.959-1M-1Y-0B-0PR-0B、CIGM88.1209-0B、CIGM90-561、CIGM86.1211-0B、CIGM86.940-1B-0B-0PR-0B、CIGM87.2760-0B-0PR-0B、CIGM88.1212-0B、CIGM86.953-1M-1Y-0B-0PR-0B、CIGM87.2761-1B-0PR-0B、CIGM88.1214-0B、CIGM88.1216-0B、CIGM88.1219-0B、CIGM86.950-1M-1Y-0B-0PR-0B、CIGM86.942-1B-0PR-0B、CIGM90.525、CIGM88.1270-0B、CIGM88.1273-0Y、CIGM88.1288-0B、CIGM88.1313、CIGM88.1313、CIGM88.1344-0B、CIGM88.1273-0Y、CIGM88.1363-0B、CIGM88.1362-0Y、CIGM90.566、CIGM90-590、CIGM89.506-0Y、CIGM89.525-0Y、CIGM89.537-0Y、CIGM89.538-0Y、CIGM90.686、CIGM90.760、CIGM89.559、CIGM89.559、CIGM89.479-0Y、CIGM89.561-0Y、CIGM90.543、CIGM89.564-0Y、CIGM86.944-1B-0Y、0B-0PR-0B、CIGM86-3277-1B-0B-0PR-0B、CIGM88.1239-2B、CIGM89.567-1B、CIGM90.799、CIGM90.808、CIGM90.812、CIGM90.815、CIGM90.818、CIGM90.820、CIGM90.824、CIGM90.845、CIGM90.846、CIGM90.863、CIGM90.864、CIGM90.865、CIGM90.869、CIGM90.871、CIGM90.878、CIGM90.897、CIGM90.898、CIGM90.906、CIGM90.911、CIGM90.910、CIGM92.1647、CIGM92.1665、CIGM92.1666、CIGM92.1667、CIGM92.1682、CIGM92.1713、CIGM92.1721、CIGM92.1723、CIGM92.1727、CIGM92.1871、CIGM93.183、CIGM93.229、CIGM93.237、CIGM93.388、CIGM93.261、CIGM93.395、CIGM93.266、CIGM93.297、CIGM93.300、CIGM93.406、CIGM93.306、CIGM88.1182-0Y、CIGM87.2754-1B-0PR-0B、CIGM86.951-1B-0B-0PR-0B、CIGM86.955-1M-1Y-0B-0PR-0B、CIGM88.1217-0B、CIGM88.1228-0B、CIGM88.1240-0B、CIGM90.809、CIGM90.826、CIGM90.896、CIGM93.377、CIGM93.299、CIGM93.302、CASW94Y00092S、CASW94Y00095S、CASW94Y00116S、CASW94Y00130S、CASW94Y00144S、CASW94Y00151S、CASW94Y00155S、CASW94Y00156S、CASW94Y00230S、CASW95Y00102S、CASW96Y00555S、CASW96Y00568S、CASW96Y00573S、CASW98B00011S、CASW98B00031S、CASW98B00032S、CASW98B00036S、CASW98B00044S、CASW98B00049S或CASW98B00061S。在這個方面，CIGM編號或CASW編碼指的是上面對應于CIMMYT所采用的應用于小麥株的雜交鑒定編號。
或者，例如在Oliver et al，Crop Science，451353-1360，2005中描述了合成小麥衍生物。
在另一個實例中，小麥品種或品種(或基因型)選自由Bobwhite、Chara、Camm、Krichauff、Diamondbird、Yitpi、Wedgetail、Wyalkatchem、Calingiri、Babbler、Silverstar、Sapphire、Frame、Aus29597、Aus29614、Canon、Sunco、Cherinya、Ventura、Tammarin Rock、Kukri、Janz、Sunco、Tasman、Cranbrook、Halberd DH、CIMMYT非合成衍生物、例如澳大利亞小麥育種企業例如西澳大利亞農業部和Australian Grain Technologies Pty Ltd產生的優良育種系以及其雜交體和雜合體組成的組。
在進一步的實施例中，小麥品種或品種(或基因型)選自由Bobwhite、Chara、Camm、Krichauff、Diamondbird、Yitpi、Wedgetail、Wyalkatchem、Calingiri、Babbler、Silverstar、Sapphire、Frame、Aus29597、Aus29614及其雜交體和雜合體組成的組。
本領域人員能夠確定出任何其他的可被本發明的方法轉化的小麥株、品種/栽培品種或育種系。
2、從成熟籽粒獲得胚 本領域人員知道用于確定出禾本科植物的籽粒發育期的方法，例如用于確定籽粒是否完成了籽粒灌漿的方法。例如，成熟的小麥種子包括近似35％水分。因此，通過選擇具有約35％或更少水分的小麥種子，可以選出成熟的籽粒。利用濕度計(例如購自Perten Instruments，Springfield，IL，USA)或者利用射頻監視器(例如Lawrence and Nelson，Sensor Update，7377-392，2001所述)確定出小麥種子的水分。
或者，確定出籽粒胚乳細胞的核內復制水平。用于確定胚乳細胞的核內復制水平的合適方法對于本領域人員是顯而易見的，并包括例如Dilkes et al，Genetics，1601163-1177，2002所述的那些方法。例如，分離(例如切取)出小麥籽粒的胚乳，并將其在適用于裂解植物細胞的緩沖液中勻漿化。然后利用流式細胞術例如通過檢測每個核內與核酸結合的4′，6-二脒基-2-苯吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole)水平來確定出先前確定出的核數目中的核酸水平。其中沒有或者極少有正在進行核內復制的細胞的胚乳被認為是來自成熟籽粒。
或者，確定出籽粒例如小麥籽粒的胚乳中的淀粉水平，以便鑒定出成熟籽粒。例如，利用基于淀粉葡糖苷酶/α淀粉酶的方法(例如Megazyme總淀粉檢測法)確定出籽粒胚乳中的淀粉水平。這種方法一般包括利用淀粉葡糖苷酶/α淀粉酶水解并溶解來自禾本科植物胚乳的淀粉。淀粉糊精被水解成葡萄糖，然后用例如利用4-氨基安體比林的葡萄糖氧化酶-辣根過氧化物酶反應定量出葡萄糖的量。例如在McLeary et al，J.Cereal Set，2051-58，1994中描述了這種方法。
或者，利用肉眼觀察確定出成熟籽粒。例如，其中穎片和花梗不再為綠的以及植物仍殘留有少量綠色的小麥籽粒被認為是成熟的小麥籽粒。同樣，其中粒為硬的但是仍可被指甲壓扁的小麥籽粒和/或源自完全黃色植物的小麥籽粒都被認為是成熟籽粒。
在另一個實例中，從懷疑包括成熟籽粒的植物中收集到籽粒。例如，利用Bauer、Fanning、Enz和Eberlein提出的生長度計算方法估計出小麥籽粒的成熟度(1984，Use of growing-degree days to determine spring wheat growthstages.North Dakota Coop.Ext.Ser.EB-37.Fargo，ND)。
在分離出成熟籽粒之后，例如通過從籽粒中切下或割下胚細胞分離出籽粒的胚細胞。用于從成熟籽粒獲得胚細胞的方法對于本領域人員是顯而易見的，并在例如Delporte et al，Plant Cell Tiss.Organ Cult.6773-80，2001中有所描述。例如，用刀片(例如解剖刀)切下胚。在一個實例中，在水中浸泡種子一段時間(例如1到2個小時)，以便有助于從籽粒中獲得所述胚細胞。
在一個實例中，去除成熟胚的種皮。用于去除種皮的方法對于本領域人員是顯而易見的。例如，利用刀片(例如解剖刀)切下成熟胚的種皮。
或者，通過用刀子或磨料破裂或磨破種皮來去除種皮。例如也可以通過用酸(例如硫酸)或溶劑(例如丙酮或乙醇)接觸胚一段足以去除種皮的時間來去除種皮。
3、細菌對成熟胚的轉化 3.1 合適的細菌菌株 用于將核酸引入到禾本科植物細胞內的合適細菌對于本領域人員是顯而易見的。例如Broothaerts et al.，Nature 433629-633，2005描述了利用根瘤菌NGR234或Sinorhizobium meliloti或Mesorhizobium loti產生轉基因植物。因此，利用這些細菌中的任一種細菌或者用土壤桿菌屬進行在任一實施方式中所述的本發明的轉化方法是優選的。在各種情況中，用Ti載體裝載被轉移到轉基因植物中的核酸。此外，轉化方法與用于土壤桿菌的那些方法相似。因此，在此提供的關于用于土壤桿菌的載體和轉化方法的描述都應當依照實施情況應用于利用一種或多種先前所述的細菌進行的轉化。
在本發明的一個實例中，利用土壤桿菌將核酸引入到禾本科植物細胞內。土壤桿菌屬的成員是其天然環境為土壤攜帶的、革蘭陰性、桿狀的植物致病性細菌，它會引起冠癭病或毛根病。術語“土壤桿菌”包括但不限于菌株根瘤土壤桿菌(常常引起受感染植物的冠癭病)和毛根土壤桿菌(常常引起受感染宿主植物的毛根病)。植物細胞感染土壤桿菌一般會造成受感染細胞產生冠癭堿(例如胭脂堿、農桿堿、章魚堿等)。因此，會引起胭脂堿產生的土壤桿菌(例如菌株LBA4301、C58、A208、GV3101)被稱作“胭脂堿型”土壤桿菌；會引起章魚堿產生的土壤桿菌(例如菌株LBA4404、Ach5、B6)被稱作“章魚堿型”土壤桿菌；以及引起農桿堿產生的土壤桿菌(例如菌株EHA105、EHA101、A281)被稱作“農桿堿型”土壤桿菌。
在一個實例中，利用根瘤土壤桿菌或毛根土壤桿菌將核酸引入到禾本科植物內。優選地，根瘤土壤桿菌或毛根土壤桿菌是減毒(disarmed)土壤桿菌。在這個方面，減毒土壤桿菌包括感染植物細胞所需的基因(例如vir基因)，但是缺少引起植物疾病例如冠癭病所需的核酸。
一般由菌株的染色體背景以及菌株中所有的固有或內源性Ti質粒定義出根瘤土壤桿菌菌株。表1給出了合適的土壤桿菌菌株及其染色體背景和Ti質粒的實例

在一個實例中，用于本發明的根瘤土壤桿菌具有提高了的感染植物細胞的能力。具有提高感染性的合適的菌株是本領域已知的。例如，已經產生了包括增加水平的virG或增加水平的活性virG的菌株(Zupan et al，Plant J，2311-28，2000)。virG表達或活化水平的增加造成了vir簇中剩余基因表達的增加，據此增強了根瘤土壤桿菌的感染性。
再者或另外，根瘤土壤桿菌包括增強了的virE1表達(Zupan et al，同上)。VirE1表達單鏈DNA結合蛋白，其結合轉移的T-DNA的T鏈，據此增強了T-DNA向植物細胞內的引入。
根瘤土壤桿菌的其他菌株對于本領域人員是顯而易見的，并包括例如A281(Hood et al，J.Bacteriol 1681291-1301，1986)。
合適的毛根土壤桿菌菌株對于本領域人員是顯而易見的。例如，所述菌株選自由R1601、R1000、ATCC15834、MAFF03-01724、A4RS、LBA9402和LMG 1500組成的組(Han et al，Can.J.For.Res.，27464-470，1997或Baiset al，Current Science，8083-87，2001)。合適的毛根土壤桿菌來源對于本領域人員是顯而易見的。本領域人員也知道在利用毛根土壤桿菌將核酸引入到植物細胞內之后，誘導了根產生。然后利用本領域已知的和/或在此所述的方法用根再生出小植物(如產生苗)。
3.2 核酸構建體 因為本發明的轉化方法使用細菌(優選地是土壤桿菌)，因此合適的核酸構建體一般包括或者是由Ti質粒(對于根瘤土壤桿菌而言)或者Ri質粒(對于毛根土壤桿菌而言)組成的。在本發明的上下文中，這種載體一般包括被引入到植物細胞的轉移核酸內的相關轉基因。下面更詳細地描述了合適的轉基因。本節描述了用于向植物細胞內引入核酸的合適的構建體。
在一個實例中，核酸構建體包括缺陷重復DNA(也稱作左邊界(LB)和右邊界(RB))位于兩側或者給定界線的相關轉基因，SEQ ID NO1和2分別給出了示例LB和RB的核苷酸序列。優選地，用于本發明方法中的合適的核酸構建體包括合適的LB和RB。
3.2.1 啟動子 在另一個實例中，核酸構建體包括與合適啟動子可操縱連接的轉基因和/或選擇標記物基因和/或檢測標記物基因。
在另一個實例中，相關轉基因和/或選擇/檢測標記物基因與在植物細胞內可操縱的啟動子可操縱的連接。在這個方面，啟動子不必一定是在經本發明的方法最初被轉化的植物細胞內可操縱的，而是啟動子在特殊的細胞類型或發育階段可以是可誘導的和/或可操縱的。
適用于在植物內表達的核酸構建體中的啟動子(例如驅動轉基因和/或選擇/檢測標記物基因的表達)包括例如那些源自病毒基因、酵母基因、霉菌基因、細菌基因、昆蟲基因、鳥類基因、哺乳動物基因和植物基因的能夠在禾本科植物細胞內發揮功能的啟動子。就其表達所發生的組織而言，或者就其表達所發生的發育階段而言，或者應答于外在刺激例如生理應激、病原體或金屬離子等等，啟動子可以組成地或分化地調節基因表達。
用于實施本發明的啟動子實例包括CaMV35S啟動子(SEQ ID NO3)、玉米遍在蛋白啟動子(SEQ ID NO4)、稻肌動蛋白1啟動子(SEQ ID NO5)、玉米乙醇脫氫酶1啟動子、pEMU合成啟動子(Last et al，Theor.Appl.Genet.81，581-588，1991)、來自擬南芥的rd29a誘導型啟動子(SEQ ID NO6)、來自甘蔗桿菌病毒的ScBV啟動子(SEQ ID NO6)、來自大麥的basi啟動子(SEQ ID NO7)或來自裸麥草的cad2啟動子。
除了在此給出的特殊啟動子外，所謂持家基因的細胞啟動子包括肌動蛋白啟動子或組氨酸編碼基因的啟動子也是有用的。
或者，使用誘導型啟動子。誘導型啟動子是由特殊刺激例如應激狀態包括光、溫度、化學物、干旱、高鹽度、滲透沖擊、氧化狀態或致病性所誘導的啟動子。
3.2.2 選擇和/或檢測標記物 在另一個實例中，核酸構建體包括一個或多個選擇和/或檢測標記物，其有助于對包括所述核酸構建體或其片段的細菌細胞和/或植物細胞的選擇和/或檢測。
細菌選擇標記物 在一個實例中，核酸構建體包括編碼在細菌細胞內可操縱的選擇和/或檢測標記物的核酸。這種選擇和/或檢測標記物有助于選擇或鑒定出包括核酸構建體的細菌細胞。但是，如上討論的那樣，一些細菌菌株例如土壤桿菌菌株也包括編碼選擇和/或檢測報告子的基因。在這個方面，優選地是核酸內的選擇和/或檢測報告子基因要不同于細菌菌株所用的報告子基因。
一般而言，核酸構建體包括賦予細菌細胞對細胞毒化合物的抗性的選擇標記物。例如，核酸構建體包括編碼賦予對卡那霉素、慶大霉素、四環素、鏈霉素或壯觀霉素的抗性的多肽的選擇標記物。
植物選擇和/或檢測標記物 在另一個實例中，核酸構建體包括編碼在植物細胞內可操縱的選擇和/或檢測標記物的核酸。這種選擇和/或檢測標記物有助于選擇和/或鑒定出已經本發明的方法轉化的植物細胞。對于本領域人員顯而易見的是，這種選擇和/或檢測標記物優選地位于構建體的轉移核酸內，據此有助于其被引入到植物細胞內。
在一個實例中，核酸包括在植物內可操縱的選擇標記物。合適的選擇標記物對于本領域人員是顯而易見的。例如，選擇標記物是編碼L-2-氨基-4(羥基)(甲基)氧膦基丁酸(phosphinothricin)乙酰轉移酶(pat)(SEQ ID NO9)的bar基因(雙丙氨膦抗性基因)(SEQ ID NO8)。
或者，選擇標記物提供了對抗生素的耐藥性。例如，選擇標記物是由細菌新霉素磷酸轉移酶II(nptII)基因(SEQ ID NO10)編碼的，其提供了對氨基糖甙抗生素的耐藥性。或者，選擇標記物是由潮霉素磷酸轉移酶基因(SEQ ID NO12)(提供了對潮霉素B的耐藥性)或aacC3基因或aacCA基因(提供了對慶大霉素的耐藥性)或氯霉素乙酰轉移酶基因(SEQ ID NO14)(提供了對氯霉素的耐藥性)。
在另一個實例中，選擇標記物賦予了對殺蟲劑的抗性。例如，選擇標記物是編碼5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate)合酶(SEQ ID NO16)或L-2-氨基-4(羥基)(甲基)氧膦基丁酸(phosphinothricin)合酶(SEQ ID NO18)的基因，其分別提供了對草甘膦和/或草胺磷殺蟲劑的抗性。來自土壤桿菌菌株4的5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(CPA)(SEQ ID NO20)基因和草甘膦氧化還原酶(GOX)基因(SEQ ID NO22)也編碼提供了對草甘膦銨殺蟲劑的抗性的多肽(Zhouet al，Plant Cell Reports，15159-163，1995)。
在另一個實例中，選擇標記物賦予了能夠在未轉化植物細胞不能生長和/或存活的化合物中存活和/或生長的能力。例如，選擇標記物是由大腸桿菌的mana基因(SEQ ID NO24)編碼的甘露糖-6-磷酸異構酶(MPI)(Hansenand Wright，Trends in Plant Sciences，4226-231，1999)。MPI容許轉化細胞在以甘露糖為碳源的條件下生長。
或者，選擇標記物是由氰酰胺水合酶(Cah)基因(SEQ ID NO26)(如USSN 09/518,988所述)編碼的。氰酰胺水合酶通過將氰酰胺轉化為尿素來容許轉化植物細胞生長在氰酰胺中。
在一個實例中，選擇標記物是例如包括SEQ ID NO28所設核苷酸序列的核酸編碼的D-氨基氧化酶(DAAO)。如上討論的那樣，DAAO容許轉化植物細胞或植物在D-丙氨酸和/或D-絲氨酸的條件下生長。用于產生包括DAAO作為選擇標記物的核酸構建體的合適方法是本領域已知的和/或在Erikson et ah，Nature Biotechnology，22455-458，2004或國際出版物WO2003/060133中所述的方法。根據WO2003/060133的描述，用于利用D-氨基酸選擇的其他合適的選擇標記物對于本領域人員是顯而易見的。例如，選擇標記物是由大腸桿菌的D-氨基酸解氨酶編碼的。
