關聯玉米對斐濟病毒屬的抗性的基因座的制作方法

專利名稱：關聯玉米對斐濟病毒屬的抗性的基因座的制作方法
技術領域：
本公開涉及可用于在植物中產生或增強斐濟病毒屬(Fijivirus)抗性的組合物和方法，尤其是對馬德里約柯托病毒(Mai de Rio Cuarto Virus)和/或玉米粗縮病毒(MaizeRough Dwarf Virus)的抗性。
背景技術：
由馬德里約柯托病毒(MRCV)所引起的疾病是阿根廷的主要的玉米疾病，其在嚴重爆發年份中占超過70%的產量損失(Rodriguez PE等人，(1998) Plant Dis.82:149-52)。該疾病是斐濟病毒屬血清組2的成員，所述血清組2包括了其它病毒，諸如玉米粗縮病毒、水稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus)和馬唐草矮化病毒(Uyeda I &Milne RG (1995) Semin.Virol.6:85-88)。MRCV 的主要媒介是科氏飛虱(Delphacodeskuscheli),但是其它飛風(Delphacodes)物種(諸如赫氏飛風(D.haywardi)和虎紋飛風(D.tigrinus))和黑邊黃脊飛風(Toya propinqua)據顯示也攜帶該病毒。該病毒并不表現出通過種子的子代傳播。Dist6fano 等人，Arch.Virol.147:1699-1709 (2002)分析了 MRCV序列并提出其為與MRDV (玉米粗縮病毒)相關的新型斐濟病毒。MRDV可見于多個歐洲國家(例如，捷克共和國、法國、意大利、挪威、西班牙、瑞典)和中國，而MRCV還在烏拉圭(OrnaghiJ.A., Beviacqua J.E., Aguirrezabala D.A., March G.J.和 Lenard0n S.L.1999.Detection of Mal de Rio Cuarto virus in Uruguay.Fitopatologia Brasileira24:471)被檢測到。MRCV感染導致了異常的玉米發育并且顯著降低了作物產量。易感表型包括矮化、節間縮短、多穗且散粒(multiple ears with scattered grain)、無花藥的變形雄穗、葉背側出現小耳突、減少的根部、截短且減少的葉。植物癥狀取決于該植物的生育期、植物基因型和環境(Lenard0n 等人，“Virus del Mal de Rio Cuarto en maiz，，，in Proyecto deInvestigaciones en Fitovirologia (Lenard0n 編輯)，2:10 (1999))。大多數嚴重癥狀發生于在胚芽鞘一初葉期受到感染時。在1996-1997年的嚴重MRCV爆發中，在阿根廷有超過300，000公頃的玉米受到影響，導致了總計約$1.20億的損失。科氏飛虱在2006年的增多種群顯然導致了阿根廷玉米植物中的病毒疾病的復發，這極大地影響了 2007年度的收成。易感基因型在流行地區(科爾多瓦省)受到MRCV的嚴重影響并在其它玉米產區受到中度影響。分子遺傳標記 的開發輔助了對玉米的農業重要性狀的標測和甄選，并且已經鑒定出了玉米中對馬德里約柯托病毒抗性的QTL。玉米I號和8號染色體上的微衛星標記據發現關聯于馬德里約柯托病抗性的QTL (DiRenzo等人，(2004) J.AgriculturalSciencel42:289-295)并且在2號染色體上鑒定出產生玉米對斐濟病毒抗性的另一種主要QTL (W02009/058335)。此外，在玉米中產生馬德里約柯托病毒抗性的QTL被標測于I號染色體的短臂和長臂以及4號、8號和10號染色體(Kreff等人，(2006) Journal of Basicand Applied Geneticsl7:41-50)。通過使用與MRCV感染抗性相關聯的分子標記進行選擇具有下列優點:使得至少一些選擇僅基于子代的遺傳組合物進行。此外，MRCV感染抗性在植物生命周期非常早的階段甚至早至種子期就可確定。使用與所述抗性性狀相關聯的分子標記可獲得提高的選擇率，這就意味著MRCV感染抗性的植物育種可更迅速地開展，從而在相對較短的時間內生成商業上可接受的抗性植物。因此，希望提供用于鑒定和選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物的組合物和方法。可在育種程序中使用這些植物，以便產生具有MRCV感染抗性的高產雜交種。

發明內容
本發明提供了鑒定和選擇對馬德里約柯托病毒(MRCV)或相關斐濟病毒屬所導致的疾病具有增強抗性的玉米植物的組合物和方法。在一個實施例中，提供了鑒定和/或選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法。在這些方法中，檢測了至少一種標記等位基因的存在情況并且鑒定和/或選擇了具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物。標記等位基因可包括與下列連鎖并關聯的任何標記等位基因:由下列組成的單倍型:相對于SEQ ID NO: 44，在位置324處的“G”、在位置345處的“C”、在位置504處的“G”和在位置565處的“A” ；由下列組成的單倍型:相對于SEQ IDN0:42，在位置85處的“A”、在位置344處的“C”和在位置355處的“A”;或由下列組成的單倍型:相對于SEQ ID N0:43，在位置58處的“G”、在位置61處的插入、在位置70處的“C”、在位置85處的“C”、在位置90處的“T”、在位置194處的“G”和在位置287處的“A”。在其它實施例中，所述標記等位基因可在單次減數分裂圖上以30cM、25、20、15、