在另一個實例中，核酸構建體包括檢測標記物基因，優選地，轉移核酸包括檢測標記物基因。合適的檢測標記物基因包括例如β葡糖苷酸酶基因(GUS，通過代謝5-溴-4-氯-3-吲哚-1-葡糖苷酸產生藍色沉淀來檢測所述基因的表達)(SEQ ID NO30)、細菌螢光素酶基因(SEQ ID NO32)、螢火蟲螢光素酶基因(在用螢光素接觸植物細胞后可檢測到)、或β半乳糖苷酶基因(通過代謝5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷產生藍色沉淀來檢測所述基因的表達)(SEQ ID NO34)。
在另一個實例中，檢測標記物是熒光標記物。例如，熒光標記物是單體圓盤海葵(discosoma)紅色熒光蛋白(dsRED、SEQ ID NO36)或Aequoreacoerulescens的單體GFP(SEQ ID NO38)。優選地，標記物是dsRED。用于檢測熒光蛋白的方法對于本領域人員是顯而易見的，并包括例如將植物細胞或植物暴露于合適波長的光，以便激發所述熒光蛋白，并檢測出從所述植物細胞或植物中發射出的光。
3.2.3 核酸構建體的產生 用于產生核酸構建體的方法是本領域已知的和/或在Ausubel et al(InCurrent Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN 047 150338，1987)、Sambrook et al(InMolecular CloningMolecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Third Edition 2001)中所述的方法。通常用已知的方法分離出編碼核酸構建體的組成組分的核酸，所述方法包括例如擴增(用PCR或剪切重疊延伸)或利用一種或多種限制性內切面從生物體的核酸中分離出或者從核酸文庫中分離出所述組分的核酸。這些分離的方法對于本領域一般熟練人員都是顯而易見的。
或者，利用聚合酶鏈反應(PCR)分離出編碼用于本發明方法中的構建體的核酸組分的核酸。PCR方法在本領域是已知的并在Dieffenbach(ed)andDveksler(ed)(InPCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratories，NY，1995)中有所描述。一般而言，用于PCR的兩個非互補的包括至少約20個核苷酸長度以及更優選地至少25個核苷酸長度的核酸引物分子與核酸模板分子的不同鏈雜交，酶擴增出模板的特異的核酸拷貝。優選地，引物與相關核酸(例如轉基因、啟動子和/或編碼檢測標記物或選擇標記物的核酸)鄰近的核酸雜交，據此有助于核酸的擴增。在擴增之后，用本領域已知的方法分離出擴增核酸，優選地將其克隆到合適的載體內，例如在此所述的載體內。
用于產生本發明核酸的其他方法對于本領域人員是顯而易見的，并在本發明的范圍之內。例如，通過將相關轉基因克隆到二元載體內產生核酸構建體。
3.2.4 二元載體 在一個實例中，核酸構建體是包括相關轉基因的Ti質粒或Ri質粒。
優選地，Ti質粒或Ri質粒包括經根瘤土壤桿菌將核酸引入植物細胞內所需的各個vir基因。
優選地，核酸構建體是二元Ti質粒或Ri質粒。根據T-DNA(轉移到植物細胞內的核酸)和轉移T-DNA所需的vir基因可能位于不同質粒上的觀察(Hoekema et al，Nature，303179-180，1983)，產生二元Ti質粒或Ri質粒。在這個方面，一般通過被用于轉化植物細胞的土壤桿菌(例如上述的土壤桿菌菌株)內固有的或內源性的減毒Ti質粒提供vir功能。
因此，二元Ti質粒或Ri質粒包括位于轉移核酸(例如T-DNA)內的轉基因。這種包括轉基因的轉移核酸的兩側一般都是LB和RB，或者所述核酸是由LB和RB給出邊界的。
合適的二元載體是本領域已知的和/或可商品化獲得的。例如，表2描述了二元Ti載體的選擇。
表2可用于土壤桿菌介導的轉化的二元Ti質粒
其他的二元載體例如在Hellens and Mullineaux Trends in Plant Science 5446-451，2000中有描述。
合適的Ri質粒也是本領域已知的，并包括例如pRiA4b(Juouanin，Plasmid，1291-102，1984)、pRil724(Moriguchi et al，J.MoI Biol.307771-784，2001)、pRi2659(Welter et al，Plant Pathol.4P43-50，2000)或pRil855(O′Connell et al，Plasmid 75156-163，1987)。
本發明人還提供了多種適用于將核酸(例如報告子基因)轉移轉化到植物內的二元載體。再者或另外，這些載體適用于進行用于將相關核酸轉化到植物內的修飾。圖8到22描述了每個載體的載體圖譜。
具體的，本發明人提供了5種用于進行禾本科植物的細菌介導轉化的二元載體(見表3和圖15到19)。每個載體都具有pPZP200載體骨架(Hajdukiewicz et al，Plant MoI Biol 25989-94，1994)，并包含嵌合的act1D::gusA或ctlD::sgfp以及有或沒有嵌合的ubi::bar選擇標記物盒。
本發明也提供了包含兩個有助于標記物切割的分離T-DNA的二元基礎載體(圖20)。一個T-DNA含有適用作模塊表達框的多克隆位點，另一個含有適用作選擇標記物盒的R4R3多位點重組盒。多克隆位點是由13個六核苷酸限制性位點、6個八核苷酸限制性位點和5個罕見的歸巢核酸內切酶位點組成，以便有助于模塊化(如Goderis et al，Plant Mol Biol 5017-27，2002所述)。利用這個模塊化系統，可以將最多6個不同的表達框克隆到一個二元載體內。
表3細菌的二元載體 本發明人也提供了用于禾本科植物細胞例如小麥細胞的細菌介導轉化的5個超二元供體和1個超二元受體載體(圖21到25)。每個供體載體都是由pSB11載體骨架(Komari et al，Plant J 10165-174，1996)組成的，其含有嵌合的act1D::gusA或act1D::sgfp，有或沒有嵌合的ubir::bar選擇標記物盒。
pSB1受體載體(圖26)含有一組源自土壤桿菌菌株A281的pTiBo542質粒的致病基因(virG、virB和virC)(Komari，見上)。供體和受體載體都共享有2.7Kb片段，在細菌例如根瘤土壤桿菌的這個區域內發生同源重組(單交叉)，形成雜合體載體。
本發明也提供了含有兩個有助于標記物切割的分離T-DNA的超二元供體基礎載體(圖27)。一個T-DNA含有適用作模塊表達框(例如嵌合的ubir::bar)的多克隆位點，另一個含有適用作嵌合的act1D::gusA或act1D::sgfp的R4R3多位點重組盒。ubi::bar-nos選擇標記物盒已經被克隆到這個基礎載體內(圖28)。
此外，本發明提供了兩個二元基礎載體(圖29和30)。T-DNA含有多克隆位點、嵌合的選擇標記物和R4R3多位點重組盒。載體pPZP200ubi::bar-nos R4R3載體(圖29)包括在多克隆位點上與玉米遍在蛋白啟動子可操縱連接的bar基因。載體pPZP200ubi::dao1-nos R4R3(圖30)包括來自酵母R.gracilis的在多克隆位點上與玉米遍在蛋白啟動子可操縱連接的D-氨基氧化酶基因(dao1)。
本發明人還提供了用于表達抑制性RNA(例如RNAi)的二元基礎載體(見圖31所示)。該載體包括T-DNA，所述T-DNA包括ubi::dao1-nos選擇標記物盒。載體還包括用于克隆相對于RNAi分子的表達為有義或反義定位的核酸的rfa和raf(as)重組位點。
例如，在表2所述的每個參考文獻中也都描述用于生產其他的二元載體的方法。
3.3 向細菌內引入核酸 用于向細菌內引入核酸的方法是本領域已知的。例如，在一個實例中，利用電穿孔將核酸構建體引入到或轉化到細菌內。根據這個實施方式，利用本領域已知的方法制備出轉化感受態細菌。然后在能夠破壞細胞膜的條件下，用核酸構建體接觸所述細胞并將其暴露于電脈沖中一段時間。在一段使得能夠在細菌內表達有功能的報告子基因的合適時間之后，通過將細胞生長在抗生素中來選擇出包括表達載體的那些細胞。用于利用電穿孔轉化細胞的方法是本領域已知的和/或在den Dulk-Ras and Hooykaas，Methods Mol.Biol.5563-72，1995或Tzfira et al，Plant Molecular Biology Reporter，15219-235，1997中所述的方法。
在另一個實例中，利用三親雜交將核酸構建體引入到細菌內。簡單的，三親雜交包括一起培養三種細菌類型，以便有助于核酸構建體從一種細胞類型轉移到另一種細胞類型。例如，在大腸桿菌內產生核酸構建體。但是，大腸桿菌和例如根瘤土壤桿菌不能雜交。因此，使用能夠與兩種細胞類型雜交的輔助細胞，有助于將核酸構建體從大腸桿菌動員或轉移到根瘤土壤桿菌。
在另一個實例中，利用凍融方法例如Gynheung Methods in Enzymol，153292-305，1987所述的方法將核酸構建體引入到細菌內。例如，用核酸構建體接觸細菌，并用液氮冷凍細菌一段時間例如一分鐘。然后在足以誘導其所含的選擇標記物表達的條件下，培養細胞一段時間，選出包括所述構建體的那些細胞。
3.4細菌和胚的接種以及共培養 在一個實例中，轉化方法包括在足以使得所述細菌結合或附著于所述胚細胞的條件下，用包括核酸構建體的細菌接觸胚細胞一段時間(即接種)。例如，在足以使得細菌結合或附著于所述胚細胞的條件下，將胚細胞完全或部分地浸泡在其中已經生長有包括核酸構建體的細菌的培養基中。
因此，在一個實例中，通過實施如下方法用包括如上所述的核酸構建體的細菌接種胚細胞，所述方法包括以下步驟 (i)在足以產生包括核酸構建體的細菌群的條件下，將所述細菌在培養基中生長一段時間；和 (ii)在所述細菌群生長之后，將胚細胞完全或部分地浸泡在所述培養基中，其中在足以使得所述細菌結合或附著于所述胚細胞的條件下，將所述胚細胞浸泡在所述培養基中一段時間。
本領域人員知道用于用細菌接種植物的合適條件。
例如，用細菌接觸胚細胞一段范圍從約5分鐘(Cheng et al，In Vitro CellDev Biol-Plant.39595-604，2003)到約2天的時間。更優選地，用細菌接觸胚細胞一段范圍從約30-60分鐘(Weir et al.，Aust J Plant Physiol.28807-818，2001)到約1天的時間。甚至更優選地，用細菌接觸胚細胞從約60分鐘到約4個個小時，更優選地是為約3個小時(如在此舉例說明的和/或在Chenget al，Plant Physiol.115971-980，1997中所述的)。
優選地，在約21℃到約28℃的溫度下實施接種。更優選地，在約23℃到約26℃的溫度下實施接種。甚至更優選地，在約室溫的溫度下實施接種。
一般而言，都在支持胚細胞和細菌生長和/或生存的培養基中實施接種。合適的培養基是本領域已知的，并包括例如Murashige和Skoog培養基(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)或其稀釋形式。
在一個實例中，用包括酚誘導劑例如乙酰丁香酮、松柏醇或丁香醛的培養基接種胚細胞。在這個方面，已經顯示出乙酰丁香酮顯著地增加了土壤桿菌對T-DNA的轉運(Wu et al，Plant Cell Reports.；21659-668，2003)。優選地，用包括約100μM到約500μM乙酰丁香酮的培養基接種禾本科胚細胞。更優選地，用包括約200μM到約400μM乙酰丁香酮的培養基接種胚細胞。甚至更優選地，用包括約200μM乙酰丁香酮的培養基接種胚細胞。
也已經報道表面活性劑可以增加細菌例如土壤桿菌的T-DNA轉運(Wuet al.，同上)。因此，在一個實例中，用包括表面活性劑的培養基接種胚細胞。合適的表面活性劑的實例包括

(Monsanto)或Tween 20。優選地，培養基包括從約0.01％表面活性劑到約0.5％表面活性劑，更優選地是從約0.1％到約0.4％表面活性劑。
在一個實例中，在暗處實施接種。或者，在亮處下實施接種。
本發明人也已經清楚地證實了在存在細菌氮源的情況下實施的接種可以顯著地增加成熟胚細胞的轉化效率。因此，在本發明的一個實例中，用包括細菌氮源的培養基接種禾本科胚細胞。例如，合適的氮源是植物或動物的蛋白提取物的酶消化物或對植物或動物提取物部分水解產生的水可溶性部分，例如蛋白胨。例如，蛋白胨來自植物例如大豆、蠶豆、小麥或馬鈴薯。或者，蛋白胨來自動物或動物產品例如豬皮、肉或酪蛋白。蛋白胨的合適的商品化來源對于本領域人員是顯而易見的，并包括例如Sigma Aldrich、Organo Technie、GE Healthcare或Novogen。
在一個實例中，用包括大豆蛋白胨(例如SoytoneTM)的培養基接種禾本科胚細胞。例如，用包括從約0.001％到約0.1％蛋白胨(w/v)，更優選地從約0.01％到約0.05％蛋白胨(w/v)以及更優選地約0.02％蛋白胨(w/v)的培養基接種禾本科胚細胞。例如，用包括0.02％大豆蛋白胨(w/v)的培養基接種禾本科胚細胞。
不受理論或行為模式的限制，蛋白胨造成的轉化效率增高可能是細菌例如土壤桿菌增加纖維素微纖維產生的結果，據此增強了所述細菌結合植物胚細胞的能力。因此，在一個實例中，用包括能夠誘導細菌例如土壤攜帶細菌(優選地是土壤桿菌)產生纖維素微纖維的化合物的培養及接種胚的禾本科植物細胞。
在接種之后，一般利用例如真空或吸液去除培養基和未結合的細菌。然后，共培養胚的禾本科植物細胞以及在接種后與之結合的細菌。因此，在一個實例中，本發明的方法包括在足以使得所述細菌感染所述胚細胞的細胞或者所述細菌據此將所述核酸構建體中的轉移核酸引入到所述胚細胞的細胞內的條件下維持培養細胞和包括核酸構建體的細菌。
本領域人員知道用于共培養植物細胞和細菌的合適條件。
例如，在適用于所述胚的禾本科植物細胞和結合細菌的生長和/或存貨的培養基內維持胚的禾本科植物細胞和結合細菌一段時間，范圍從約1天到約5天(Wu et al.，Plant Cell Reports.21659-668，2003)。優選地，共培養胚的禾本科植物細胞和結合細菌一段從約2天到約3天的時間(Weir et al，同上)。在本發明的一個實例中，共培養胚的禾本科植物細胞和結合細菌約3天的時間。
細菌例如土壤桿菌介導成功轉化所需的vir基因最佳地在低于約28℃的溫度下表達(Morbe et al，Molecular Plant-Microbe Interactions，2301-308，1989)。因此，優選地，在低于28℃的溫度下實施共培養。優選地，在范圍從約23℃到約28℃的溫度下實施共培養。更優選地，溫度范圍是從約23℃到約26℃。更優選地，在室溫下實施共培養。
或者，在多個溫度下實施共培養。例如，在約27℃下實施共培養1天以及在約22℃下實施共培養約2天(Klianna and Daggard，Plant Cell Reports.21429-436，2003)。
細菌例如土壤桿菌介導成功轉化所需的vir基因最佳地在細菌生長在酸性條件下時表達(Morbe et al，同上)。因此，優選地在酸性條件下實施共培養。例如，在低于約pH6.5，更優選地不到約6.0，更優選地不到約5.0的pH值條件下實施共培養。
在一個實例中，在酚誘導劑(例如乙酰丁香酮)和/或表面活性劑中實施共培養。合適的表面活性劑和/或乙酰丁香酮或表面活性劑的濃度如上所述，并經必要的調整應用于本發明的本實施方式中。
在一個實例中，在酚誘導劑和甜菜堿中實施共培養。已經顯示在乙酰丁香酮中加入甜菜堿增強了土壤桿菌vir基因的誘導作用(Vernade et al，J.Bacterial.，1705822-5829，1988)。
顯示能夠增加vir基因表達和/或增加轉化效率的其他因素包括例如糖(例如蔗糖)(Andenbauer et al，Journal of Bacteriology 1726442-6446，1990)。因此，在本發明的一個實例中，在蔗糖中實施共培養，例如為從約0.1％到約4％的蔗糖，更優選地從約0.2％到約2％的蔗糖。本發明人已經清楚地證實當在存在蛋白胨的情況下實施共培養時顯著地增加了轉化效率。在這個方面，合適的蛋白胨如上所述，并被經必要的調整應用于本發明的這個實施方式。
在一個實例中，在足以選擇出包括核酸構建體的細菌的條件下實施接種和/或共培養。例如，如上所述，優選地核酸構建體包括在細菌中有活性的選擇標記物。或者，一些細菌菌株包括選擇標記物，以及利用細菌對其耐藥的抗生素(不會抑制或阻止胚細胞的生長和/或存活)實施接種和/或共培養。
Roberts等(Proc.Natl.Acad.Set USA，1006634-6639，2003)證實了在細菌介導轉化之前抑制嘌呤合成能增加轉化效率。因此，在一個實例中，在接種和/或共培養之前，用抑制嘌呤合成的化合物接觸胚性禾本科植物細胞。在這個方面，優選地在接種之前不洗去胚性禾本科植物細胞的嘌呤合成抑制劑。合適的嘌呤合成抑制劑對于本領域人員是顯而易見的，并包括例如偶氮絲氨酸或阿西維辛或咪唑立賓。
在另一個實例中，在用細菌接種和/或共培養之前，弄傷胚性禾本科植物細胞。Bidney等(Plant Mol.Biol.，18301-313，1992)顯示，與未受傷的細胞相比較，利用微粒轟擊造成的創傷會顯著地增加轉化效率。用于弄傷胚性禾本科植物細胞的合適方法對于本領域人員是顯而易見的。
在共培養之后，優選地去除仍與胚性禾本科植物細胞結合的任何細菌。例如通過洗滌胚細胞可以實現這一點。優選地，用包括例如對細菌例如土壤桿菌有毒的但對植物細胞無毒的抗生素的溶液洗滌胚細胞。例如，用頭孢噻肟或羧芐西林洗滌胚細胞(Matthias and Boyd，Plant Sci 46217-233，1986)。
4、轉基因植物或其部分的再生 4.1 愈傷組織誘導 在一個實例中，利用用在此所述的方法產生的轉化胚性禾本科植物細胞再生出植物或植物部分或小植物。