10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2 或 0.1cM 連鎖:由下列組成的單倍型:相對于SEQ ID N0:44，在位置324處的“G”、在位置345處的“C”、在位置504處的“G”和在位置565處的“A”；由下列組成的單倍型:相對于SEQ ID NO: 42，在位置85處的“A”、在位置344處的“C”和在位置355處的“A” ；或由下列組成的單倍型:相對于SEQ IDNO:43，在位置58處的“G”、在位置61處的插入、在位置70處的“C”、在位置85處的“C”、在位置90處的“T”、在位置194處的“G”和在位置287處的“A”。在另一個實施例中，提供了鑒定和/或選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，其中檢測了單倍型并且鑒定和/或選擇了具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物。所述單倍型可包括:包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:44，在位置324處的“G”、在位置345處的“C”、在位置504處的“G”和在位置565處的“A” ;包含下列的單倍型:相對于SEQID N0:42，在位置85處的“A”、 在位置344處的“C”和在位置355處的“A”;或包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:43，在位置58處的“G”、在位置61處的插入、在位置70處的“C”、在位置85處的“C”、在位置90處的“T”、在位置194處的“G”和在位置287處的“A”;或上述單倍型的任何組合。在另一個實施例中，通過檢測與玉米植物種質中的增強的MRCV感染抗性相關聯的標記等位基因或單倍型來鑒定和/或選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法。所述單倍型可在一個或多個標記基因座處包含等位基因，其中所述一個或多個標記基因座可見于4號染色體上的區間，所述區間包含并側接:1.PHM1718 和 PHM8008 ;以及i1.PHM669 和 PHM8008。所述單倍型還可選自:包含下列的單倍型:相對于SEQ ID NO: 44，在位置324處的“G”、在位置345處的“C”、在位置504處的“G”和在位置565處的“A”;包含下列的單倍型:相對于SEQ ID NO: 42，在位置85處的“A”、在位置344處的“C”和在位置355處的“A”;包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:43，在位置58處的“G”、在位置61處的插入、在位置70處的“C”、在位置85處的“C”、在位置90處的“T”、在位置194處的“G”和在位置287處的“A” ；或上述單倍型的任何組合。在另一個實施例中，獲得了鑒定和/或選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，其中在基因組中包含下列單倍型的玉米植物可與其它玉米植物雜交:包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:44，在位置324處的“G”、在位置345處的“C”、在位置504處的“G”和在位置565處的“A”;包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:42，在位置85的“A”、在位置344處的“C”和在位置355處的“A” ；包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:43，在位置58處的“G”、在位置61處的插入、在位置70處的“C”、在位置85處的“C”、在位置90處的“T”、在位置194處的“G”和在位置287處的“A”;或所述單倍型的任何組合；并且可針對所述一種或多種單倍型的存在或缺乏評價子代，由此而鑒定和/或選擇了具有增強的MRCV感染抗性的子代植物。在另一個實施例中，提供了通過檢測玉米植物基因組中的標記基因座來鑒定和/或選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述檢測使用標記基因座的序列、標記基因座的部分序列、或標記基因座的互補序列或其部分序列作為標記探針。標記探針在嚴格條件下與介于下列序列之間并包括下列序列的鄰接DNA雜交:SEQ ID N0:71或基于Clustal V比對方法與SEQ ID NO: 71具有95%相同的核苷酸序列、以及SEQ ID NO: 50或基于Clustal V比對方法與SEQ ID N0:50具有95%相同的核苷酸序列，并且所述標記基因座包含至少一個關聯所述增強的MRCV感染抗性的等位基因。在另一個實施例中，提供了通過檢測玉米植物種質中至少一個關聯增強的抗性的標記等位基因來鑒定和/或選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法。所述標記基因座能夠選自下列標記基因座中的任一個:PHM15741、PHM12093、PHM15051、PHM8091、PHM6248, PHM9452, PHM12615, PHM5713, PHM692U PHM1683 和 PHM17281 ;以及與這些標記連鎖的任何其它標記。標記基因座還可見于5號染色體上的任何下列區間，所述區間包含并側接:i.PHMl2615 和 PHM9452 ；ii.PHM12615 和 PHM17281 ；iii.PHM12615 和 PHM1683 ;以及iv.PHM15741 和 PHM9452。所述標記基因座包含至少一個關聯增強的MRCV感染抗性的等位基因。