優選地，在足以誘導愈傷組織形成的條件下，用誘導愈傷組織形成的化合物接觸轉化禾本科胚植物細胞一段時間。
再者或另外，在足以誘導細胞去分化的條件下，用誘導細胞去分化的化合物接觸轉基因禾本科胚植物細胞一段時間。再者或另外，在足以生長未分化細胞的條件下，用誘導未分化細胞生長的化合物接觸轉基因禾本科胚植物細胞一段時間。
誘導愈傷組織形成和/或誘導未分化和/或去分化細胞產生的化合物對于本領域人員是顯而易見的，并包括例如植物生長素例如2，4-D、3，6-二氯-o-茴香酸(3，6-dichloro-o-anisic acid)(麥草畏(Dicambia))、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸(4-amino-3，5，6-thrichloropicolinic acid)(毒莠定(Picloram))或塞苯隆(TDZ)。
在這個方面，優選地將轉化胚細胞維持在愈傷組織誘導或加速培養基中。
這種培養基還可以包括一種或多種有助于愈傷組織產生/去分化或未分化細胞生長的化合物。例如，Mendoza和Kaeppler(In vitro Cell Dev.Biol.，3839-45，2002)發現包括麥芽糖的培養基比包括蔗糖的培養基更能增強2，4-D中的愈傷組織產生。
再者或另外，還用肌醇基礎胚細胞。研究已經顯示肌醇能用于維持愈傷組織中的細胞分裂(Biffen and Hanke，Biochem.J.265809-814，1990)。
同樣，酪蛋白水解物顯示能夠誘導愈傷組織的細胞分裂以及維持愈傷組織形態產生性應答。因此，在另一個實例中，還用酪蛋白水解物接觸胚性禾本科植物細胞。
用于從成熟胚性禾本科植物細胞誘導愈傷組織形成和/或細胞去分化和/或未分化細胞生長的合適培養基和方法都是本領域已知的和/或在Mendozaand Kaeppler，In vitro Cell Dev.Biol，，3839-45，2002；Ozgen et al，Plant CellReports，18331-335，1998；Patnaik and Khurana BMC Plant Biology，31-11；Zale et al，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76277-281，2004和Delporte etal，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，80139-149，2005中有所描述的。
4.2 形成苗和/或根 在愈傷組織誘導、細胞去分化和/或未分化細胞生長之后，在足以產生苗的條件下，用誘導苗形成的化合物接觸胚性禾本科植物細胞和/或其所衍生的細胞(例如其所衍生的愈傷組織和/或去分化細胞或未分化細胞)一段時間。用于誘導苗形成的合適的化合物和方法都是本領域已知的，并在Mendoza and Kaeppler，In vitro Cell Dev.Biol，3839-45，2002；Ozgen et al，Plant Cell Reports，18331-335，1998；Patnaik and Khurana BMC Plant Biology，31-11；Zale et al，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76277-281，2004；Murashige and Skoog，Plant Physiol，15473-479，1962或Kasha et al，(InGenemanipulation in plant improvement II，Gustafson ed.，Plenum Press，1990)中有所描述。
例如，用一種或多種誘導苗形成的植物生長調節劑接觸愈傷組織、未分化細胞或去分化細胞。合適的化合物(即植物生長調節劑)的實例包括吲哚-3-乙酸(IAA)、芐腺嘌呤(BA)、吲哚-丁酸(IBA)、玉米素、α-萘乙酸(NAA)、6-芐氨基嘌呤(BAP)、塞苯隆、激動素、2iP或其組合。
包括用于誘導苗形成的化合物的培養基的合適來源是本領域已知的，并包括例如Sigma。
再者或另外，在足以誘導苗形成并產生小植物的條件下，將愈傷組織或未分化細胞或去分化細胞維持在不包括植物調節劑的培養基中一段時間。
在苗形成的同時或者在苗形成之后，在足以啟動生根并產生小植物的條件下，優選地用誘導生根的化合物接觸愈傷組織或未分化細胞或去分化細胞一段時間。
合適的誘導生根的化合物是本領域人員已知的，并包括植物生長調節劑例如上面所述的。
用于誘導生根的合適方法是本領域已知的和/或在Mendoza andKaeppler，In vitro Cell Dev.Biol，3839-45，2002；Ozgen et al，Plant CellReports，18331-335，1998；Patnaik and Khurana BMC Plant Biology，31-11；Zale et al，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76277-281，2004；Murashigeand Skoog，Plant Physiol，15473-479，1962或Kasha et al，(InGenemanipulation in plant improvement II，Gustafson ed.，Plenum Press，1990)中所述的方法。
在本發明的一個實例中，在足以誘導苗形成的條件下用包括玉米素的培養基接觸愈傷組織或未分化細胞或去分化細胞一段時間，以及在足以誘導生根的條件下，用包括NAA的培養基接觸愈傷組織或未分化細胞或去分化細胞一段時間。然后在被盆栽(例如盆栽混合物和/或沙土中)和生長之前，將小植物生長一段足以生根的時間。
4.3 選擇 在植物再生期間，優選地對轉化胚細胞施加選擇，據此減少細菌例如土壤桿菌的生長以及阻止不包括核酸構建體的植物細胞的生長。為了有助于這種選擇，優選地是核酸構建體包括編碼合適選擇標記物的核酸。合適的選擇標記物是本領域已知的和/或在此所述的。
例如，當選擇標記物表達時，其賦予了對抗生素或殺蟲劑的抗性。在愈傷組織誘導和/或植物再生期間，用所述抗生素或殺蟲劑接觸轉化胚性禾本科植物細胞。結果，只有表達所述選擇標記物的那些細胞才能在選擇標記物中存活和/或生長，由此產生轉基因植物(例如克隆轉化體)。
在一個實例中，選擇標記物有助于植物或植物細胞在對未轉化細胞或植物有毒的化合物中生長。優選地，選擇標記物基因編碼有助于植物在D-氨基酸氧化酶中生長的蛋白。例如，選擇標記物基因編碼D-氨基酸氧化酶(DAAO)，例如再次所述的DAAO。其他合適的選擇標記物基因對于本領域人員是顯而易見的和/或在此所述的和/或在發表國際申請WO2003/060133中所述的。例如，選擇標記物基因表達選自由D-絲氨酸氨裂解酶、D-谷氨酸氧化酶、D-天冬氨酸氧化酶、D-谷氨酸消旋酶和D-丙氨酸轉氨酶組成的組中的蛋白。表達這種選擇標記物基因的植物或植物細胞能夠代謝D-氨基酸例如D-丙氨酸或D-絲氨酸。相反地，不表達選擇標記物基因的植物或植物細胞不能在這種D-氨基酸中生長。事實上，一定濃度的D-氨基酸對于不表達合適選擇標記物基因的植物或植物細胞是有毒的。為了選出轉基因細胞和/或植物，在阻止未轉化細胞生長或者誘導所述細胞死亡的條件下，用D-氨基酸例如D-丙氨酸和/或D-絲氨酸接觸轉化胚性禾本科植物細胞一段時間。例如，將細胞或愈傷組織或植物維持在至少約2Mm D-氨基酸或者至少約3mM D-氨基酸或者至少約4mM D-氨基酸或者至少約5mM D-氨基酸中一段時間。例如在愈傷組織誘導和/或植物再生期間，施加這種選擇。
在另一個實例中，通過檢測所述構建體表達的檢測標記物來鑒定出包括核酸構建體的細胞或愈傷組織。合適的檢測標記物是在此所述的。例如，檢測和分離(例如通過切割)出表達dsRED標記物的愈傷組織，并將其用于再生轉基因植物。在一個實例中，在愈傷組織誘導和/或植物再生的時候實施轉化細胞的選擇。
在另一個實例中，在開始植物再生之后開始轉化細胞的選擇。例如，在開始愈傷組織誘導之后約2周或3周或4周或5周才開始選擇。
在一個實例中，分離出用本發明的方法已經轉化的或者可能已經轉化的細胞。在這個方面，本發明方法通常造成核酸被整合到胚的上胚層和/或盾片內。因此，在一個實例中，本發明方法包括在愈傷組織誘導之前、愈傷組織誘導期間和/或植物再生期間分離出上胚層和/或盾片細胞。然后用這種細胞再生出轉基因植物。
通過檢測所述構建體表達的檢測標記物(例如dsRED)可以鑒定出包括核酸構建體的上胚層細胞或盾片細胞，分離出所述細胞，并用其再生出植物。
4.4 植物育種 用任一方式例如克隆繁殖或經典育種技術都可以繁殖出再生的轉化植物。例如，第一代(或T1)轉化植物進行自我受精，產生純合子第二代(或T2)轉化體，然后通過經典育種技術繁殖T2植物。或者，用經典育種技術育種第一代，產生雜合子植物，然后用其雜交產生純合子植物。
在此提及的再生的轉化植物可以是多種形式。例如，它們可以是轉化細胞和未轉化細胞的嵌合體或者克隆轉化體(例如所有細胞都被轉化成包含轉移核酸或轉基因)。
在一個實例中，再生的轉化植物或其子代生長成熟，從成熟植物中獲得種子或繁殖材料(例如生殖組織)。
本發明顯然涉及利用本發明的方法產生的植物的子代和/或本發明的方法產生的植物的種子或種質或繁殖材料。根據在此的描述，用于生產這種子代、種子、種質或繁殖材料的方法對于本領域人員是顯而易見的。
5、用于產生轉基因禾本科細胞或再生植物的方法的實例 在一個實例中，本發明提供了用于再生轉基因禾本科細胞的方法，所述方法包括 (i)從干燥的禾本科籽粒例如小麥籽粒或大麥籽粒或稻籽粒或玉米籽粒獲得胚細胞； (ii)從胚細胞去除種皮和/或糊粉； (iii)用包括核酸構建體的土壤桿菌在足以使得所述土壤桿菌結合或附著于所述胚細胞的條件下接觸胚細胞一段時間，所述核酸構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，其中在存在蛋白胨的情況下實施所述接觸，以及其中在無需首先從所述胚細胞誘導愈傷組織形成的情況下實施所述接觸；和 (iv)在足以使得所述土壤桿菌將轉移核酸引入到其中一個或多個細胞的條件下維持胚細胞和結合的土壤桿菌一段時間，其中在存在蛋白胨的情況下實施所述維持，由此產生轉基因禾本科細胞。
例如，方法包括 (i)從干禾本科籽粒例如小麥籽粒或大麥籽粒或稻籽粒或玉米籽粒切下胚細胞； (ii)例如通過切割從胚細胞去除種皮和/或糊粉； (iii)在乙酰丁香酮、大豆蛋白胨和2，4-二氯苯氧乙酸中，用包括核酸構建體的根瘤土壤桿菌接觸胚細胞至少約3個小時，所述核酸構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，其中在無需首先從所述胚細胞誘導愈傷組織形成的情況下實施所述接觸；和 (iv)將胚細胞和結合的土壤桿菌維持在乙酰丁香酮和2，4-二氯苯氧乙酸中至少約3天，據此容許土壤桿菌將轉移核酸引入到其中一個或多個胚細胞中，由此產生轉基因禾本科細胞。
在每個先前的實施方式中，優選地在約0.01％到約0.04％(w/v)蛋白胨例如約0.02％蛋白胨中實施土壤桿菌接觸胚細胞的步驟。
也優選地在從約1mg/L 2，4-D到約4mg/L 2，4-D例如約2mg/L 2，4-D中實施土壤桿菌接觸胚細胞以及維持胚細胞和結合的土壤桿菌的步驟。
也優選地在從約100μM乙酰丁香酮到約400μM乙酰丁香酮例如約200μM乙酰丁香酮中實施土壤桿菌接觸胚細胞以及維持胚細胞和結合的土壤桿菌的步驟。
本發明也提供了用于從植物細胞再生植物的方法。例如，這種方法包括 (a)在足以產生愈傷組織的條件下用誘導愈傷組織形成的化合物接觸植物細胞一段時間； (b)在足以產生苗的條件下，用誘導苗形成的化合物接觸愈傷組織一段時間； (c)在足以啟動生根的條件下，用誘導生根的化合物接觸愈傷組織一段時間，由此產生小植物；和 (d)在足以產生植物的條件下，生長小植物一段時間。
例如，方法包括 (i)用包括2，4-D或麥草畏或TDZ或毒莠定的溶液接觸轉基因細胞，以便產生愈傷組織； (ii)用包括玉米素和/或TDZ的溶液接觸(i)中產生的愈傷組織，以便產生苗； (iii)用包括α萘乙酸的溶液接觸(ii)中產生的苗，以便開始生根，由此產生小植物。
例如，用包括從約1mg/L 2，4-D到約4mg/L 2，4-D例如約2mg/L 2，4-D的溶液接觸轉基因細胞。或者，用包括從約2mg/L麥草畏到約8mg/L麥草畏例如約4mg/L麥草畏的溶液接觸轉基因細胞。或者，用包括從約1mg/LTDZ到約6mg/L TDZ以及約1mg/L毒莠定到約4mg/L毒莠定，例如約3mg/LTDZ和約2mg/L毒莠定的溶液接觸轉基因細胞。
在另一個實例中，用包括從約1mg/L玉米素到約4mg/L玉米素例如約2mg/L玉米素的溶液接觸愈傷組織。或者，用包括從約0.25mg/L TDZ到約2mg/L TDZ例如約1mg/L TDZ的溶液接觸愈傷組織。
在進一步的實施例中，用包括從約0.25mg/L NAA到約2mg/L NAA例如約1mg/L NAA的溶液接觸苗。
根據在此所述的描述，其他合適的化合物對于本領域人員是顯而易見的，并應當經必要的調整將其應用于本發明的實施方式中。
對于本領域人員顯而易見的是，任何先前段落中所討論的用于再生植物的方法也能用于從在此所述的任一實施方式中的方法產生的轉基因細胞再生出轉基因植物。
6、植物表型的調控 通過先前的描述對于本領域人員顯而易見的是，本發明提供了用于在禾本科植物中表達轉基因或者調控基因表達的方法，例如，這種方法包括 (i)利用在此所述的任一實施方式中的方法產生轉基因禾本科植物細胞，其中所述轉基因細胞包括與在禾本科植物細胞中可操縱的啟動子可操縱的連接的轉基因； (ii)從所述細胞再生出轉基因植物； (ii)在足以使所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因植物一段時間。
在另一個實例中，本發明提供了用于修飾禾本科植物中的核酸表達的方法，所述方法包括 (i)利用在此所述的任一實施方式中的方法產生轉基因禾本科植物細胞，其中所述轉基因細胞包括能夠調控核酸表達的轉基因； (ii)從所述細胞再生出轉基因植物； (ii)在足以調控所述轉基因的表達的條件下維持所述轉基因植物一段時間。
這種方法顯然能夠用于調控植物或植物細胞的表型，例如通過表達賦予所需表型的基因或抑制賦予不良表型的基因的表達。
6.1 轉基因在植物中的表達 在一個實例中，本發明提供了調控植物或其種子或其繁殖材料的表型的方法，所述方法包括利用在此所述的任一實施方式中的方法表達調控植物種子或繁殖材料的所述表型的轉基因。或者，方法包括增強或誘導或賦予植物的表征。
例如，本發明提供了用于產生具有改良營養品質的禾本科植物的方法，所述方法包括 (i)通過實施在此所述的任一實施方式中的方法，用包括編碼與改良營養品質相關的蛋白的轉基因的核酸構建體轉化禾本科植物細胞； (ii)從所述細胞再生出轉基因植物；和 (ii)在足以使所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因植物一段時間，由此產生具有改良營養品質的植物。
或者，本發明提供了用于生產表達藥用蛋白或營養食品用蛋白的禾本科植物的方法。所述方法包括 (i)通過實施在此所述的任一實施方式中的方法，用包括編碼藥用蛋白或營養食品用蛋白的轉基因的核酸構建體轉化禾本科植物細胞； (ii)從所述細胞再生出轉基因植物；和 (ii)在足以使所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因植物一段時間，由此產生表達藥用蛋白或營養食品用蛋白的植物。
優選地，本發明的方法還包括產生或提供包括轉基因的表達構建體和/或產生和/或提供包括所述表達構建體的細菌例如土壤桿菌。在這個方面，根據在此的描述，本領域人員知道用于產生包括這種核酸構建體的這種表達構建體和/或細菌的合適方法。
本發明顯然也包括具有改良營養或藥物質量的禾本科植物或其子代或其種子或起種質。例如，用在此所述的任一實施方式中的方法產生禾本科植物、子代、種子或種質。
例如，本發明能夠用于生產表達藥用、免疫用或營養用蛋白或者生產藥用、免疫用或營養用的二級產物所需的酶、或能夠修飾二級代謝途徑中的底物利用的蛋白的轉基因植物。這些蛋白對于本領域人員是已知的，并包括例如一組結構和功能都不同的抗原蛋白(例如源自感染人或以籽粒產品為食的動物的病原體的抗原蛋白)、富硫蛋白(例如巴西堅果蛋白、向日葵子白蛋白、2S蛋白、Aspl合成蛋白)、鈣結合蛋白(例如鈣調蛋白、鈣網織蛋白、或隱鈣素)、鐵結合蛋白(例如血紅蛋白)和產生滲透保護劑所需的生物合成酶，例如甜菜堿(例如膽堿氧化酶、甜菜堿醛脫氫酶)、脂肪酸(例如Δ-12去飽和酶)、植物甾醇(例如S-腺苷-L-甲硫氨酸-Δ24-甾醇甲基轉移酶(SMTI或SMTII)、C-4去甲基化酶、環桉烯醇到鈍葉醇異構酶、14α-甲基去甲基化酶、Δ8至Δ7異構酶、Δ7-甾醇-C-5去飽和酶、24，25-還原酶)、花青苷或其他色素(原花青素(proanthocyaninidin)還原酶)、木質素(例如桂皮烯醇脫氫酶、咖啡酸O-甲基轉移酶、或苯丙氨酸氨裂解酶)、抗營養蛋白、能夠改變苯基丙酸類(phenylpropanoid)途徑中的底物的酶(例如膽堿氧化酶、甜菜堿醛脫氫酶、阿魏酸脫羧酶)、能夠作用于膽堿以修飾苯基丙酸類途徑中其他酶對膽堿的利用的膽堿代謝酶(例如膽堿氧化酶、甜菜堿醛脫氫酶、阿魏酸脫羧酶)、涉及麥苗處理過程的酶(例如高pI-α淀粉酶、低pI-α淀粉酶、EII-(1-3，1-4)-β葡聚糖酶、組織蛋白酶β樣蛋白酶、α-葡糖苷酶、木聚糖酶或阿拉伯呋喃糖酶)、能夠作用于糖醇的酶、或者能夠作用于肌醇的酶等。在科學文獻中可公開獲得或描述了編碼這些蛋白的核酸。在美國國立醫學圖書館的國立生物技術信息中心的數據庫(8600 Rockville Pike，Bethesda，MD20894，USA)中充分描述了這些核酸及其編碼的蛋白的結構(例如序列)。對于本領域人員顯而易見的是，這種核酸是用于本發明方法中的合適轉基因。
在一個示例的實施方式中，本發明的方法被用于產生表達在天然HMW-GS調節序列控制下的雜合體高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)的轉基因植物，例如Blechl and Anderson Nature Biotechnology，14875-879，1996所述。
再者或另外，用在此所述的任一實施方式中的方法將編碼HMW-GS1Ax1基因(SEQ ID NO40)的轉基因引入到小麥細胞內，然后用其產生轉基因小麥植物。優選地，在核酸構建體中，HMW-GS Ax1基因被可操縱的放置于其內源性啟動子的控制之下。通過增加小麥籽粒中的HMW-GS水平，可以增強用小麥制成的面團的彈性，據此增強小麥面粉的面包制作性能。
禾本科植物的籽粒也被廣泛地用作非反芻動物的動物飼料。黑曲霉的植酸酶(SEQ ID NO42)被用作提高可消化性以及提高磷和礦物質的生物利用度的飼料添加劑。在一個實例中，本發明的方法被用于產生組成地或者在籽粒或種子的胚乳中表達黑曲霉的phyA基因的轉基因禾本科植物。
在另一個實例中，本發明的方法被用于產生表達治療性蛋白例如疫苗或抗體片段的禾本科植物。改良植物抗體載體(例如Hendy et al.J.Immunol.Methods 231137-146，1999所述)和純化策略使得這種方法成為生產重組免疫球蛋白的實際的和有效的工具，所述免疫球蛋白不僅用于人類和動物的治療，還用于工業應用(例如催化抗體)。此外，植物產的抗體已經顯示出是安全和有效的，并且避免了動物源性材料的使用，因此避免了傳染性海綿狀腦病(TSE)病原體的污染危險。此外，植物和哺乳動物產的抗體之間的糖基化模式的差異對抗原結合或特異性都只有很小的或者沒有影響。另外，在接受局部口服施用的植物源性分泌性二聚體IgA抗體的患者中沒有觀察到毒性或HAMA的證據(見see Larrick et al.Res.Immunol.149603-608，1998)。
各種方法都可以被用于在轉基因植物中表達抗體。例如，可以將抗體重鏈和輕鏈單獨地克隆到核酸構建體內，隨后用本發明的方法體外轉化植物細胞。之后，再生出表達單個鏈的整個植物，再通過它們的有性雜交最終造成完全裝配的和有功能的抗體的產生(見例如Hiatt et al.Nature 34216-87，1989)。在各種實施例中，可以利用信號序列通過它們指導鏈進入合適的植物環境內來促進未裝配鏈的表達、結合和折疊。
在這個方面，將編碼抗體片段例如相關抗體的重鏈和輕鏈的核酸都克隆到在此所述的表達構建體內。然后將此構建體引入到細菌內，然后用所述細菌產生表達抗體片段的轉基因植物。利用標準方法可以從植物例如種子中分離出這種片段。
在另一個實例中，在植物內表達能夠引發宿主體內的免疫應答的肽或多肽，例如，將編碼乙型肝炎病毒表面抗原(SEQ ID NO44)的轉基因插入到在此所述的核酸構建體內，并用在此所述的任一實施方式中的方法利用所述構建體產生轉基因禾本科植物。在這個實施方式中，然后將利用禾本科植物或其部分(例如小麥麥麩)產生的食品作為醫療食物或口服疫苗施用給人(例如給人喂養)。
在另一個實例中，本發明的方法被用于產生雄性不育植物，據此有助于雜合體植物的產生。在這個方面，雄性不育植物不能自我受精，據此有助于產生植物系。例如，產生包括在合適啟動子(例如絨氈層(tapetum)特異性啟動子)控制下的Barnase轉基因(SEQ ID NO46)的核酸構建體。然后將該構建體引入到細菌內，用在此所述的任一實施方式中的方法產生轉基因禾本科植物。該基因的表達阻止了花藥發育特殊階段的花粉發育，由此產生了雄性不育植物。
在進一步的實施例中，本發明的方法被用于產生具有抗生物應激(例如真菌病原體)的抗性的轉基因植物。因此，在另一個實例中，本發明提供了產生具有抗生物應激的抗性的轉基因禾本科植物，所述方法包括 (i)用在此所述的任一實施方式中的方法產生包括編碼賦予或增強對生物應激的抗性的蛋白的轉基因的轉基因禾本科植物細胞； (ii)從所述細胞再生出轉基因植物；和 (ii)在足以使所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因植物一段時間，由此產生具有抗生物應激抗性的轉基因禾本科植物。
在一個實例中，上面所述的方法經必要的調整應用于提高或增強植物對生物應激的抗性的方法。
在另一個實例中，生物應激是植物病原體例如真菌、病毒、細菌或為禾本科植物或禾本科植物的一部分(例如禾本科植物的種子或籽粒)為食的昆蟲。賦予對這種植物病原體的抗性的蛋白是本領域人員已知的，并包括例如一組結構和功能都不同的植物防御蛋白或致病相關蛋白(例如殼多糖酶特別是酸性殼多糖酶或內切殼多糖酶；β葡聚糖酶特別是β-1，3-葡聚糖酶；核糖體失活蛋白(RJP)、γ高梁醇溶蛋白；wheatwin或WPR4)、硫素特別是γ硫素；奇甜蛋白或奇甜蛋白樣蛋白例如玉米素；蛋白酶抑制劑例如胰蛋白酶或糜蛋白酶；或Sormatin)、病毒外殼蛋白或將一種或多種病原體毒素轉化成無毒產物的蛋白。在科學文獻中可公開獲得或描述了編碼這些蛋白的核酸。在美國國立醫學圖書館的國立生物技術信息中心的數據庫(8600 Rockville Pike，Bethesda，MD 20894，USA)中充分描述了這些核酸及其編碼的蛋白的結構(例如序列)。對于本領域人員顯而易見的是，這種核酸是用于本發明方法中的合適轉基因。
例如，產生編碼小麥線條花葉病毒的外殼蛋白(SEQ ID NO48)的核酸構建體，然后用其產生轉基因小麥植物。優選地，在小麥的種子中表達基因，但是，組成型表達也是被打算的。這種表達賦予了抗小麥線條花葉病毒的抗性。
在另一個實例中，在利用在此所述的任一實施方式中的方法產生小麥植物的過程中使用了賦予或增強了小麥對河谷鐮刀菌(赤霉病)的抗性的蛋白。在這個實施方式中，賦予或增強抗河谷鐮刀菌的保護性的蛋白選自由(i)賦予小麥抗真菌病原體河谷鐮刀菌保護性的小麥奇甜蛋白樣蛋白(即SEQID NO50)；(ii)抗河谷鐮刀菌產生的單端孢霉烯的小麥的修飾核糖體蛋白L3(即wRPL3Cys 258；SEQ ID NO52)和(iii)具有單端孢霉烯O-乙酰轉移酶活性并且能夠將河谷鐮刀菌產生的單端孢霉烯轉化成無毒產物的多肽(即SEQ ID NO54)組成的組。
或者，可以用大麥的殼多糖酶基因產生具有抗小麥白粉病菌(Erisiphegraminis)抗性的轉基因小麥植物。
或者，可以用來自玉米黑粉菌(Ustilago maydis)的殺手蛋白產生具有抗小麥腥黑穗菌(Tilletia tritici)抗性的轉基因小麥。
或者，可以用大麥胰蛋白酶抑制劑CMe產生具有抗為種子為食的昆蟲幼蟲抗性的轉基因小麥植物。
仍在進一步的實施例中，本發明提供了用于產生具有抗非生物應激抗性的轉基因禾本科植物的方法，所述方法包括 (i)用在此所述的任一實施方式中的方法產生包括編碼賦予或增強對非生物應激的抗性的蛋白胨轉基因的轉基因禾本科植物細胞； (ii)從所述細胞再生出轉基因植物；和 (iii)在足以誘導所述核酸表達的條件下維持所述轉基因植物一段時間，由此產生具有抗非生物應激抗性的轉基因禾本科植物。
優選地，上面所述的方法經必要的調整應用于提高或增強植物對非生物應激抗性的方法中。
在進一步的實施例中，非生物應激是干旱或干燥。表達晚期胚產生蛋白的轉基因可用于產生具有干旱或干燥抗性或耐受性的轉基因禾本科植物，所述晚期胚產生蛋白在種子干燥時發生蓄積以及當植物感受到缺水時蓄積在營養組織內。例如，用編碼大麥HVA1的核酸(SEQ ID NO56)產生在此所述的表達構建體。然后利用在此所述的任一實施方式中的方法，用這個表達構建體產生轉基因植物。
在另一個實例中，用編碼擬南芥DREB1A(SEQ ID NO58)產生轉基因禾本科植物，所述轉基因禾本科植物除了具有對低溫和/或鹽度的耐受性外還具有提高了的抗旱性。
6.2 調控禾本科植物中的表達 要明白本發明也可以擴展到產生表達不會編碼蛋白的轉基因的轉基因植物。例如，轉基因編碼干擾RNA、核酶和抗體酶、共抑制分子、基因沉默分子或基因靶向分子，其阻止或減少了相關核酸的表達。
用于產生干擾RNA或核酶或抗體酶的合適方法是本領域已知的。
例如，已經鑒定出了多種類型的核酶。一組核酶是源自多種能夠在植物中自我解離和復制的小環狀RNA。示例包括來自鱷梨日斑病類病毒素的RNA和來自煙草環斑病毒、紫花苜蓿短暫條紋病毒、絨毛煙草斑駁病毒、茄屬植物斑駁病毒和地下三葉草斑駁病毒的衛星RNA。在例如Haseloff et al.Nature，534585-591(1988)中描述了編碼能夠選擇性解離靶向RNA的轉基因的設計和用途。
或者，轉基因表達能夠誘導對靶向核酸的有義抑制的核酸。例如，產生包括被設置成有義方向上的作為靶向核酸的啟動子的核酸的轉基因。例如在Napoli et al，The Plant Cell 2279-2891990；或美國專利5,034,323中描述了這種方法。
為了通過有義抑制減少或阻止核酸的表達，轉基因不必與核酸絕對相同。此外，對于通過有義抑制減少或阻止所述核酸的表達而言，轉基因不必包括核酸的完整序列。
RNA干擾也可以用于減少或阻止核酸的表達。在Marx，Science，2551370-1372，2000中描述了RNAi的合適方法。在WO 99/49029、WO99/53050和WO0/75164中描述了用于減少或阻止核酸表達的示例方法。簡單的，產生表達與靶向核酸的核苷酸序列互補的核酸的轉基因。轉基因還表達與靶向核酸的所述核苷酸序列基本上相同的核酸。轉基因所表達的兩個核酸能夠雜交并減少或阻止靶向核酸的表達，推測是在轉錄后水平。
例如，可能需要表達例如減少或阻止感染禾本科植物所需的真菌核酸的表達的抑制性RNA。例如，多種昆蟲和真菌病原體完成生命周期都需要S-腺苷-L-甲硫氨酸-Δ24-甾醇甲基轉移酶(SMTI或SMTII)，表達抗該酶的抑制性RNA可以阻止病原體成熟為成體，據此阻止病原體在禾本科植物中的播散。
或者，在小麥中表達編碼減少或阻止小麥線條花葉病毒(WSMV)的運動蛋白的抑制性RNA分子，以便抑制病毒從果皮運動到植物的脈管系統。
在另一個實例中，轉基因編碼抑制性RNA、核酶、抗體酶、共抑制分子、基因沉默分子或基因靶向分子，據此增強或改變禾本科植物的營養特征。例如，小麥籽粒主要是由淀粉組成的，所述淀粉是兩種聚合物的混合物殆線性直鏈淀粉和高度分支的支鏈淀粉。通過改變支鏈淀粉與直鏈淀粉的比例，可以改變小麥的物理化學性能和/或終用途。為了改變支鏈淀粉與直鏈淀粉的比例，在轉基因小麥植物中表達減少或阻止顆粒結合性淀粉合酶I基因(編碼GBSSI或WAXY蛋白)表達的抑制性RNA，據此改變所述植物中的直鏈淀粉水平。來自表達這種轉基因并具有相對于支鏈淀粉的低水平直鏈淀粉的植物的面粉是制作面條所需要的，因為它提高了面條的質感。因此，通過減少顆粒結合性淀粉核酶I基因的表達，提高了小麥的面條制作的質量。
本發明顯然可以擴展到具有在此所述的改變了的表型或改變了的基因表達的植物、子代、種子、繁殖材料。優選地，用本發明的方法產生這種植物、子代、種子、繁殖材料。
8、其他方法 本發明也提供了用于從植物細胞再生出植物或小植物或植物部分得方法。例如，這種方法包括 (a)在足以產生愈傷組織的條件下，用誘導愈傷組織形成的化合物接觸植物細胞； (b)在足以產生苗的條件下，用誘導苗形成的化合物接觸愈傷組織一段時間； (c)在足以啟動生根的條件下，用誘導生根的化合物接觸愈傷組織一段時間，由此產生小植物；和 (d)在足以產生植物或小植物或植物部分的條件下，生長小植物一段時間。
例如，方法包括 (i)用包括2，4-D或麥草畏或TDZ或毒莠定的溶液接觸轉基因細胞，以便產生愈傷組織；和 (ii)用包括玉米素或TDZ的溶液接觸(i)中產生的愈傷組織，以便產生苗； (iii)用包括α萘乙酸的溶液接觸(ii)中產生的苗，使得開始生根，由此產生小植物。
例如，用包括從約1mg/L 2，4-D到約4mg/L 2，4-D例如約2mg/L 2，4-D的溶液接觸轉基因細胞。或者，用包括從約2mg/L麥草畏到約8mg/L麥草畏例如約4mg/L麥草畏的溶液接觸轉基因細胞。或者，用包括從約1mg/LTDZ到約6mg/L TDZ以及約1mg/L毒莠定到約4mg/L毒莠定，例如約3mg/LTDZ和約2mg/L毒莠定的溶液接觸轉基因細胞。
在另一個實例中，用包括從約1mg/L玉米素到約4mg/L玉米素例如約2mg/L玉米素的溶液接觸愈傷組織。或者，用包括從約0.25mg/L TDZ到約2mg/L TDZ例如約1mg/L TDZ的溶液接觸愈傷組織。
在進一步的實施例中，用包括從約0.25mg/L NAA到約2mg/L NAA例如約1mg/L NAA的溶液接觸苗。
根據在此所述的描述，其他合適的化合物對于本領域人員是顯而易見的，并且應當經必要的調整應用于本發明的實施方式。
在一個實例中，再生植物或小植物或植物部分的方法是用于再生轉基因植物或小植物或植物部分的方法，其中轉基因植物或小植物或植物部分表達選擇標記物，以及方法還包括選出表達所述選擇標記物的轉基因植物或小植物或植物部分或轉基因植物細胞。
在此描述了合適的選擇方法，并經必要的調整應用于本發明的實施方式中。
本發明也提供了選擇表達選擇標記物基因的轉基因植物或小植物或植物部分或轉基因植物細胞，其中所述選擇標記物基因將有毒底物轉化成無毒底物和/或容許表達所述選擇標記物基因的植物或小植物或植物部分或植物細胞在有毒底物中生長，所述方法包括在足以殺死或阻止未表達選擇標記物基因的植物或小植物或植物部分或植物細胞生長的條件下，用所述有毒底物接觸所述轉基因植物或小植物或植物部分或植物細胞一段時間，據此選出轉基因植物或小植物或植物部分或轉基因植物細胞。
在此描述了合適的選擇標記物基因和選擇方法，并經必要的調整應用于本發明的實施方式中。
本發明也提供了檢測或鑒定出表達檢測標記物基因的轉基因植物或小植物或植物部分或轉基因植物細胞的方法，其中當在植物、小植物、植物部分或植物細胞中表達所述檢測標記物基因時，其會產生檢測信號，據此檢測或鑒定出轉基因植物或小植物或植物部分或轉基因植物細胞。
在一個實例中，方法還包括選擇表達檢測標記物基因的植物或小植物或植物部分或植物細胞。
在此描述了合適的檢測標記物基因和檢測或鑒定的方法，并經必要的調整應用于本發明的實施方式中。
還參照下面非限制性實施例進一步描述了本發明。
實施例1小麥胚細胞的轉化 將普通小麥(Bobwhite)的小麥籽粒在0.8％(v/v)NaOCl溶液中表面消毒30分鐘，并在無菌蒸餾水中漂洗至少4次。
從經表面消毒的籽粒中切下成熟胚，去除種皮，將其直接用于土壤桿菌介導的轉化。圖1總結了成熟小麥籽粒的土壤桿菌感染的過程。圖2顯示了從干小麥籽粒中分離出具有完整上胚層和盾片的胚的過程。
外植體被直接用于土壤桿菌介導的轉化。在50mL Falcon管中，用包括pCAMB1A1305.2載體(表達在CaMV35s啟動子的控制下的GUS報告子基因)或pLM301(pSB1_Ubi1::DsRed2-nos)的土壤桿菌菌株EHA105接種10到15ml加有100μg/mL利福平和卡那霉素的LB，在27℃到28℃下溫育24到48個小時。對于接種而言，用100μl土壤桿菌培養物接種25mL加有卡那霉素的新鮮LB，并溫育24個小時。在室溫下，將該完全濃度(fullstrength)的接種物在3000rpm離心10分鐘，所形成的沉淀重懸于液體接種培養基(MS[1/10])中，使得OD600＝0.25-0.8。該接種培養基是由1/10濃度的液體Murashige和Skoog(Murashige and Skoog，Physiol Plant，15473-497，1962)基本鹽(MS[1/10])以及2mg/L2，4-D、200μM乙酰丁香酮和0.02％(w/v)SoytoneTM組成。
輕微攪拌下，將土壤桿菌感染在室溫下標準化3個小時。隨后，在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量營養劑、1x微量營養劑和有機維生素、以及200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L2，4-D以及200μM乙酰丁香酮和0.8％-2.0％(w/v)Bacto瓊脂組成的培養基中21℃、暗處共培養3天，其中胚軸優選地朝下。
任選地用沒有乙酰丁香酮或SoytoneTM但加有250mg/L頭孢噻肟的液體MS[1/10]充分地洗滌外植體。或者，用加有250mg/L頭孢噻肟的無菌水洗滌外植體，直到不再看到土壤桿菌殘留的征象(即洗滌溶液在洗滌后仍是清亮的)。
利用組織化學GUS檢測法(Jefferson，Plant Mol.Biol.Rep.5387-4051987)或利用帶DsRED1光學濾器的Leica立體顯微鏡的觀察來確定出含150mg/L特美汀(Timentin)的誘導培養基上的3天后(或其他時間點)取樣的外植體上的一過性gusA或DsRed2的表達(見圖2)。
對于組織化學的gusA表達檢測而言，將外植體在含1mM X-Gluc、100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、0.5mM鐵氰化鉀、0.5mM亞鐵氰化鉀和0.1％(v/v)Triton X-100的緩沖液中、37℃下培育過夜。在顯微鏡下計數出藍色gusA表達灶，通過計數至少有一個gusA表達灶的外植體以及計數出每個胚的表達灶數目可以評價T-DNA轉運。為了檢測穩定的gusA表達愈傷組織，將來自再生小植物的苗和葉片段都在37℃下培育過夜，如果需要再在25℃下培育1到2天。如圖2所示，在接種3天后的轉化胚中可以檢測到gusA和DsRed2的表達。
實施例2用于誘導愈傷組織和再生轉基因植物的方法1 在對如實施例1所示產生的轉化胚進行共培養和任選的洗滌之后，將外植體放置在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量營養劑、1x微量營養劑和有機維生素組成的培養基上，還加有200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L2，4-D以及200μM乙酰丁香酮和0.8％-2.0％(w/v)Bacto瓊脂進行體胚誘導，以及還加有潮霉素B(5-15mg/L)或5-7.5mM D-絲氨酸或D-丙氨酸和控制土壤桿菌生長的抗生素(例如頭孢噻肟250mg/L或特美汀150mg/L)。在一些情況中，直到接種后5周才施加選擇。
將成熟胚外植體在暗處培育3周，之后它們在選擇培養基上產生愈傷組織。將在選擇培養基上顯示出愈傷組織產生的外植體在加有選擇劑和抗生素的新鮮培養基中進行規律的亞培養。