在另一個實施例中，提供了通過檢測玉米植物種質中關聯增強的MRCV感染抗性的單倍型來鑒定和/或選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法。所述單倍型在一個或多個標記基因座處包含等位基因，其中所述一個或多個標記基因座可見于5號染色體上的區間，所述區間包含并側接:1.PHMl2615 和 PHM9452 ；i1.PHM12615 和 PHM17281 ；ii1.PHM12615 和 PHM1683 ;以及·iv.PHM15741 和 PHM9452。在另一個實施例中，提供了鑒定和/或選擇具有增強的MRCV感染抗性的植物的方法。在一個方面，獲得具有標記基因座的至少一個等位基因的第一玉米植物，其中所述等位基因關聯增強的抗性。所述標記基因座可見于5號染色體上的區間，所述區間包含并側接:1.PHM12615 和 PHM9452 ;i1.PHM12615 和 PHM17281 ；ii1.PHM12615 和 PHM1683 ;以及iv.PHM15741 和 PHM9452。然后可將第一玉米植物與第二玉米植物雜交，并且針對所述第一玉米植物的等位基因可評價雜交所得子代植物。可選擇具有第一玉米植物的等位基因的子代植物作為具有增強的MRCV感染抗性的植物。此外，通過上述方法鑒定或選擇的玉米植物是受關注的，通過上述方法鑒定或選擇的玉米植物的子代也是受關注的。附圖和序列表說明根據下列的詳細描述和附圖以及序列表，可以更全面地理解本發明，下列的詳細描述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三個字母表不氨基酸，如 Nucleic Acids Researchl3:3021-3030 (1985)和 BiochemicalJournal219 (N0.2):345-373 (1984)所描述的IUPAC-1UBMB標準中所規定，它們以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數據的符號和格式遵循如37C.F.R.§ 1.822所示的規定。


圖1示出了熱帶亞群內4號染色體上的顯著性標記性狀關聯的峰。這些結果獲自實例2中描述的對475個品系組的結構關聯分析。圖2示出了熱帶亞群內5號染色體上的顯著性標記性狀關聯的峰。這些結果獲自實例2中描述的對475個品系組的結構關聯分析。圖3示出了阿根廷自交系(Argentinean inbred)組的5號染色體上的顯著性標記性狀關聯的峰(實例3)。圖4示出了描述PHFHHxPHBNB種群中4號染色體上的MRCV抗性的QTL的圖。圖5示出了描述PHFHHxPHBNB種群中5號染色體上的MRCV抗性的QTL的圖。圖6示出了描述來源于雙親雜交PHFNHxPHKVl的F3種群中5號染色體上的MRCV抗性的QTL的圖。SEQ ID NO:1 是 PHM1718 外部正向引物。SEQ ID NO:2 是 PHM1718 內部正向引物。SEQ ID NO:3 是 PHM1718 內部反向引物。
SEQ ID N0:4 是 PHM1718 外部反向引物。SEQ ID NO: 5 是 PHM669 外部正向引物。SEQ ID N0:6 是 PHM669 內部正向引物。SEQ ID N0:7 是 PHM669 內部反向引物。SEQ ID N0:8 是 PHM669 外部反向引物。SEQ ID NO:9 是 PHMl 1786 外部正向引物。
·
SEQ ID NO: 10 是 PHM11786 內部正向引物。SEQ ID NO: 11 是 PHM11786 內部反向引物。SEQ ID NO: 12 是 PHM11786 外部反向引物。SEQ ID NO: 13 是 PHM8008 外部正向引物。SEQ ID NO: 14 是 PHM8008 內部正向引物。SEQ ID NO: 15 是 PHM8008 內部反向引物。SEQ ID勵:16是卩腿8008外部反向引物。SEQ ID N0:17 是 PHM15741 外部正向引物。SEQ ID NO: 18 是 PHM15741 內部正向引物。SEQ ID NO: 19 是 PHM15741 內部反向引物。SEQ ID NO: 20 是 PHM15741 外部反向引物。SEQ ID NO:21 是 PHM12093 外部正向引物。SEQ ID NO: 22 是 PHM12093 內部正向引物。SEQ ID NO: 23 是 PHM12093 內部反向引物。SEQ ID NO: 24 是 PHM12093 外部反向引物。SEQ ID NO:25 是 PHM15051 外部正向引物。SEQ ID NO:26 是 PHMl5051 內部正向引物。SEQ ID NO:27 是 PHMl5051 內部反向引物。SEQ ID NO:28 是 PHM15051 外部反向引物。SEQ ID NO:29 是 PHM8091 外部正向引物。SEQ ID NO:30 是 PHM8091 內部正向引物。SEQ ID NO:31 是 PHM8091 內部反向引物。SEQ ID NO:32 是 PHM8091 外部反向引物。SEQ ID NO: 33 是 PHM6248 外部正向引物。SEQ ID NO:34 是 PHM6248 內部正向引物。SEQ ID NO:35 是 PHM6248 內部反向引物。SEQ ID N0:36 是 PHM6248 外部反向引物。SEQ ID N0:37 是 PHM9452 外部正向引物。SEQ ID NO:38 是 PHM9452 內部正向引物。SEQ ID NO:39 是 PHM9452 內部反向引物。SEQ ID N0:40 是 PHM9452 外部反向引物。SEQ ID NO:41 是 PHM1718 參考序列。SEQ ID NO:42 是 PHM669 參考序列。