在至少3周的愈傷組織誘導之后，將胚產生愈傷組織轉移到由1xMurashige和Skoog(同上)大量營養劑、1x微量營養劑和有機維生素、200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L玉米素和0.8％-2.0％(w/v)Bacto瓊脂以及10mg/L潮霉素B和控制土壤桿菌生長的抗生素(例如頭孢噻肟250mg/L或特美汀150mg/L)組成的再生培養基中。
將外植體在亮處再培養最少1到2個周期的2到3周，將推測的轉基因小植物/愈傷組織轉移到新鮮的再生培養基中。
再過10天之后，將再生小植物轉移到加有用于啟動生根的1mg/L NAA的MS[1/2]中。將任何在生根培養基中存活超過3周以及具有健康生根的再生小植物栽培到由泥炭和沙土(1:1)組成的苗圃混合物中，并維持于22℃到24℃以及苗圃濕度箱系統的高濕度下。在2周之后，從濕度箱中取出植物，手工澆水以及給予液體AquasolTM直到成熟。圖3顯示了從成熟胚的愈傷組織誘導和再生的示意圖以及再生轉基因小麥的結果。
實施例3用于誘導愈傷組織和再生轉基因植物的方法2 在對如實施例1所示產生的轉化胚進行共培養和任選的洗滌之后，將外植體放置在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量營養劑、1x微量營養劑和有機維生素、1g/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)麥芽糖、1.95g/L MES、0.69g/L脯氨酸、20mg/L鹽酸硫胺素、4mg/L麥草畏(Dicamba)和0.8％(w/v)Bacto瓊脂以及潮霉素B(5-15mg/L)和/或優選地5-7.5mM D-絲氨酸或D-丙氨酸和控制土壤桿菌生長的抗生素(例如頭孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)組成的愈傷組織誘導培養基(CIM-D)中。在一些情況中，直到接種后5周才施加選擇。
將成熟胚外植體在暗處培育3周，之后它們在選擇培養基上產生愈傷組織。將在選擇培養基上顯示出愈傷組織產生的外植體在加有選擇劑和抗生素的新鮮CIM-D中進行規律的亞培養。
在至少3到4周的愈傷組織誘導之后，將胚產生愈傷組織轉移到由1xMurashige和Skoog(同上)大量營養劑、1x微量營養劑和有機維生素、1g/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、20mg/L鹽酸硫胺素、750mg/L谷氨酰胺、5μM CuSO4、1.95g/L MES、3％(w/v)麥芽糖、1mg/L TDZ和0.8％(w/v)Bacto瓊脂以及10mg/L潮霉素B和/或5-7.5mM D-絲氨酸或D-丙氨酸和控制土壤桿菌生長的抗生素(例如頭孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)組成的再生培養基(SGM)中。
將外植體在亮處再培養最少1到2個周期的2到3周，將推測的轉基因小植物/愈傷組織轉移到新鮮的再生培養基中。
再過10天之后，將再生小植物轉移到用于啟動生根的由MS[1/2]、1mg/LNAA和10mg/L潮霉素B和/或5-7.5mM D-絲氨酸或D-丙氨酸和抗生素(例如頭孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)組成的RM培養基中。將任何在生根培養基中存活超過3周以及具有健康生根的再生小植物栽培到由泥炭和沙土(1:1)組成的苗圃混合物中，并維持于22℃到24℃以及苗圃濕度箱系統的高濕度下。在2周之后，從濕度箱中取出植物，手工澆水以及給予液體AquasolTM直到成熟。圖3顯示了從成熟胚的愈傷組織誘導和再生的示意圖以及再生轉基因小麥的結果。
實施例4用于誘導愈傷組織和再生轉基因植物的方法3 在對如實施例1所示產生的轉化胚進行共培養和任選的洗滌之后，將外植體放置在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量營養劑、1x微量營養劑和有機維生素、1g/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)麥芽糖、1.95g/L MES、0.69g/L脯氨酸、20mg/L鹽酸硫胺素、3mg/L TDZ、2mg/L毒莠定和0.8％(w/v)Bacto瓊脂以及潮霉素B(5-15mg/L)和/或優選地5-7.5mM D-絲氨酸或D-丙氨酸和控制土壤桿菌生長的抗生素(例如頭孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)組成的愈傷組織誘導培養基(CIM-TP)中。在一些情況中，直到接種后5周才施加選擇。將成熟胚外植體在暗處培育3周，之后它們在選擇培養基上產生愈傷組織。將在選擇培養基上顯示出愈傷組織產生的外植體在加有選擇劑和抗生素的新鮮CIM-TP中進行規律的亞培養。
在至少3到4周的愈傷組織誘導之后，將胚產生愈傷組織轉移到由1xMurashige和Skoog(同上)大量營養劑、1x微量營養劑和有機維生素、1g/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、20mg/L鹽酸硫胺素、750mg/L谷氨酰胺、5μM CuSO4、1.95g/L MES、3％(w/v)麥芽糖、1mg/L TDZ和0.8％(w/v)Bacto瓊脂以及10mg/L潮霉素B和/或優選地5-7.5mM D-絲氨酸或D-丙氨酸和控制土壤桿菌生長的抗生素(例如頭孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)組成的再生培養基(SGM)中。
將外植體在亮處再培養最少1到2個周期的2到3周，將推測的轉基因小植物/愈傷組織轉移到新鮮的再生培養基中。
再過10天之后，將再生小植物轉移到用于啟動生根的由MS[1/2]、1mg/LNAA和10mg/L潮霉素B和/或優選地5-7.5mM D-絲氨酸或D-丙氨酸和抗生素(例如頭孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)組成的RM培養基中。將任何在生根培養基中存活超過3周以及具有健康生根的再生小植物栽培到由泥炭和沙土(1:1)組成的苗圃混合物中，并維持于22℃到24℃以及苗圃濕度箱系統的高濕度下。在2周之后，從濕度箱中取出植物，手工澆水以及給予液體AquasolTM直到成熟。圖3顯示了從成熟胚的愈傷組織誘導和再生的示意圖以及再生轉基因小麥的結果。
測試了一組濃度的D-氨基酸(D-絲氨酸和D-丙氨酸)對從源自品系Bobwhite的成熟干籽粒的胚再生出小麥以及苗形成情況的影響。如表4和5所示，當D-絲氨酸和D-丙氨酸水平分別超過7.5mM和5mM時，它們都減少了小麥植物的再生和萌芽。在小麥基因型Ventura中也觀察到了相似的結果(表6和7)。
表4D-絲氨酸和D-丙氨酸對從源自品系Bobwhite的成熟干籽粒的胚再生出小麥的影響。數據是3周后再生的外植體的比例(％)(n＝20)。

表5D-絲氨酸和D-丙氨酸對品系Bobwhite的成熟干籽粒萌芽的影響。數據是1周后萌芽的外植體的比例(％)(n＝20)。

表6D-絲氨酸和D-丙氨酸對從源自品系Ventura的成熟干籽粒的胚再生出小麥的影響。數據是3周后再生的外植體的比例(％)(n＝20)。

表7D-絲氨酸和D-丙氨酸對品系Ventura的成熟干籽粒萌芽的影響。數據是1周后再生的外植體的比例(％)(n＝20)。

實施例5用Q-PCR檢測轉基因小麥 對T0和T1植物的基因組DNA取樣進行分子分析。用

探針進行所有的Q-PCR，以檢測擴增。已經建立了對gusA和DsRed2基因和bar、dao1、dsdA和hph選擇標記物基因的Q-PCR

篩選。為了確保陽性的Q-PCR信號不是由于土壤桿菌的偶然存在所造成的，已經建立對來自T-DNA外面的virC基因的Q-PCR

篩選。
每個候選基因的標準實時PCR混合物都含有2x

主要混合物、300nM每種引物、250nM探針、10到20ng基因組DNA以及水，終體積為10μl。PCR的熱循環條件是1個循環的50℃ 2分鐘，1個循環的95℃ 5分鐘以及40個循環的95℃ 15秒、60℃1 分鐘。在Stratagene MX3000p實時PCR熱循環儀中進行Q-PCR和數據分析。
如圖4A-D所示，利用

檢測法在獨立的Ti轉基因小麥系中檢測到了轉基因的存在。
實施例6用Southern雜交檢測轉基因小麥 用Southern印跡法分析T1或T2植物的基因組DNA，以便檢測出轉基因的穩定整合以及引入的拷貝數目。根據Dellaporta et al Plant Mol Biol Rep.，419-21，1983的方法，從小麥葉中分離出總基因組DNA。用合適的限制性酶消化20到30微克基因組DNA，并將其溶解在0.8-1％瓊脂糖凝膠上，并將其印跡到尼龍膜上(Hybond N，Amersham，UK)。
為了檢測出含來自載體pCAMBIA1305.2的T-DNA的轉基因小麥，用經限制性酶EcoR1消化過的基因組DNA制備出印跡，所述酶在T-DNA區域內切割一次。首先對印跡探查是否存在hph，隨后探查是否存在gusA。gusA探針是利用引物CAT CCT CGA CGATAG CAC CC(SEQ ID NO72)和TCATGT TTG CCAAAG CCC TT(SEQ ID NO73)從pCAMBIA1305.2PCR擴增到的501bp長的產物；hph探針是利用引物CGC ATA ACA GCGGTC ATT GAC TGG AGC(SEQ ID NO74)和GCT GGG GCG TCG GTTTCC ACT ATC GG(SEQ ID NO75)從pCAMBIA1PCR擴增產生的375bp長的產物。
對于含有來自載體pMPB0057(pUbi1::bar-nos_Act1D::gusA(int))的T-DNA的轉基因小麥而言，用經限制性酶HindIII消化過的基因組DNA制備出印跡，所述酶在T-DNA區域內切割一次。首先對印跡探查是否存在bar，隨后探查是否存在gusA。gusA探針是利用引物ATG AAC TGT GCG TCACAG CC(SEQ ID NO76)和TTG TCA CGC GCT ATC AGC C(SEQ ID NO77)從pMPB0057PCR擴增到的451bp長的產物；hph探針是利用引物GTCTGC ACC ATC GTC AAC C(SEQ ID NO78)和GAA GTC CAG CTG CCAGAAAC(SEQ ID NO79)從pMPB0057PCR擴增產生的425bp長的產物。
對于含有來自載體pSB1_Ubi1::dsdA-ocs_Ubi1::DsRed2-nos的T-DNA的轉基因小麥而言，用經限制性酶SphI消化過的基因組DNA制備出印跡，所述酶在T-DNA區域內切割一次。首先對印跡探查是否存在DsRed2，隨后探查是否存在dsdA。DsRed2探針是利用引物CTG TCC CCC CAG TTC CAGTA(SEQ ID NO80)和CGATGG TGTAGT CCT CGT TGT G(SEQ ID NO81)從pSB1_Ubi1::dsdA-ocs_Ubi1::DsRed2-nos PCR擴增到的450bp長的產物；dsdA探針是利用引物GTG GGC TCAACC GGAAAT CT(SEQ ID NO82)和GCA GTT GTT CTG CGC TGA AAC(SEQ ID NO83)從pSB1_Ubi1::dsdA-ocs_Ubi1::DsRed2-nos PCR擴增產生的750bp長的產物。
對于含有來自載體pSB1_Ubi1::dao1A-ocs_Ubi1::DsRed2-nos的T-DNA的轉基因小麥而言，用經限制性酶SpeI消化過的基因組DNA制備出印跡，所述酶在T-DNA區域內切割一次。首先對印跡探查是否存在DsRed2，隨后探查是否存在dao1。DsRed2探針是利用引物CTG TCC CCC CAG TTC CAGTA(SEQ ID NO80)和CGATGG TGTAGT CCT CGT TGT G(SEQ ID NO81)從pSB1_Ubi1::dao1A-ocs_Ubi1::DsRed2-nos PCR擴增到的450bp長的產物；dao1探針是利用引物ACATCACGC CAAATTACC GC(SEQ ID NO84)和GCC CCA ACT CTG CTG GTA TC(SEQ ID NO85)從pSB1_Ubi1::dao1A-ocs_Ubi1::DsRed2-nos PCR擴增產生的700bp長的產物。
主要依據產品說明書，用Megaprime DNA標記試劑盒(AmershamInternational Inc，UK)產生α-32P dCTP來放射性標記上述的探針。將印跡在由0.5M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)、7％(w/v)SDS和1mM EDTA(pH7.5)組成的預雜交緩沖液中預雜交最少4個小時。在40rpm的旋轉分子雜交儀內，用由0.5M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)、7％(w/v)SDS和1mM EDTA(pH7.5)組成的新鮮雜交緩沖液按每平方厘米膜約1ml雜交緩沖液的比例在65℃下實施與α-32P dCTP標記探針的雜交共16到24個小時。用下面的溶液依次洗滌Southern雜交印跡50ml洗滌溶液#165℃下洗滌30分鐘共3次；洗滌溶液#265℃下洗滌30分鐘共2次。洗滌溶液#1包括40mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)、5％SDS和1mM EDTA(pH7.5)以及洗滌溶液#2包括40mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)、1％SDS和1mM EDTA(pH7.5)。從雜交瓶中取出膜，并將其置入到Whatman紙上，以便去除過多的洗滌溶液，用塑料密封膜包好，并將其暴露于磷顯像熒光屏或者置于x射線膜上。
對土壤桿菌介導轉化的Southern雜交分析通常發現低的整合拷貝數(1到超過6個拷貝)以及高比例的單個拷貝事件。從利用pCAMBIA1305.2和限制性酶EcoR1的Southern分析鑒定到的片段大小通常是在2到30Kb之間。
小麥植物中轉基因的分離遵循著轉基因基因座的正常的孟德爾遺傳規律。對于單一基因座和兩個基因座事件而言，預計分離率分別是3:1和15:1。通過轉基因種子在選擇劑中的萌芽可以觀察到轉基因基因組在T1和T2子代種子中的分離。例如，在大于5mM D-絲氨酸中的萌芽容許區分出轉基因的和未轉基因的pSB1_Ubi1::dao1-ocs_Ubi1::DsRed2-nos植物。
實施例7不同類小麥基因型的轉化 為了確定出本發明的方法用于轉化小麥成熟胚的普遍可應用性，用基本上同實施例1所述的方法轉化從多種小麥基因型(表8)的干籽粒中新鮮分離到的小麥成熟胚。
在接種后3天，基本上如實施例1所述的方法確定出gusA表達。如圖5和6所示，轉化方法能夠轉化所有在本研究中測試的變體，說明本發明的普遍可應用性。
表8用于土壤桿菌介導的轉化的小麥基因型 實施例8各種小麥基因型的植物再生 為了確定出本發明方法用于產生轉基因植物的普遍可應用性，對沖實施例4的小麥品種的干籽粒中新鮮分離到的成熟胚進行利用基本上如實施例1所述方法的土壤桿菌介導轉化以及利用基本上如實施例2到4所述方法的再生。
圖7和8顯示了不同類小麥基因組的再生頻率的變異性。
實施例9SoytoneTM對轉化效率的影響 土壤桿菌培養基中的蛋白胨增加了與纖維素生物合成相關基因的表達(Matthysse et al，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，101986-991，2004)。為了測試是否蛋白胨有助于土壤桿菌介導的轉化，實施了在實施例1中所述的轉化方法，但是，接種和共培養培養基中的SoytoneTM濃度是不同的。
基本上如實施例1所述，通過計算出接種3天后每個外植體的平均gusA表達灶數目可以確定出轉化效率。如圖9所示，甚至在沒有SoytoneTM時，轉化方法也能產生轉基因小麥植物。但是，SoytoneTM的存在(例如0.2％或0.4％(w/v))顯著地增加了每個外植體的平均gusA表達灶數目。這些濃度幾乎使得每個外植體的平均gusA表達灶數目加倍。
實施例10影響表達效率的因素 為了確定出轉化的最佳條件，修飾了實施例1所述的方法來測試各種條件。例如，測試了培養基中不同濃度的營養物、胚是否存在種皮、有或無SoytoneTM和/或特殊的糖的影響。具體的，測定了以下條件的影響 ●1:20稀釋的Murashige和Skoog培養基； ●1:10稀釋的Murashige和Skoog培養基； ●1:2稀釋的Murashige和Skoog培養基，以及去除了胚的種皮； ●加入SoytoneTM以及去除種皮； ●加入2％山梨糖醇； ●加入2％麥芽糖； ●加入2％葡萄糖；和 ●加入2％蔗糖。
基本上如實施例1所述，通過計算出接種3天后表達gusA灶的外植體的平均比例可以確定出轉化效率。
如圖10所示，測試的所有條件都造成了小麥細胞的轉化，說明轉化方法的穩健性能。圖10也顯示出了最佳的轉化條件包括加入SoytoneTM和種皮去除。
實施例11PPT抗性轉基因小麥植物 11.1 載體pBPS0054及向小麥胚內的轉化 載體pBPS0054是基于在Hajdukiewicz et al，Plant Mol Biol.25989-94，1994中所述的載體pPZP200。但是，該載體被修飾成包括在組成型玉米遍在蛋白啟動子控制下的PPT抗性的bar基因。圖7顯示了pBPS0054的載體圖譜。
表8顯示了用實施例1所示的方法經pBPS0054轉化的小麥品種。