SEQID NO:43 是 PHMl 1786 參考序列。SEQID NO:44 是 PHM8008 參考序列。SEQID NO:45 是 PHM15741 參考序列。SEQID NO:46 是 PHM12093 參考序列。SEQID N0:47 是 PHM15051 參考序列。SEQID NO:48 是 PHM8091 參考序列。SEQID NO:49 是 PHM6248 參考序列。SEQID NO: 50 是 PHM9452 參考序列。SEQID NO:51 是 PHM12615 外部正向引物。SEQID NO:52 是 PHM12615 內部正向引物。SEQID NO:53 是 PHM12615 內部反向引物。SEQID NO:54 是 PHM12615 外部反向引物。SEQID NO:55 是 PHM5713 外部正向引物。SEQID N0:56 是 PHM5713 內部正向引物。SEQID N0:57 是 PHM5713 內部反向引物。SEQID N0:58 是 PHM5713 外部反向引物。SEQID N0:59 是 PHM6921 外部正向引物。SEQID N0:60 是 PHM6921 內部正向引物。SEQID N0:61 是 PHM6921 內部反向引物。SEQID N0:62 是 PHM6921 外部反向引物。SEQID N0:63 是 PHM1683 外部正向引物。SEQID N0:64 是 PHM1683 內部正向引物。SEQID N0:65 是 PHM1683 內部反向引物。SEQID N0:66 是 PHM1683 外部反向引物。SEQID N0:67 是 PHM17281 外部正向引物。SEQID NO:68 是 PHMl7281 內部正向引物。SEQID NO:69 是 PHMl7281 內部反向引物。SEQID N0:70 是 PHM17281 外部反向引物。SEQID N0:71 是 PHM12615 參考序列。SEQID N0:72 是 PHM5713 參考序列。SEQID N0:73 是 PHM6921 參考序列。SEQID N0:74 是 PHM1683 參考序列。SEQID N0:75 是 PHM17281 參考序列。
具體實施例方式
通過使用標記輔助選擇來鑒定和/或選擇具有增強的馬德里約柯托病毒(MRCV)抗性或對由該病毒導致的疾病或感染的抗性的玉米植物可提供有效并且環保的方法以用于克服這一疾病所導致的損失。本發明提供玉米標記基因座，所述玉米標記基因座顯示了統計上顯著的MRCV共分離。對這些基因座或另外的連鎖基因座的檢測可在標記輔助的玉米育種程序中使用來產生抗性植物，或對于MRCV或相關斐濟病毒或由MRCV或相關斐濟病毒導致的感染或疾病具有增強抗性的植物。提供下列定義以利于理解本發明。在詳述本發明之前，應當了解本發明不受特定實施例的限制，它當然能夠改變。也應當了解本文所用的術語僅是為了描述特定實施例，而不旨在進行限制。當在本說明書和所附權利要求中使用時，除非內容清楚地表明，單數和單數形式的術語包括復數指代。因此，例如術語“一個植物”也包括多個植物；也取決于上下文，使用的術語“植物”也可包括該植物遺傳相似或相同的子代；使·用的術語“核酸”實際上任選地包括該核酸分子的多個拷貝；同樣地，術語“探針”任選地(并且通常)包括許多相似或相同的探針分子。除非另外說明，核酸是以5’到3’方向從左往右寫。說明書中所述的數字范圍包括限定范圍的端值并且包括在限定范圍內的各個整數或任何非整數的分數。除非另外指明，本文所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員一般理解相同的含義。雖然與本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本發明的測試實踐，但本文描述了優選的材料和方法。在本發明的描述和權利要求中，將根據下文列陳述的定義使用下列術語。術語“等位基因”指在特定基因座處發生的兩個或更多個不同核苷酸序列的其中一個。“等位基因頻率”指等位基因存在于個體、品系、或一組品系中的基因座上的頻率(比例或百分比)。例如，就等位基因“A”而言，基因型“AA”、“Aa”、或“aa”的二倍體個體分別具有1.0、0.5、或0.0的等位基因頻率。人們能夠通過平均化來自品系的個體樣品的等位基因頻率來估計該品系中的等位基因頻率。同樣地，人們能夠通過平均化構成種群的品系的等位基因頻率來計算該種群品系中的等位基因頻率。就一組限定數目的個體或品系而言，可將所有等位基因頻率表示為包含等位基因的個體或品系(或任何其它指定組)的計數。“擴增子”是被擴增的核酸，例如使用任何可用的擴增方法(例如PCR、LCR、轉錄等)通過擴增模板核酸制備的核酸。在核酸擴增的情況下術語“擴增”是其中產生附加拷貝的選擇核酸(或其轉錄形式)的任何過程。一般的擴增方法包括基于多種聚合酶的復制方法，包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶介導的方法如連接酶鏈反應(LCR)、以及基于RNA聚合酶的擴增(例如通過轉錄)方法。術語“裝配”應用于BAC以及它們聚集以形成鄰接DNA片段的傾向。BAC基于序列比對“裝配”成重疊群，如果BAC進行測序，或經由它的BAC指紋與其它BAC指紋的比對“裝配”成重疊群。可使用因特網上公開可用的Maize Genome Browser找到公開的裝配。當等位基因是影響性狀表達的DNA序列或等位基因的一部分或與之連鎖時，所述等位基因“關聯”所述性狀。所述等位基因的存在是該性狀將如何被表達的指征。“BAC”或細菌人工染色體是來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的天然存在的F因子的克隆載體，其本身是可作為環狀質粒存在或可整合進入細菌染色體的DNA元件。BAC能夠接受DNA序列的較大插入序列。在玉米中，各自包含來自玉米自交系B73的玉米基因組DNA的較大插入序列的大量BAC已經裝配成為重疊群(重疊的鄰接基因片段，或“鄰接DNA”)，并且這一裝配可公開獲得于因特網。
BAC指紋是分析多個DNA樣品之間的相似度的方法，其基于特定限制性位點的存在或缺乏而進行(限制性位點是由切割或“限制”DNA的酶所識別的核苷酸序列)而進行。使用相同的限制性酶組消化兩種或更多種BAC樣品并且比較所形成的片段的大小，這通常使用凝膠分離進行。“回交”指其中雜交子代反復與其中一個親本回交的過程。在回交方案中，“供體”親本是指具有用于進行摻入的所需基因、基因座或具體表型的親本植物。“受體”親本(使用一次或多次)或“輪回”親本(使用兩次或多次)指將基因或基因座滲入其中的親本植物。例如參見 Ragot, M.等人(1995) Marker-assisted backcrossing:a practical example,in Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques,第 72卷，第 45-56 頁，以及 Openshaw 等人，(1994) Marker-assisted Selection in BackcrossBreeding, Analysis of Molecular Marker Data,第 41-43 頁。初始雜交產生 Fl 代；然后術語“BC1”指輪回親本的第二次使用，“BC2”指輪回親本的第三次使用等等。厘摩(“CM”)是重組頻率的量度單位。IcM等于經過單代雜交在一個基因座上的標記將與在第二基因座上的標記分離的1%的概率。如本文所用，術語“染色體區間”指位于植物單個染色體上的基因組DNA的鄰接線性區域。位于單染色體間隔上的遺傳因子或基因是物理上連鎖的。不特別限定染色體區間的大小。在一些方面，位于單個染色體區間內的基因元件在遺傳上連鎖，遺傳重組距離通常為例如小于或等于20cM，或小于或等于10cM。即，位于單個染色體區間內的兩個基因元件以小于或等于20%或10%的頻率進行重組。“染色體”是包含大量基因的單條螺旋DNA，所述基因在細胞分裂期間作為整體發揮作用并移動，并且因此可稱為是連鎖的。“染色體”也可稱為“連鎖群”。在本專利申請中，短語“緊密連鎖”指兩個連鎖基因座間重組的發生頻率為等于或小于約10% (即在基因圖譜上的分離頻率不超過10cM)。換句話說，緊密連鎖的基因座至少90%的情況下共分離。當標記基因座顯示與期望性狀(例如病原體抗性)共分離(連鎖)的顯著概率時，它們在本發明中尤其有用。緊密連鎖的基因座如標記基因座和第二基因座可顯示10%或更低，優選約9%或更低，更優選約8%或更低，更優選約7%或更低，更優選約6%或更低，更優選約5%或更低,更優選約4%或更低,更優選約3%或更低,更優選約2%或更低的基因座內重組頻率。在高度優選的實施例中，關聯基因座顯示約1%或更低的重組頻率，例如約0.75%或更低，更優選約0.5%或更低，更優選約0.25%或更低的重組頻率。位于相同染色體上，并且它們間的距離使得兩個基因座間的重組發生頻率小于10% (例如約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%,0.5%、0.25%、或更低)的兩個基因座也稱為彼此“接近”。在某些情況下，兩個不同標記能夠具有相同的基因圖譜坐標。在那種情況下，兩個標記彼此足夠接近使得它們之間的重組發生頻率低至無法檢測。術語“互補序列”指與給定核苷酸序列互補的核苷酸序列，即所述序列根據沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對原則而相關聯。術語“鄰接DNA”指未中斷的基因組DNA片段，其由部分重疊的片段或重疊群表示。當涉及兩個遺傳因子 間的關系時，例如有助于抗性的遺傳因子和鄰近的標記，“相弓I”相連鎖指示下述狀態:其中在抗性基因座上的“有利”等位基因與相應連鎖的標記基因座的“有利”等位基因物理上關聯在相同染色體鏈上。在相引相中，兩個有利等位基因被繼承了該染色體鏈的子代一起繼承。術語“受到雜交”或“雜交”是指有性雜交，并且涉及兩組單倍體配子通過授粉進行的融合，從而產生二倍體子代(例如，細胞、種子或植株)。該術語包括一株植物被另一株植物授粉和自交(或自花授粉，例如當花粉和胚珠來自相同植株時)。本文稱為“二倍體”的植物具有兩組染色體(基因組)。短語“由馬德里約柯托病毒所導致的疾病”或“由MRCV所導致的疾病”是指由MRCV或相關斐濟病毒對植物的感染所導致的植物疾病。本文稱為“雙單倍體”的植物通過倍增單倍體染色體組進行開發(S卩，正常染色體數目的一半)。雙單倍體植物具有兩組相同的染色體，并且認為全部基因座是純合的。“優良品系”是源自育種并選擇優異農學性能的任何品系。玉米植物中對MRCV或由MRCV所導致的感染或疾病的“增強的抗性”指示在引入該疾病的誘發劑的情況下該玉米植物在產量和/或存活能力或其它相關農學指標上較少受影響。抗性是一個相對定義，指示被感染的植物比另一株同樣處理的、更易感的植物玉米產量更高。即，與易感玉米植物相比，在抗性玉米植物中病害引起的玉米存活率和/或產量減少的程度較低。“外來玉米品種”或“外來玉米種質”是來源于不屬于可利用優良玉米品系或品種的種質的玉米的品種或種質。在雜交發生在兩個玉米植株或品種的種質之間的情況下，夕卜來種質的子代不與它雜交的優良種質密切相關。最常見的是外來種質不來源于任何已知的玉米優良品系，而是選擇將新遺傳因子(通常新等位基因)導入育種程序。“有利等位基因”是在特定基因座的等位基因，它賦予或有助于農學上所期望的表型，例如MRCV抗性，并允許對具有農學上所期望表型的植株的鑒定。標記的有利等位基因是與有利表型共分離的標記等位基因。