11.2 轉基因小麥植物的再生 在共培養以及隨后的洗滌之后，將外植體放置在如實施例1所示的愈傷組織誘導培養基上，沒有進行選擇，但是所述培養基具有控制土壤桿菌生長的抗生素(頭孢噻肟250mg/L或特美汀150mg/L)。容許成熟胚外植體在暗處3周產生愈傷組織。將顯示出愈傷組織的外植體轉移到加有抗生素的新鮮培養基中進行亞培養。在亞培養期間，去除非胚產生性愈傷組織，留下上胚層以及盾片組織的應答區。
在至少3周的愈傷組織誘導之后，將胚產生性愈傷組織轉移到由1xMurashige和Skoog(同上)大量營養劑、1x微量營養劑和有機維生素、200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L玉米素和0.8％(w/v)Bacto瓊脂以及控制土壤桿菌生長的抗生素(例如頭孢噻肟250mg/L或特美汀150mg/L)組成的再生培養基中。將外植體在亮處再培養2周，然后將其轉移到加有2.5-10mg/L L-2-氨基-4(羥基)(甲基)氧膦基丁酸(phosphinothricin)和抗生素的新鮮再生培養基中。通過被轉移到加有化學選擇劑的新鮮再生培養基中的推測轉基因小植物/愈傷組織進行1到2個2到3周到亞培養周期來傳代再生組織。
再過10天之后，將再生小植物轉移到加有用于啟動生根的1mg/L NAA的MS[1/2]中。將任何在生根培養基中存活超過3周以及具有健康生根的再生小植物栽培到由泥炭和沙土(1:1)組成的苗圃混合物中，并維持于22℃到24℃以及苗圃濕度箱系統的高濕度下。在2周之后，從濕度箱中取出植物，手工澆水以及給予液體AquasolTM直到成熟。給T0植物取樣進行基因組DNA和分子分析，并收集成熟的T1種子。
11.3 確定PPT抗性 對于所產生的每個植物系，選出來自不同分蘗的三片健康的看起來等大的葉子，進行葉子涂抹。用棉簽施用BASTA殺蟲劑(Bayer Crop Sciences)形式的PPT(0.2g/L和2g/L)以及濕化劑Tween-20(0.1％)，涂抹所選葉子遠端半部的上表面(7-10cm)，單獨的Tween-20(0.1％)作為對照。在7天后，根據在經殺蟲劑溶液涂抹表面上的壞死比例確定出PTT抗性。
11.4 PCR分析植物以檢測出bar基因的存在 根據產品說明書用Qiagen Mini植物DNA提取試劑盒分離出基因組DNA。在PCR之前，用納米滴分光光度儀測定出DNA的量。
PCR的引物序列是wknox4D5′-CAA CAG GAG AGC CAG AAG GT-3′和5′-AGG TCA CCG GTAACG GTAAG-3′。該引物作為擴增250bp Knotted14D等位基因的陽性PCR內對照；bar5′-GTC TGC ACC ATC GTC AAC C-3′(SEQ ID NO63)和5′-GAA GTC CAG CTG CCA GAAAC-3′(SEQ ID NO64)。
利用標準的技術循環PCR反應，檢測bar基因的反應的退火時間為57℃。每個PCR分析要重復至少兩次。
對反應物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，出現444bp擴增產物是測試樣品中存在轉基因的指示。
實施例12用于植物轉化的Ti載體 用標準技術進行DNA和RNA加工處理。酵母R.gracilis生長在含有30mM D-丙氨酸的液體培養基中，以誘導dao1(編碼DAAO的基因)。從酵母中提取出總RNA，用于cDNA合成。通過PCR用PCR引物5′-ATTAGATCTTACTACTCGAAGGACGCCATG-3′(SEQ ID NO64)和5′-ATTAGATCTACAGCCACAATTCCCGCCCTA-3′(SEQ ID NO65)從cDNA模板中擴增出dao1基因。將PCR片段亞克隆到pGEM-T Easy載體(Promega)內，隨后將其用于取代pPZP200ubi::bar-nos_R4R3中的bar抗性基因，以產生pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3。測序分析載體，以檢查它們是否含有正確的結構。
利用包括序列attB1-ATGGCCTCCTCCGAGGAC(SEQ ID NO66)和attB2-GCCACCATCTGTTCCTTTAG(SEQ ID NO67)的引物以及從Clontech獲得的作為模板的pdsRED載體PCR擴增出編碼dsRED的核酸。將PCR片段重組到pDONOR221載體(Invitrogen)內，產生pDONOR/dsRED輸入克隆。
利用包括序列attB4-ATCGACTAGTCCCATCCCTCAGCCGCCTTTCACTATC(SEQ ID NO68)和attB1-ATCGGCGGCCGCCCCATCCTCGGCGCTCAGCCATCTTCTACC(SEQ ID NO69)的引物PCR擴增出包括2175bp稻的5’未翻譯啟動子序列act1D(act1D)的核酸。將PCR片段重組到pDONORP4-P1R載體(Invitrogen)內，產生pDONOR/act1D輸入克隆。此外，利用包括序列attB2-ATCGCCACCGCGGTGGAGTCCGCAAAAATCACCAGTCTC(SEQIDNO70)和attB3-ATCGCCACCGCGGTGGaGGTCACTGGATTTTGGTTTTAGG(SEQID NO71)的引物PCR擴增出包括CaMV35s多腺苷化信號的核酸。將PCR片段重組到pDONORP2R-P3載體(Invitrogen)內，產生pDONOR/35ST輸入克隆。
將輸入克隆pDONOR/act1D、pDONOR/dsRED、pDONOR/35ST都重組到目的載體pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3內，產生載體pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::dsRED-35ST。測序分析載體，以確認其是否含有正確的結構。
基本上如實施例1所示，將pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::dsRED-35表達載體轉化到植物胚內。然后利用安裝在倒置顯微鏡(Axiovert 100)上的Zeiss(Jena，Germany)LSM 510 CLSM分析轉化胚切片的dsRED表達情況。激發光是由488nmAr激光提供，并受acousto optical tuneable濾光器的控制。為了分開激發光和發射光，使用了兩個二色分光鏡。用HFT488二色分光鏡反射激發光并傳遞熒光發射。用鏡子將發射的熒光反射到NFT545第二個分光鏡上。經NFT545分光鏡傳遞的熒光經565到590nm帶通濾光器過濾，形成了紅色通道。用Zeiss plan-neofluar 40x(N.A.1.3)油鏡進行掃描。
然后選出那些dsRED表達陽性的胚切片，進行基本上如實施例2到3中任一所述的植物再生。胚和愈傷組織在包括5mM D-丙氨酸和5mM D-絲氨酸的生長培養基中生長。用D-丙氨酸和D-絲氨酸選擇轉基因植物。
實施例13具有改良面包制作表征的轉基因小麥 13.1 具有增強HMW-GS 1Ax1表達的小麥 質粒pHMW1Ax1含有小麥的HMW-GS1Ax1基因，所述基因的表達是受其自身的胚乳特異性啟動子驅動的(Halford et al，Theoret.Appl Genet.53373-378，1992)。從pHMW1Ax1中切下HMW-GS1Ax1基因，并將其克隆到pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::dsRED-35內，取代dsRED。產生載體pPZP200ubi::dao1-nos_HMW-35。
然后將載體pPZP200ubi::dao1-nos_HMW-35轉化到不同基因型的小麥胚內。然后用基本上如實施例2到4中所述的任一方法再生出轉基因小麥植物。T0植物生長到成熟，并自我受精產生T1植物。然后收集T0和T1植物的種子。
13.2 蛋白分析 通過用研缽和研杵單個地碾碎成熟干種子制備出蛋白提取物。用200μl樣品緩沖液(2％SDS、5％β-巰基乙醇、0.001％派羅寧Y、10％甘油、0.063M Tris HCl，pH6.8)渦旋10到14mg每個種子產生的粉末，并在旋轉搖晃器(250rpm)中溫育2個小時。離心提取物(10分鐘，14,000rpm)，煮沸上清液5分鐘，以變性蛋白。用SDS-PAGE分離蛋白(基本上同Laemmli，Nature 227680-685，1970)。簡單的，將20到30μl每個樣品加樣到13cm含有10％(w/v)丙烯酰胺、0.8％(w/v)雙丙烯酰胺的凝膠內，跑膠，直到染料前端已經達到了凝膠底部，使得總提取蛋白仍保留在凝膠上。從HMW-GS停留處解離出1Ax1帶，其中兩者不能完全彼此分開。首先將凝膠在沒有染料的染色溶液中固定0.5到1個小時，然后在考馬斯亮藍R-250中染色4到6個小時(基本上同Neuhoff et al，Electrophoresis 9255-262，1988)。通過在5％甲醇和7％乙酸(體積/體積)的水溶液中脫色到獲得清晰的背景可以顯露出蛋白條帶。將凝膠儲存在7％乙酸水溶液(體積/體積)中。用數字顯像系統例如Alpha Innotech(San Leandro，CA)IS-1000數字顯像系統掃描染色凝膠。通過帶間背景消減校正電泳道和峰值。從近140kDa的每個HMW-GS1Ax1帶的頂部確定出每個電泳道的背景強度。計算出相對于校正的電泳道值或校正的HMW-GS值的HMW-GS1Ax1的量。為了計算出總HMW-GS水平，將每個電泳道的蛋白含量標準化。
13.3 Southern分析 通過CTAB方法從能夠在D-絲氨酸和D-丙氨酸中生長的植物葉子中分離出基因組DNA(基本上同Lassner et al，Plant Molec.Biol.Rep.7116-128，1989所述)。用XbaI消化純化DNA(20到25μg)，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳，并印跡到Hybond-N膜(Amersham)上。雜交探針包括來自源于pHMW1Ax1的EcoRI和HindIII消化后的HMW-GS1Ax1基因編碼區的2.2kb片段。用隨機引物標記試劑盒(GIBCO-BRL)標記探針。在65℃實施雜交24個小時，用放射自顯像術顯示出信號。
13.4 分離分析 為了確定出轉基因DAAO在T1代中的分離率，將每個轉基因系的20個胚在加有D-丙氨酸和D-絲氨酸的培養基中萌芽半濃度MS鹽和維生素(同上)以及15g/L蔗糖、2.5g/L Gelrite、5mM D-丙氨酸、5mM D-絲氨酸，pH5.8(B3培養基)。通過在B3培養基上測試所有HMW-GS1Ax1蓄積系的最多到12株T1植物的20個胚的萌芽率來鑒定出T2種子中DAAO純合子的系。用SDS-PAGE單個地分析每種純合子DAAO系的10個種子中的HMW-GS1Ax1，以便確定出是否發生了共分離。
實施例14表達乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的小麥 14.1 表達HBsAg的小麥 利用含有attB1和attB2的引物從質粒pWR/HBs-3中PCR擴增出HBsAgDNA編碼序列(Cattaneo，Nature 305336-338，1983)。將該片段重組到pDONOR221內，產生輸入克隆pDONOR/HBsAg。然后將該片段以及輸入克隆pDONOR/act1D和pDONOR/35ST都重組到目的載體pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3內，產生pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::HbsAg-35ST。
14.2 pCAMBIAdao1/dsRED-HBsAg向根瘤土壤桿菌的轉移 將質粒pCAMBIAdao1/dsRED-HBsAg轉移到從Clontech Laboratories，Inc獲得的根瘤土壤桿菌菌株LBA4404。
將根瘤土壤桿菌培養在AB培養基中(An，Meth.Enzymol.153292-305，1987)，知道培養物的600納米處(600nm)的光密度(O.D.)達到約0.5。然后在2000g離心細胞，獲得細菌細胞沉淀。將土壤桿菌沉淀重懸于1ml冰冷的20mM CaCl2中。將質粒(0.5μg)加入到1.5ml微離心管的0.2ml根瘤土壤桿菌的氯化鈣懸浮液中，并在冰上孵育60分鐘。將質粒和根瘤土壤桿菌細胞混合物在液氮中冷凍1分鐘，在25℃水箱中融化，然后與5倍體積的富MGL培養基(An，同上)混合。然后輕微搖晃下在25℃溫育質粒和根瘤土壤桿菌混合物4個小時。將混合物在含有100μg/ml壯觀霉素的Luria肉湯瓊脂培養基上鋪板。在選擇所形成的含有帶質粒的轉化土壤桿菌的克隆之前，將培養板在25℃溫育3天。
14.3 小麥的轉化 利用基本上如實施例1所述的方法將pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::HBsAg-35ST載體轉化到各種小麥基因型的小麥胚內。然后用基本上如實施例2到4中的任一方法再生出轉基因小麥植物。T0植物生長到成熟，并自我受精產生T1植物。然后收集T0和T1植物的種子。
14.4 生物化學檢測和免疫化學檢測 收集植物的根、莖、葉和種子樣品。將每種組織都在含1.0mM EDTA和作為蛋白酶抑制劑的0.5mM PMSF的100mM磷酸鈉(pH7.4)中勻漿化。在5000xg下離心勻漿液10分鐘。然后將每種上清液的一小部分用于Lowry法的蛋白濃度測定。剩下的上清液用于利用兩種標準檢測法的HBsAg表達水平的測定(a)HBsAg放射免疫檢測法，試劑購自Abbott實驗室和(b)利用先前所述的Peng和Lam的方法(Vis.Neurosci.6357，1991)以及購自Zymed實驗室的抗HBsAg的單克隆抗體進行的免疫印跡法。
實施例15具有抗小麥線條花葉病毒(WSMV)抗性的轉基因小麥 15.1 穩定表達WSMV外殼蛋白的小麥 對質粒pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3進行遺傳加工，引入編碼WSMV外殼蛋白的核酸(SEQ ID NO48)。所形成的質粒稱作pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::WSMV-35ST。
利用基本上如實施例1所述的方法將pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::WSMV-35ST載體轉化到各種小麥基因型的小麥胚內。然后用基本上如實施例2到4中的任一方法再生出轉基因小麥植物。T0植物生長到成熟，并自我受精產生T1植物。然后收集T0和T1植物的種子。
15.2 確定WSMV抗性的檢測法 從轉基因小麥植物和野生型(未轉化)小麥植物中分離出種子。用包括WSMV的溶液機械地接種種子。然后種植被接種的種子，野生型和轉基因的幼苗都生長在培育箱中。
在足夠長的容許葉形成的生長之后，觀察葉子上的WSMV感染的肉眼癥狀，例如葉子發黃、葉子變形和/或縮葉。
只要野生型植物發生了WSMV感染的癥狀并顯示出了WSMV包被基因的表達，就可以推定那些沒有顯示出這些癥狀的轉基因植物是抗這種病原體感染的。
實施例16抗小麥赤霉病(head scab)小麥 16.1 穩定表達奇甜蛋白樣基因的小麥的產生 修飾pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3以便將奇甜蛋白樣基因(SEQ ID NO50)以及act1D啟動子和35S多腺苷酸化信號都克隆到R4R3框內。基本上如Kuwabara et al.，Physiol.Plantarum 115101-110，2002所述的獲得奇甜蛋白樣蛋白。奇甜蛋白樣蛋白是應激應答蛋白，其在治療植物病原體方面是特別有效的，因為它們能夠抑制這種病原體感染植物。
所形成的質粒稱作pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::TL1-35ST。
利用基本上如實施例1所述的方法將pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::TL1-35ST載體轉化到各種小麥基因型的小麥胚內。然后用基本上如實施例2到4中的任一方法再生出轉基因小麥植物。T0植物生長到成熟，并自我受精產生T1植物。然后收集T0和T1植物的種子。
16.2 小麥赤霉病抗性的檢測法 在被用于生物檢測之前，將轉化小麥的幼苗生長在經蒸氣消毒(60℃30分鐘)的培育箱的盆栽混合物中(Terra-lite Rediearth，W.R.Grace，Cambridge，Mass.)，25℃、14h光照/天共生長約8周。在澄清的V-8液體瓊脂糖上、25℃下、12h光照/天共7天產生禾谷鐮刀菌分離株Z3639的分生孢子接種物，同時通過接種板并在25℃溫育48個小時在TSA/5上產生每種微生物菌株的生物量。用禾谷鐮刀菌3639的分生孢子接種每個微生物菌株兩個小麥穗的中花(middle floret)。將接種的小麥植物放在溫室架上的透明塑料套內72個小時，以促進高的相對濕度。然后在接種后16天，去除塑料套，并計數出觀察到鐮刀菌的穗枯萎癥狀的小麥穗。那些沒有顯示出鐮刀菌穗枯萎征象的小麥被認為是表達了賦予抗赤霉病保護性的蛋白。
16.2 赤霉病抗性的溫室檢測法 如上所述，將轉化和野生型幼苗每盆兩株生長在經巴斯德消毒過的盆栽混合物中共8周。如上所述的在CV-8瓊脂糖上產生禾谷鐮刀菌分離株Z3639、DOAM和Fg-9-96的分生孢子。8周后，將小麥植物轉移到溫室架上約1周。在小麥穗開始開花時(一般在溫室架上1周結束時)，開始生物控制的生物檢測。用禾谷鐮刀菌接種小麥穗的中花。將接種的小麥植物放在溫室架上的透明塑料套內72個小時，以促進最佳地鐮刀菌穗枯萎發生所必需的高相對濕度和游離水分。然后在接種后16天，去除塑料套，并根據0到100％分級的小麥穗量表(Stack et al，North Dakota State UniversityExtension Service Bulletin PP-1095，1995)以及0到100％疾病發生率量表計數出小麥穗的嚴重度。在穗成熟后測定出粒的重量。健康穗中完全發育的粒具有高100粒重，而受禾谷鐮刀菌感染的穗中枯萎粒具有更低的100粒重。從顯示出疾病發生癥狀的隨機挑選的穗中回收到了禾谷鐮刀菌。
實施例17耐旱小麥 17.1 穩定表達DREB1A的小麥 修飾pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3以便將DREB1A cDNA(SEQ ID NO58)以及act1D啟動子和35S多腺苷酸化信號都克隆到重組盒內。基本上如Wang et al，Plant MoI Biol.28605-617，1995所述的獲得DREB1A cDNA。DREB1A是當植物暴露于干旱時表達的晚期胚產生富裕(LEA)蛋白。
也用rd29A啟動子取代pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::DREB1A-35ST中的act1D啟動子，因為組成型啟動子控制下的表達已經顯示其造成了植物在正常環境下的嚴重生長遲緩(Kasuga et al，Nature Biotechnology 17287-291，1999)。
所形成的蛋白稱作pPZP200 ubi::dao1-nos_rd29a::DREB1A-35ST。
利用基本上如實施例1所述的方法將pPZP200ubi::dao1-nos_rd29a::DREB1A-35ST載體轉化到各種小麥基因型的小麥胚內。然后用基本上如實施例2到4中的任一方法再生出轉基因小麥植物。T0植物生長到成熟，并自我受精產生T1植物。然后收集T0和T1植物的種子。
17.2 轉基因植物對冷凍、干旱和高鹽度應激的耐受性 將植物種植在填滿1:1珍珠巖和金精石混合物的9cm盆中。植物在22℃近2500勒克斯的連續光照下生長。將3周大植物的不同樣品暴露于冷凍和干旱應激。
通過將植物暴露于-6℃溫度2天，然后恢復到22℃5天來產生冷凍應激。
通過停止澆水2周來產生干旱應激。
通過將生長在瓊脂糖板上并且輕輕地從生長培養基中拔出的植物浸泡在600mM NaCl溶液中2個小時來產生高鹽度應激。
然后將植物轉移到在正常生長條件下的盆中3周。
然后確定出相對于對照(未轉化植物)的存活并連續生長的植物數目。用卡方檢驗確定出數值的統計學顯著性。
實施例18具有降低水平Waxy的植物 18.1 穩定表達siRNA以抑制顆粒結合性淀粉合酶I表達的小麥 修飾pPZP200ubi::dao1-nos_act1D-rfa-RGA2-rfa(as)-35ST(圖24)以便將編碼源自小麥顆粒結合性淀粉合酶(SEQ ID NO60)的siRNA的核酸克隆到act1D啟動子和35S多腺苷化信號之間的重組盒內。所形成的載體稱作pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::waxy-35ST。
利用基本上如實施例1所述的方法將pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::waxy-35ST載體轉化到各種小麥基因型的小麥胚內。然后用基本上如實施例2到4中的任一方法再生出轉基因小麥植物。T0植物生長到成熟，并自我受精產生T1植物。然后收集T0和T1植物的種子。
18.2 小麥種子中的GBSSI的表達 確定出小麥種子中的GBSSI mRNA的表達水平。將組織在液氮中冷凍，并磨碎成細粉末，然后用polytron勻漿器將其勻漿化。12000xg離心10分鐘去除不可溶的物質，然后用氯仿提取上清液，并用異丙醇沉淀。基本上根據產品的說明書用Trizol試劑(Life Technologies/Gibco-BRL，Cleveland)提取出RNA。
將總RNA樣品進行熱變性，然后用含有2.2M甲醛的1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳將其分離，并通過毛細管轉移將其轉移到GeneScreen Plus膜(NEN Research Products，Boston)。在含有50％(v/v)甲醛、0.2％(w/v)聚乙烯吡咯酮、0.2％(w/v)Ficoll、0.2％(w/v)牛血清白蛋白、50mM Tris(pH7.5)、1.0M NaCl、0.1％焦磷酸鈉、1％(w/v)SDS、10％(w/v)硫酸葡聚糖、和100μg/mL變性鮭精DNA的緩沖液中42℃預雜交印跡，然后在含32P標記探針的相同緩沖液中再雜交1天。在2x SSC和1％(w/v)SDS、65℃洗滌膜30分鐘兩次，在0.1x SSC、65℃洗滌膜10分鐘一次，或者洗滌直到背景放射性已經降低到了接近0。
18.3 轉基因小麥種子中的直鏈淀粉含量 用如下的量熱法和電流滴定法測定出直鏈淀粉含量 (1)依照Kuroda等的方法實施基于碘顯色的量熱法(Jpn.J.Breed.39(Suppl，2)142-143，1989)。將35mg淀粉在5ml0.75N NaOH和25％水樣乙醇中凝膠化，并用乙酸中和。用比色計測定出淀粉碘復合物在600nm處的吸光度。用兩種已知淀粉含量的小麥淀粉作為對照。第一個對照小麥淀粉購自Wako Pure Chemicals Ltd，含有31％直鏈淀粉(通過自動分析儀利用馬鈴薯直鏈淀粉和支鏈淀粉作為標準物測定出的含量)，第二個對照蠟質小麥淀粉含有約0.6％直鏈淀粉。
(2)利用脫脂淀粉以及碘電流滴定設備(例如Model 3-05，MitamuraRiken Kogyo，Japan)實施電流滴定法(Fukuba and Kainuma，in Starch ScienceHandbook(Nakamura M.and Suzuki S.編)TokyoAsakura Shoten，pp174-179，1977)。通過假定20mg碘可以結合100mg純小麥直鏈淀粉計算出淀粉的含量。利用酚-硫酸法(例如基本上如Dubois et al，Anal.Chem.28350-356，1956所述)以及葡萄糖作為標準物確定出所用溶液的淀粉濃度。
實施例19大麥的土壤桿菌介導轉化(大麥) 將來自大麥(例如品種Golden Promise)的籽粒在0.8％(v/v)NaOCl溶液中表面消毒30分鐘，并在無菌蒸餾水中洗滌至少4次。
從經表面消毒的籽粒中切下成熟胚，去除種皮，將其直接用于土壤桿菌介導的轉化。圖11A-E顯示了從干大麥籽粒中分離出具有完整上胚層和盾片的胚的過程。
外植體被直接用于土壤桿菌介導的轉化。在50mL Falcon管中，用包括pCAMB1A1305.2載體(在CaMV35s啟動子的控制下表達GUS報告子基因)的土壤桿菌菌株EHA105接種10到15ml加有100μg/mL利福平和卡那霉素的LB，在27到28℃下溫育24到48個小時。對于接種而言，用100μl土壤桿菌培養物接種25mL加有卡那霉素的新鮮LB，并溫育24個小時。在室溫下，將該完全濃度的接種物在3000rpm離心10分鐘，所形成的沉淀重懸于液體接種培養基(MS[1/10])中，使得OD600＝0.25-0.8。該接種培養基是由1/10濃度的液體Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol Plant，15473-497，1962)基本鹽(MS[1/10])以及2mg/L2，4-D、200μM乙酰丁香酮和0.02％(w/v)SoytoneTM組成。
輕微攪拌下，將土壤桿菌感染在室溫下標準化3個小時。隨后，在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量營養劑、1x微量營養劑和有機維生素、以及200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L2，4-D以及200μM乙酰丁香酮和0.8％-2.0％(w/v)Bacto瓊脂組成的培養基中21℃、暗處共培養3天，其中胚軸優選地朝下。
任選地用沒有乙酰丁香酮或SoytoneTM但加有250mg/L頭孢噻肟的液體MS[1/10]充分地洗滌外植體。或者，用加有250mg/L頭孢噻肟的無菌水洗滌外植體，直到不再看到土壤桿菌殘留的征象(即洗滌溶液在洗滌后仍是清亮的)。
利用組織化學GUS檢測法(Jefferson Plant Mol.Biol.Rep.5387-4051987)確定出含150mg/L特美汀的誘導培養基上的3天后(或其他時間點)取樣的外植體上的一過性gusA的表達。將外植體在含1mM X-Gluc、100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、0.5mM鐵氰化鉀、0.5mM亞鐵氰化鉀和0.1％(v/v)Triton X-100的緩沖液中、37℃下溫育過夜。在顯微鏡下計數出藍色gusA表達灶，通過計數至少有一個gusA表達灶的外植體以及計數出每個胚的表達灶數目可以評價T-DNA轉運。為了檢測穩定的gusA表達愈傷組織，將來自再生小植物的苗和葉片段都在37℃下培育過夜，如果需要在25℃下再培育1到2天。如圖11F所示，在接種3天后的轉化胚中可以檢測到gusA的表達。
實施例20愈傷組織誘導和轉基因大麥植物的再生 為了確定出本發明方法用于轉化大麥的普遍可應用性，利用基本上如實施例2到4中的任一方法分別再生如實施例19所述的來自大麥品種GoldenPromise的干籽粒的轉化胚。
圖12顯示了源自對源自干籽粒的成熟胚的土壤桿菌介導轉化的大麥植物的再生。
實施例21成熟稻(稻)的土壤桿菌介導轉化 將來自稻(例如Jarrah a Japonica型)的籽粒在0.8％(v/v)NaOCl溶液中表面消毒30分鐘，并在無菌蒸餾水中洗滌至少4次。
從經表面消毒的籽粒中切下成熟胚，去除種皮，將其直接用于土壤桿菌介導的轉化。圖13A-F顯示了從稻小麥籽粒中分離出具有完整上胚層和盾片的胚的過程。
外植體被直接用于土壤桿菌介導的轉化。在50mL Falcon管中，用包括pCAMB1A1305.2載體(在CaMV35s啟動子的控制下表達GUS報告子基因)的土壤桿菌菌株EHA105接種10到15ml加有100μg/mL利福平和卡那霉素的LB，在27到28℃下溫育LB24到48個小時。對于接種而言，用100μl土壤桿菌培養物接種25mL加有卡那霉素的新鮮LB，并溫育24個小時。在室溫下，將該完全濃度的接種物在3000rpm離心10分鐘，所形成的沉淀重懸于液體接種培養基(MS[1/10])中，使得OD600＝0.25-0.8。該接種培養基是由1/10濃度的液體Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol Plant，15473-497，1962)基本鹽(MS[1/10])以及2mg/L2，4-D、200μM乙酰丁香酮和0.02％(w/v)SoytoneTM組成。
輕微攪拌下，將土壤桿菌感染在室溫下標準化3個小時。隨后，在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量營養劑、1x微量營養劑和有機維生素、以及200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L2，4-D以及200μM乙酰丁香酮和0.8％-2.0％(w/v)Bacto瓊脂組成的培養基中21℃、暗處共培養3天，其中胚軸優選地朝下。
任選地用沒有乙酰丁香酮或SoytoneTM但加有250mg/L頭孢噻肟的液體MS[1/10]充分地洗滌外植體。或者，用加有250mg/L頭孢噻肟的無菌水洗滌外植體，直到不再看到土壤桿菌殘留的征象(即洗滌溶液在洗滌后仍是清亮的)。
利用組織化學GUS檢測法(Jefferson Plant Mol.Biol.Rep.5387-4051987)確定出含150mg/L特美汀的誘導培養基上的3天后(或其他時間點)取樣的外植體上的一過性gusA的表達。將外植體在含1mM X-Gluc、100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、0.5mM鐵氰化鉀、0.5mM亞鐵氰化鉀和0.1％(v/v)Triton X-100的緩沖液中、37℃下培育過夜。在顯微鏡下計數出藍色gusA表達灶，通過計數至少有一個gusA表達灶的外植體以及計數出每個胚的表達灶數目可以評價T-DNA轉運。為了檢測穩定的gusA表達愈傷組織，將來自再生小植物的苗和葉片段都在37℃下培育過夜，如果需要再在25℃下培育1到2天。如圖13F所示，在接種3天后的轉化胚中可以檢測到gusA的表達。
實施例22玉米(玉蜀黍)的土壤桿菌介導轉化 用共合體二元載體LM227(pSB1_Ubi1::DsdA-ocs_ScBV::DsRed2-nos)轉化土壤桿菌EHA105，并在應用之前將其在液體感染培養基中預誘導約3個小時，接種前的OD600約為1.0。
將玉米粒浸泡在Domestos(次氯酸鈉49.9g/l(氯含量為4.75％m/v)、氫氧化鈉12.0g/l、堿性鹽0.5g/l)中，并在搖晃器(150rpm)上溫育30到45分鐘。用無菌水洗滌粒4次，并在第4次浸泡之后將其放置到Petri皿上，容許其軟化>3個小時。
通過用鑷子夾住單個玉米粒并將胚的兩側切出兩個半月形，分離出成熟胚(見圖14A-D)。將切下的胚對切，并放入到感染培養基(1/10MS鹽、3％(w/v)蔗糖、200μM乙酰丁香酮、0.04％(w/v)SoytoneTM、2mg/L2，4-D、pH5.7)上，直到分離出所有的外植體。去除感染培養基，并用約5mL土壤桿菌懸浮液(用60x15mm板)取代感染培養基。在27mmHg下真空過濾切下的胚5分鐘。將感染板在50rpm搖晃器上溫育2個小時。在接種之后，去除土壤桿菌懸浮液，并將外植體轉移到共培養培養基(1/10MS鹽、3％(w/v)麥芽糖、200μM乙酰丁香酮、2mg/L2，4-D、8g/L瓊脂糖固化，pH5.7)上，切面朝向培養基。將外植體在21℃共培養3天，然后轉移到回收培養基(MS鹽、肌醇0.1g/l、鹽酸硫胺素20mg/L、酪蛋白水解物1mg/L、脯氨酸0.69g/l、MES1.95g/L、麥芽糖30g/L、8g/L瓊脂糖固化、pH5.7)中7天。在7天后，將胚產生性培養物在加有5mM D-絲氨酸的回收培養基中進行亞培養。
利用裝有DsRed2濾光器的Leica立體顯微鏡確定出回收培養基上3天或4天(或其他指定的時間)取樣的外植體上的一過性DsRed2表達。如圖14E和F所示，玉米組織表達了DsRed2。
序列表
<110>分子作物育種代理有限公司
<120>產生轉基因禾本科細胞和植物的方法
<130>131242
<150>US 60/757,994
<151>2006-01-11
<150>AU 2006900826
<151>2006-02-20
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<170>PatentIn version 3.4
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<213>Rhodotorula gracilis
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<213>Aspergillus niger
<400>43
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<221>CDS
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<213>Hordeum vulgare
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<400>56
<210>57
<211>213
<212>PRT
<213>Hordeum vulgare
<400>57
<210>58
<211>651
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(651)
<400>58
<210>59
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>59
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<211>1818
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<213>triticum aestivum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1818)
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<211>605
<212>PRT
<213>triticum aestivum
<400>61
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>oligonucleotide for PCR amplification of Knotted 1 4D allele of
wheat
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<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>oligonucleotide for PCR amplification of Knotted 1 4D allele of
wheat
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<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplification of D-amino acid oxidase from R.
gracilis
<400>64
<210>65
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplification of D-amino acid oxidase from R.