“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文所公開的方法，片段可用作雜交探針或PCR引物。“基因圖譜”是對給定物種中一個或多個染色體(或連鎖群)上的基因座間的基因連鎖關系的描述，一般以圖表或表格形式描述。對于各個基因圖譜，基因座之間的距離通過在種群中它們的等位基因在一起出現的頻繁程度(它們的重組頻率)而測量。可使用DNA或蛋白質標記或可觀測的表型檢測等位基因。基因圖譜是作圖的種群、使用的標記的類型、以及不同種群間各個標記的多態性潛力的產物。一個基因圖譜與另一個基因圖譜在基因座之間的遺傳距離可以不同。然而，使用共同標記能夠將一個圖譜與另一個圖譜的信息關聯。本領域的普通技術人員可使用共同標記位點來鑒定在各個個體基因圖譜上的標記位點和受關注的其它基因座。盡管由于，例如，在不同種群中檢測替代性的復式基因座的標記、用于將標記定序的統計方法中的差異、新型突變或實驗室誤差而在標記順序上經常存在細微變化，但是基因座的順序在圖譜間不應變化。“基因圖譜位置”是在相同連鎖群上，相對于圍繞的遺傳標記在基因圖譜上的位置，其中能夠在給定種群中發現指定標記。“基因作圖”是限定基因座的連鎖關系的方法，該方法通過使用遺傳標記、標記的種群分離、以及重組頻率 的標準遺傳原則進行。“遺傳標記”是種群中的多態核酸，并且其中可通過一種或多種分析方法檢測并區分出它們的等位基因，例如RFLP、AFLP、同功酶、SNP、SSR等。該術語也指與基因組序列互補的核酸序列，如用作探針的核酸。對應于種群成員之間的遺傳多態性的標記能夠通過本領域已建立的方法進行檢測。這些方法包括例如基于PCR的序列特異性擴增方法、限制性片段長度多態性檢測(RFLP)、同功酶標記檢測、通過等位基因特異性雜交(ASH)進行的多核苷酸多態性檢測、植物基因組的擴增可變序列檢測、自主序列復制檢測、簡單重復序列檢測(SSR)、單核苷酸多態性檢測(SNP )、或擴增片段長度多態性檢測(AFLP )。已經建立的方法也已知用于檢測表達序列標簽(EST)和來源于EST序列的SSR標記以及隨機擴增的多態性 DNA (RAPD)。“遺傳重組頻率”是兩個基因座之間的交換事件(重組)的頻率。在標記和/或減數分裂后性狀的分離后可觀察到重組頻率。“基因組”指總DNA或整套基因，由染色體或染色體組攜帶。術語“基因型”是個體(或個體組)在一個或多個基因座上的基因組成。基因型由一個或多個已知基因座的等位基因限定，個體已經從其親本中繼承了所述基因座。術語基因型可被用于指個體在單個基因座·上的基因組成，在多個基因座上的基因組成，或更一般的，術語基因型可被用于指個體在其基因組中的所有基因的基因組成。“種質”是指遺傳物質，其屬于或來自于個體(例如，植株)、個體的組(例如，植物品系、品種或家族)或來自品系、品種或培養物的克隆，或某一物種或多個物種的全部個體(例如，玉米種質集合(maize germplasm collection)或 Andean 種質集合(Andean germplasmcollection))。種質可為生物或細胞的部分，或可從生物或細胞中分離得到。種質通常提供遺傳物質與特異性分子構成，該分子構成提供生物或細胞培養物的一些或全部遺傳性狀的物理基礎。如本文所用，種質包括可從中生長出新植物的細胞、種子或組織，或植物部分如葉、莖、花粉、或細胞，它們能夠被培養成整個植株。稱為“單倍體”的植物具有一組染色體(基因組)。“單倍型”是個體在多個基因座上的基因型，即等位基因組合。單倍型描述的基因座通常是物理上和遺傳上連鎖的，即在相同染色體片段上。術語“單倍型”可指位于特定基因座的等位基因或指沿染色體片段位于多個基因座上的等位基因。術語“異質”用于指明一組內的個體在一個或多個特定基因座上基因型不同。“雜種優勢群”包含一組基因型，它們當與來自不同雜種優勢群的基因型雜交時表現良好(Hallauer 等人(1998) Corn breeding,第 463-564 頁，G.F.Sprague 和 J.ff.Dudley(編輯),Corn and corn improvement中)。將自交系歸類為雜種優勢群,并且將其進一步細分為雜種優勢群內的家族，所述分類基于若干個標準如家譜、基于分子標記的關聯、以及雜交體組合的性能(Smith等人(1990)，Theor.Appl.Gen.80:833_840)。美國兩個最廣泛使用的雜種優勢群稱為“愛荷華剛性莖桿合成群(1wa Stiff Stalk Synthetic)”(本文中也稱為“剛性莖桿”)和“Lancaster”或“Lancaster Sure Crop”(有時稱為NSS或非剛性莖桿)。假如一種以上的等位基因類型存在于給定基因座上(例如二倍體個體具有兩個不同等位基因中的每一個的一個拷貝)，則該個體是“雜合的”。術語“同質”指一組成員在一個或多個特定基因座上具有相同基因型。假如個體在等位基因僅有一種類型的等位基因(例如二倍體個體在兩個同源染色體中的每一個的基因座上具有一拷貝的相同等位基因)，則該個體是“純合的”。術語“雜交體”指至少兩個基因相異的親本間雜交獲得的子代。“雜交”或“核酸雜交”指互補RNA和DNA鏈配對以及互補DNA單鏈配對。術語“雜交”指核酸鏈的互補區域之間形成堿基對。“IBM基因圖譜”可指任何下列圖譜:IBM、IBM2、IBM2鄰接、IBM2 FPC0507、IBM22004 鄰接、IBM2 2005 鄰接、IBM2 2005 鄰接框、IBM2 2008 鄰接、IBM2 2008 鄰接框、或maizeGDB網站的最新版本。IBM基因圖譜基于B73 XMol7種群，其中來自初始雜交的子代在構建重組自交系用于作圖前隨機交配產生多代。較新的版本反映了遺傳的或BAC作圖的基因座的添加，以及由于從其它遺傳圖譜或物理圖譜、經過清理的數據或新算法的使用獲得的信息的整合而提高的圖譜精度。術語“自交”指已經進行育種以獲得遺傳同質性的品系。