gracilis
<400>65
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<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for PCR amplification of mutant discosoma red
fluorescent protein designated attB1
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<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for PCR amplification of mutant discosoma red
fluorescent protein designated attB2
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<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplifying 2175bp of5’untranslated promoter
sequence，actlD(actlD)from rice designated attB4
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<211>42
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplifying 2175bp of 5’untranslated promoter
sequence，actlD(act1D)from rice designated attB1
<400>69
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<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplifying CaMV35s polyadenylation signal
designated attB2
<400>70
<210>71
<211>40
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplifying CaMV35s polyadenylation signal
designated attB3
<400>71
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting GusA gene by
Southern hybridization
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<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting GusA gene by
Southern hybridization
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<212>DNA
<213>artificia1 sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting hph gene by
Southern hybridization
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<211>26
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting hph gene by
Southern hybridization
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<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting GusA gene by
Southern hybridization
<400>76
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<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting GusA gene by
Southern hybridization
<400>77
<210>78
<211>19
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting bar gene by
Southern hybridization
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<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting bar gene by
Southern hybridization
<400>79
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<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
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<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting DsRed2 gene by
Southern hybridization
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<212>DNA
<213>artificial sequence
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<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting DsRed2 gene by
Southern hybridization
<400>81
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<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
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<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting dsd A gene by
Southern hybridization
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<211>21
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting dsd A gene by
Southern hybridization
<400>83
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<211>20
<212>DNA
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<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting dao 1 gene by
Southern hybridization
<400>84
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting dao 1 gene by
Southern hybridization
<400>8權利要求
1.一種產生轉基因禾本科植物細胞的方法，所述方法包括
(i)從成熟禾本科籽粒獲得胚細胞；和
(ii)用能夠轉化植物細胞的細菌接觸所述胚細胞，所述細菌包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，所述接觸在足以使得所述細菌將所述轉移核酸引入到一個或多個細胞內的條件下進行一段時間，
由此產生轉基因禾本科植物細胞。
2.權利要求1的方法，包括從成熟籽粒獲得胚細胞以及用包括核酸構建體的細菌接觸胚細胞，而無需首先從所述胚細胞誘導愈傷組織形成。
3.權利要求1的方法，包括在不足以使得從所述胚細胞形成愈傷組織的條件下用所述細菌接觸胚細胞一段時間。
4.權利要求1到3中任一項的方法，其中在從成熟籽粒獲得所述胚細胞的3天內，用所述細菌接觸胚細胞。
5.權利要求1到4中任一項的方法，其中足以使得細菌將核酸構建體引入到胚細胞的細胞內的條件包括通過實施如下方法而用所述細菌接種胚細胞，所述方法包括在足以使得所述細菌結合或附著于所述胚細胞的條件下用細菌接觸胚細胞一段時間。
6.權利要求1到5中任一項的方法，其中足以使得細菌將核酸構建體引入到胚細胞的細胞內的條件包括通過實施如下方法而共培養胚細胞和細菌，所述方法包括在足以使得所述細菌將核酸構建體引入到胚細胞的細胞內的條件下維持胚細胞和細菌一段時間。
7.權利要求1到6中任一項的方法，其中足以使得細菌將核酸構建體引入到胚細胞的細胞內的條件包括在存在細菌氮源的情況下維持胚細胞和細菌。
8.權利要求7的方法，其中細菌氮源是植物或動物蛋白提取物的酶消化物或者是對植物或動物提取物進行部分水解產生的水溶性部分。
9.權利要求8的方法，其中細菌氮源來自大豆。
10.權利要求1到9中任一項的方法，還包括在用細菌接觸所述組織之前從胚細胞去除種皮和/或糊粉。
11.權利要求1的方法，其中禾本科植物細胞是小麥細胞或大麥細胞或稻細胞或玉米細胞。
12.權利要求11的方法，其中禾本科植物細胞是小麥細胞，且成熟小麥籽粒具有以下一個或多個特征
(i)存在檢測不到分裂的胚乳細胞；和/或
(ii)已經停止核內復制的胚乳細胞；和/或
(iii)具有低含水量胚乳的胚乳細胞。
13.權利要求12的方法，其中成熟小麥籽粒的齡期為開花期后至少30天。
14.權利要求11的方法，其中禾本科植物細胞是大麥細胞，且成熟小麥籽粒具有以下一個或多個特征
(i)存在檢測不到分裂的胚乳細胞；和/或
(ii)具有低含水量胚乳的胚乳細胞；和/或
(iii)粒含水量不超過約40％。
15.權利要求14的方法，其中成熟大麥籽粒的齡期為開花期后至少30天。
16.權利要求11的方法，其中禾本科植物細胞是稻細胞，且成熟小麥籽粒具有以下一個或多個特征
(i)圓錐花序或籽粒的顏色為黃色；和/或
(ii)具有低含水量胚乳的胚乳細胞。
17.權利要求16的方法，其中成熟稻籽粒的齡期為開花期后至少25天。
18.權利要求11的方法，其中禾本科植物細胞是玉米細胞，且成熟小麥籽粒具有以下一個或多個特征
(i)存在檢測不到分裂的胚乳細胞；和/或
(ii)在玉米籽粒或種子或粒內形成黑色細胞層；和/或
(iii)粒含水量不超過約35％。
19.權利要求18的方法，其中成熟玉米籽粒的齡期為開花期后至少35天。
20.權利要求1的方法，其中細菌是土壤桿菌(Agrobacterium)。
21.用于產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞的方法，所述方法包括
(i)從成熟小麥籽粒或成熟大麥籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒獲得胚細胞；
(ii)用包括核酸構建體的土壤桿菌在足以使得所述土壤桿菌結合或附著于所述胚細胞的條件下接觸胚細胞一段時間，所述核酸構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，其中在無需首先從所述胚細胞誘導愈傷組織形成的情況下實施所述接觸；和
(iii)在足以使得所述土壤桿菌將轉移核酸引入到一個或多個細胞內的條件下維持胚細胞和結合的土壤桿菌一段時間，
由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞。
22.用于產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞的方法，所述方法包括
(i)從成熟小麥籽粒或成熟大麥籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒獲得胚細胞；
(ii)從胚細胞去除種皮和/或糊粉；
(iii)用包括核酸構建體的土壤桿菌在足以使得所述土壤桿菌結合或附著于所述胚細胞的條件下接觸胚細胞一段時間，所述核酸構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，其中在無需首先從所述胚細胞誘導愈傷組織形成的情況下實施所述接觸；和
(iv)在足以使得所述土壤桿菌將轉移核酸引入到一個或多個細胞內的條件下維持胚細胞和結合的土壤桿菌一段時間，
由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞。
23.用于產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞的方法，所述方法包括
(i)從成熟小麥籽粒或成熟大麥籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒獲得胚細胞；
(ii)從胚細胞去除種皮和/或糊粉；
(iii)用包括核酸構建體的土壤桿菌在足以使得所述土壤桿菌結合或附著于所述胚細胞的條件下接觸胚細胞一段時間，所述核酸構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，其中在存在蛋白胨的情況下實施所述接觸，且其中在無需首先從所述胚細胞誘導愈傷組織形成的情況下實施所述接觸；和
(iv)在足以使得所述土壤桿菌將轉移核酸引入到一個或多個細胞內的條件下維持胚細胞和結合的土壤桿菌一段時間，其中在存在蛋白胨的情況下實施所述維持，
由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞。
24.通過權利要求1到23中任一項的方法產生的轉基因細胞。
25.用于在禾本科植物細胞內表達核酸的方法，所述方法包括
(i)產生包括與在小麥細胞中可操縱的啟動子可操縱連接的轉基因的轉基因禾本科植物細胞，所述轉基因小麥細胞是通過實施權利要求1到23中任一項的方法產生的；和
(ii)在足以使所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因細胞一段時間。
26.用于調控禾本科植物細胞中的基因表達的方法，所述方法包括
(i)產生包括能夠調控核酸表達的轉基因的轉基因禾本科植物細胞，所述轉基因細胞是通過實施權利要求1到23中任一項的方法產生的；和
(ii)在足以使核酸表達被調控的條件下維持所述轉基因細胞一段時間。
27.用于產生轉基因禾本科植物或小植物或植物部分的方法，所述方法包括
(i)通過實施權利要求1到23中任一項的方法產生轉基因禾本科植物細胞；
(ii)從(i)所產生的轉基因禾本科植物細胞再生出轉基因禾本科植物或小植物或植物部分，
由此產生轉基因植物或小植物或植物部分。
28.權利要求27的方法，其中再生禾本科植物包括在足以產生愈傷組織和/或去分化細胞和/或未分化細胞的條件下，用誘導愈傷組織形成和/或誘導轉基因細胞的去分化和/或誘導從轉基因細胞產生未分化細胞的化合物接觸轉基因禾本科植物細胞一段時間。
29.權利要求28的方法，其中誘導愈傷組織形成和/或誘導轉基因細胞的去分化和/或誘導從轉基因細胞產生未分化細胞的化合物選自由2，4-二氯苯氧乙酸、3，6-二氯-o-茴香酸、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸、塞苯隆及其組合所組成的組。
30.權利要求27到29中任一項的方法，還包括在足以產生苗的條件下用誘導苗形成的化合物接觸愈傷組織和/或去分化細胞和/或未分化細胞一段時間。
31.權利要求27到30中任一項的方法，還包括在足以啟動生根并產生小植物的條件下用誘導生根的化合物接觸愈傷組織和/或去分化細胞和/或未分化細胞一段時間。
32.權利要求30或31的方法，其中誘導苗形成的化合物或誘導生根的化合物選自由吲哚-3-乙酸、芐腺嘌呤、吲哚丁酸、玉米素、α-萘乙酸、6-芐氨基嘌呤、塞苯隆、激動素、2iP及其組合所組成的組。
33.權利要求30或31的方法，還包括在小植物能生長到成熟的條件下維持小植物一段時間。
34.用于產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的方法，所述方法包括
i)通過實施如下方法產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞，所述方法包括以下步驟
(a)從成熟小麥籽粒或成熟大麥籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒獲得胚細胞；和
(b)用包括核酸構建體的土壤桿菌在足以使得所述土壤桿菌將所述轉移核酸引入到一個或多個細胞內的條件下接觸所述胚細胞，所述核酸構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，其中在無需首先從所述胚細胞誘導愈傷組織形成的情況下實施所述接觸，由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞；和
(ii)通過實施如下方法從(i)中產生的轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞再生出小麥植物或大麥植物或稻植物或玉米植物，所述方法包括以下步驟
(a)在足以產生愈傷組織的條件下，用誘導愈傷組織形成的化合物接觸轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞一段時間；
(b)在足以產生苗的條件下，用誘導苗形成的化合物接觸愈傷組織一段時間；
(c)在足以啟動生根的條件下，用誘導生根的化合物接觸愈傷組織一段時間，由此產生小植物；和
(d)在足以產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的條件下，生長小植物一段時間。
35.用于產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的方法，所述方法包括
(i)通過實施如下方法產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞，所述方法包括以下步驟
(a)從成熟小麥籽粒或成熟大麥籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒獲得胚細胞；和
(b)從胚細胞去除種皮和/或糊粉；
(c)用包括核酸構建體的土壤桿菌在足以使得所述土壤桿菌結合或附著于所述細胞的條件下接觸所述胚細胞，所述核酸構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，其中在無需首先從所述胚細胞誘導愈傷組織形成的情況下實施所述接觸；
(d)在足以使得所述土壤桿菌將所述轉移核酸引入到一個或多個細胞內的條件下維持胚細胞和結合的土壤桿菌一段時間，由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞；和
(ii)通過實施如下方法從(i)中產生的轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞再生出小麥植物或大麥植物或稻植物或玉米植物，所述方法包括以下步驟
(a)在足以產生愈傷組織的條件下，用誘導愈傷組織形成的化合物接觸轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞一段時間；
(b)在足以產生苗的條件下，用誘導苗形成的化合物接觸愈傷組織一段時間；
c)在足以啟動生根的條件下，用誘導生根的化合物接觸愈傷組織一段時間，由此產生小植物；和
(d)在足以產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的條件下，生長小植物一段時間。
36.用于產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的方法，所述方法包括
(i)通過實施如下方法產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞，所述方法包括以下步驟
(a)從成熟小麥籽粒或成熟大麥籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒獲得胚細胞；和
(b)從胚細胞去除種皮和/或糊粉；
(c)用包括核酸構建體的土壤桿菌在足以使得所述土壤桿菌結合或附著于所述細胞的條件下接觸所述胚細胞，所述核酸構建體包括待引入到胚細胞內的轉移核酸，其中在存在蛋白胨的情況下實施所述接觸，且其中在無需首先從所述胚細胞誘導愈傷組織形成的情況下實施所述接觸；和
(d)在足以使得所述土壤桿菌將所述轉移核酸引入到一個或多個細胞內的條件下維持胚細胞和結合的土壤桿菌一段時間，其中在存在蛋白胨的情況下實施所述維持，由此產生轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞；和
(ii)通過實施如下方法從(i)中產生的轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞再生出小麥植物或大麥植物或稻植物或玉米植物，所述方法包括以下步驟
(a)在足以產生愈傷組織的條件下，用誘導愈傷組織形成的化合物接觸轉基因小麥細胞或轉基因大麥細胞或轉基因稻細胞或轉基因玉米細胞一段時間；
(b)在足以產生苗的條件下，用誘導苗形成的化合物接觸愈傷組織一段時間；
(c)在足以啟動生根的條件下，用誘導生根的化合物接觸愈傷組織一段時間，由此產生小植物；和
(d)在足以產生轉基因小麥植物或轉基因大麥植物或轉基因稻植物或轉基因玉米植物的條件下，生長小植物一段時間。
37.權利要求27到36中任一項的方法，還包括提供轉基因小麥植物。
38.權利要求27到37中任一項的方法產生的轉基因禾本科植物。
39.用于產生轉基因禾本科植物的轉基因子代的方法，所述方法包括
(i)通過實施權利要求27到37中任一項的方法產生轉基因禾本科植物；和
(ii)育種(i)中產生的轉基因禾本科植物，由此產生所述植物的子代。
40.權利要求39的方法，還包括獲得轉基因禾本科植物的轉基因子代。
41.權利要求39或40的方法，還包括選擇或鑒定轉基因禾本科植物的轉基因子代。
42.通過實施權利要求39到41中任一項的方法產生的轉基因禾本科植物的轉基因子代。
43.包括來自通過實施權利要求27到37中任一項的方法產生的轉基因禾本科植物或通過實施權利要求39到41中任一項的方法產生的子代的植物材料的產品，所述產品被標記以便標識出產品的性質。
44.用于育種轉基因禾本科植物的方法，所述方法包括
(i)通過實施權利要求27到37或39到41中任一項的方法而產生轉基因禾本科植物或轉基因禾本科植物的子代或轉基因禾本科植物的種子或轉基因禾本科植物的繁殖材料；和
(ii)提供育種用的所述植物、子代、種子或繁殖材料。
45.用于育種轉基因禾本科植物的方法，所述方法包括
(i)獲得通過實施權利要求27到37或39到41中任一項的方法而產生的轉基因禾本科植物或轉基因禾本科植物的子代；和
(ii)育種所述轉基因禾本科植物或子代。
46.用于在禾本科植物細胞中表達核酸的方法，所述方法包括
(i)通過實施權利要求27到37或39到41中任一項的方法產生轉基因禾本科植物或其子代，其中核酸構建體包括與在禾本科植物細胞內可操縱的啟動子可操縱連接的轉基因；和
(ii)在足以使所述轉基因表達的條件下維持所述轉基因植物一段時間。
47.權利要求46的方法，其中轉基因編碼與提高植物產量相關的蛋白。
48.權利要求47的方法，其中轉基因編碼一種蛋白，所述蛋白賦予或增強表達所述轉基因的小麥植物對小麥病原體的抗性。
49.權利要求48的方法，其中轉基因是小麥奇甜蛋白樣蛋白或小麥線條花葉病毒外殼蛋白。
50.權利要求47的方法，其中轉基因賦予表達所述轉基因的小麥植物耐旱性和/或耐干性和/或耐鹽性和/或耐寒性。
51.權利要求50的方法，其中轉基因是擬南芥DREB1A基因。
52.權利要求46的方法，其中轉基因編碼一種蛋白，所述蛋白提高來自表達所述轉基因的小麥植物的小麥產品的營養品質。
53.權利要求52的方法，其中轉基因是高分子量麥谷蛋白亞基1Ax1基因。
54.用于調控禾本科植物中的基因表達的方法，所述方法包括
(i)通過實施權利要求27到37或39到41中任一項的方法產生轉基因禾本科植物或其子代，其中核酸構建體包括能夠調控與在禾本科植物細胞內可操縱的啟動子可操縱連接的基因的表達的轉基因；和
(ii)在足以調控所述核酸表達的條件下維持所述轉基因植物一段時間。
55.權利要求54的方法，其中轉基因編碼短干擾RNA或微RNA。
56.權利要求54或55的方法，其中轉基因提高來自表達所述轉基因的小麥植物的小麥產品的營養品質。
57.權利要求56的方法，其中轉基因編碼阻止、抑制或減少小麥顆粒結合性淀粉合酶I基因的表達的抑制性RNA。
全文摘要
本發明提供產生轉基因禾本科植物細胞的方法，包括(i)從成熟禾本科籽粒獲得胚細胞；和(ii)用能夠轉化植物細胞的細菌接觸所述胚細胞，所述細菌包括待引入胚細胞內的轉移核酸，所述接觸的時間和條件足以使得所述細菌將所述轉移核酸引入一個或多個細胞內；由此產生轉基因禾本科植物細胞。本發明也提供經所述方法產生的轉基因禾本科植物細胞和/或轉基因禾本科植物。本發明也提供用于在轉基因禾本科植物細胞或轉基因禾本科植物中表達核酸的方法。
文檔編號A01H4/00GK101421402SQ200780008777
公開日2009年4月29日 申請日期2007年1月11日 優先權日2006年1月11日
發明者C·M·拉梅奇, G·斯潘根貝格, D·維什努達森 申請人:分子作物育種代理有限公司