術語“插入缺失”是指插入或缺失，其中可指一個品系相對于第二品系具有插入的核苷酸或DNA片段，或可指所述第二品系相對所述第一品系具有缺失的核苷酸或DNA片段。術語“滲入”指基因座的期望等位基因從一種遺傳背景傳遞到另一種遺傳背景的現象。例如在特定基因座的期望等位基因通過滲入、經由相同物種的兩個親本間的有性雜交可被傳遞到至少一個子代，其中至少一個親本在其基因組中具有期望的等位基因。作為另外一種選擇，例如等位基因的傳遞能夠通過兩個供體基因組之間的重組而發生，例如在融合原生質體中，其中至少其中一個供體原生質體在其基因組中具有期望的等位基因。所期望的等位基因可以，例如，根據關聯于表型的標記在QTL、轉基因等等中加以檢測。在任何情況下，能夠將包含期望等位基因的子代與具有期望遺傳背景的品系反復回交并選擇期望的等位基因以產生固定在選擇遺傳背景中的等位基因。當重復“基因滲入”過程兩次或更多次時，該過程常被稱為“回交”。 “品系”或“品種”是一組具有相同親本的個體，它們一般是某種程度的自交體，并且一般在大多數基因座是純合的和同質的(同基因的或接近同基因的)。“亞系”指子代的自交體亞群，它們與相同祖先來源的其它相似自交體亞群遺傳上不同。如本文所用，術語“連鎖”用于描述一種標記基因座與另一種標記基因座或其它一些基因座的相關聯程度。分子標記和影響表型的基因座之間的連鎖關系用“概率”或“調整概率”表示。連鎖可以用期望的限度或范圍表達。例如，在一些實施例中，當任何標記與任何其它標記在單次減數分裂圖(基于已經進行一輪減數分裂的種群(例如，F2)的基因圖譜；由多次減數分裂組成的IBM2譜圖)上間隔低于50、40、30、25、20或15個作圖單位(或cM)時，所述標記是連鎖的(基因上或物理上)。在一些方面，限定加括號的連鎖范圍是有利的，例如介于10和20cM之間，介于10和30cM之間，或介于10和40cM之間。標記與第二基因座的連鎖越緊密，標記對第二基因座的指示效果越好。因此，“緊密連鎖的基因座”如標記基因座和第二基因座顯示10%或更低，優選約9%或更低，更優選約8%或更低，更優選約7%或更低，更優選約6%或更低，更優選約5%或更低，更優選約4%或更低，更優選約3%或更低，更優選約2%或更低的基因座 內重組頻率。在高度優選的實施例中，關聯基因座顯示約1%或更低的重組頻率，例如約0.75%或更低，更優選約0.5%或更低，更優選約0.25%或更低的重組頻率。位于相同染色體上，并且它們間的距離使得兩個基因座間的重組發生頻率小于10% (例如約 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%,0.5%、0.25%、或更低)的兩個基因座也稱為相互“鄰近”。因為IcM是顯示出1%的重組頻率的兩個標記之間的距離，因此任何標記與鄰近的任何其它標記緊密連鎖(基因上和物理上)，例如等于或小于IOcM的距離。在相同染色體上的兩個緊密連鎖的標記可相互定位為9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25cM或更近。術語“連鎖不平衡”指基因座或性狀(或兩者都有)非隨機地分離。在任一情況下，連鎖不平衡意味著相關的基因座沿著一段染色體在物理上足夠接近，以便它們以高于隨機(即非隨機)的頻率一起分離。顯示連鎖不平衡的標記被認為是連鎖的。連鎖基因座在超過50%的情況下共分離，例如約51%至約100%的情況。換句話說，共分離的兩個標記具有小于50% (并且根據定義，在相同連鎖群上分離距離小于50cM)的重組頻率。如本文所用，連鎖可存在于兩個標記或標記和影響表型的基因座之間。標記基因座可“關聯”(連鎖)性狀。標記基因座和影響表型性狀的基因座的連鎖程度可以根據，例如，該分子標記與所述表型共分離的統計概率(例如，F統計或LOD評分)加以測量。連鎖不平衡最常見地用量度r2測量，它使用Hill，ff.G.和Robertson，A, Theor.Appl.Genet.38:226-231 (1968)所描述的公式加以計算。當r2=l時，兩個標記基因座間存在完全的LD，意味著所述標記還未進行重組分離并且具有相同的等位基因頻率。所述r2值應依賴于所使用的種群。r2值大于1/3顯示了用于作圖的足夠強的LD (Ardlie等人，Nature Reviews Genetics3:299-309 (2002))。因此，當成對標記基因座間的r2值大于或等于0.33,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、或1.0時，等位基因處于連鎖不平衡。如本文所用，“連鎖平衡”描述其中兩個標記獨立地分離的情況，即，在子代中隨機分離。認為顯示連鎖平衡的標記不連鎖(無論它們是否位于相同染色體上)。“基因座”是染色體上的位點，例如，核苷酸、基因、序列或標記所處的位點。“優勢對數(LOD)值”或“L0D 評分” (Risch, Science 255:803-804 (1992))用于基因區間作圖以描述兩個標記基因座之間的連鎖程度。兩個標記間LOD評分為三指示連鎖概率比無連鎖的概率高1000倍，而LOD評分為二指示連鎖概率比無連鎖的概率高100倍。大于或等于二的LOD評分可用于檢測連鎖。LOD評分還可用于在“數量性狀基因座”作圖中顯示標記基因座和數量性狀之間的關聯強度。在這一情況下，LOD評分大小取決于所述標記基因與影響所述數量性狀的基因座之間的接近度，以及所述數量性狀效應的大小。“玉米”指玉米屬(Zea mays L.ssp.mays)植株，也稱為“玉蜀黍”。術語“玉米植物”包括整個玉米植株、玉米植物細胞、玉米植物原生質體、可從其中再生玉米植株的玉米植物細胞或玉米組織培養物、玉米植物愈傷組織、玉米植物叢生物和玉米植物中的完整玉米植物細胞或玉米植物部分，如玉米種子、玉米芯、玉米花、玉米子葉、玉米葉、玉米莖、玉米芽、玉米根、玉米根尖等。“標記”是發現基因或物理圖譜上的位點或發現標記與性狀基因座(影響性狀的基因座)之間的連鎖的手段。標記所檢測的位點可通過檢測多態性等位基因及其基因作圖而獲知，或通過對已經進行物理標測的序列進行雜交、序列匹配或擴增而獲知。標記可以是DNA標記(檢測DNA多態性)、蛋白質(檢測所編碼多肽的變異)或簡單遺傳表型(諸如‘臘質’表型)。可通過基因組核苷酸 序列或表達的核苷酸序列(例如，通過剪接的RNA或cDNA)開發DNA標記。根據DNA標記技術，所述標記由側接所述基因座的互補引物或與該基因座處的多態性等位基因雜交的互補探針組成。DNA標記或基因標記還可用于描述該染色體自身上的基因、DNA序列或核苷酸(而非用于檢測該基因或蛋白序列的組分)并且其通常在該DNA標記關聯于人遺傳學中的特定性狀時使用(例如乳腺癌標記)。術語標記基因座是該標記所檢測的基因座(基因、序列或核苷酸)。檢測種群成員之間的遺傳多態性的標記在本領域中是眾所周知的。標記可由其所檢測的多態性的類型以及用于檢測所述多態性的標記技術所定義。標記類型包括但不限于:限制性片段長度多態性檢測(RFLP)、同功酶標記檢測、隨機擴增的多態性DNA (RAPD)、擴增片段長度多態性檢測(AFLP)、簡單重復序列檢測(SSR)、植物基因組的擴增可變序列檢測、自主序列復制檢測、或單核苷酸多態性檢測(SNP)。SNP可通過，例如，通過DNA測序、基于PCR的序列特異性擴增方法、通過等位基因特異性雜交(ASH)進行的多核苷酸多態性檢測、動態等位基因特異性雜交(DASH)、分子信標·、微陣列雜交、寡核苷酸連接酶分析、Flap核酸內切酶、5’核酸內切酶、引物延伸、單鏈構象多態性(SSCP)或溫度梯度凝膠電泳(TGGE)進行檢測。DNA測序(諸如焦磷酸測序技術)具有能夠檢測組成單倍型的一系列連鎖SNP等位基因的優點。單倍型傾向于比SNP更具信息性(檢測更高水平的多態性)。“標記等位基因”或“標記基因座的等位基因”可以指種群中位于標記基因座的多個多態性核苷酸序列的其中一個。“標記輔助選擇”(MAS)是基于標記基因型選擇個體植物的方法。“標記輔助反選擇”是一種通過它將標記基因型用于鑒定植物的方法，所述植物將不被選擇，使得它們被從育種程序或種植中去除。“標記單倍型”是指在標記基因座的等位基因的組合。“標記基因座”是物種基因組中的特定染色體位點，其中可存在特定標記。“標記基因座”可用于追蹤第二連鎖基因座的存在情況，例如影響表型性狀表達的連鎖基因座。例如，標記基因座能夠用于監控在遺傳上或物理上連鎖的基因座上的等位基因的分離。“標記探針”是可用于通過核酸雜交鑒定標記基因座存在與否的核酸序列或分子，例如與標記基因座序列互補的核酸分子探針。包含標記基因座的30個或更多鄰接核苷酸(“所有或部分”標記基因座序列)的標記探針可用于核酸雜交。作為另外一種選擇，在某些方面分子探針指能夠區別(即基因型)存在于標記基因座上的特定等位基因的任何類型的探針。如上所述，當鑒定連鎖基因座時，術語“分子標記”可用于指遺傳標記，或其用作參照點的編碼產物(例如，蛋白質)。標記能夠來源于基因組核苷酸序列或來源于表達的核苷酸序列(例如來源于剪接的RNA、cDNA等)，或來源于編碼的多肽。該術語也指與標記序列互補或側接標記序列的核酸序列，如用作探針或能夠擴增標記序列的引物對的核酸。“分子標記探針”是可用于鑒定標記基因座存在與否的核酸序列或分子，例如與標記基因座序列互補的核酸探針。作為另外一種選擇，在某些方面分子探針指能夠區別(即基因型)存在于標記基因座上的特定等位基因的任何類型的探針。當核酸在溶液中特異性雜交時，例如根據Watson-Crick堿基配對原則雜交,核酸是“互補的”。當位于插入缺失區域，例如本文所述的非共線區域時，本文所述的一些標記也稱為雜交標記。這是因為，根據定義，插入區域是關于無插入的植株的多態性。因此，標記僅需要指明插入缺失區域是否存在。任何合適的標記檢測技術都可用于鑒定此類雜交標記，例如SNP技術用于本文提供的實例。當等位基因與性狀關聯時，以及當存在的等位基因是期望的性狀或性狀形式將不發生在包含等位基因的植物中的指示時，等位基因與性狀“負”相關。“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、和“核酸片段”可互換使用，并且指作為單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。“核苷酸”是構成DNA或RNA聚合物的單體單元，它由嘌呤或嘧啶堿基、戊糖、和磷酸基組成。核苷酸(通常以它們的5’ -單磷酸形式存在)可以用它們的單字母名稱指代如下:“A”為腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別對應RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脫氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。術語“表型”、“表型性狀”或“性狀”可指基因或成系列基因的可觀測表達。表型對于肉眼或本領域任何其它已知手段而言可以是可觀測的，例如稱重、計數、測量(長度、寬度、角度等)、顯微法、生化分析或機電分析法。在某些情況下，表型可直接受控于單一基因或基因座，即，“單一基因性狀”或“簡單遺傳性狀”。在缺少大水平環境變化的情況下，單一基因性狀在種群中分離，從而給出“性質”或“離散”分布，即，表型歸于離散的類別。在其它情況下，表型是多種基因的結果并且可認為是“多基因性狀”或“復合性狀”。多基因性狀在種群中分離以給出“數量”或“連續”分布，即，所述表型不能分離成為離散的類別。單一基因和多基因性狀均可受到其表達所處的環境的影響，但是多基因性狀傾向于具有更大的環境組分。基因組的“物理圖譜”是顯示染色體DNA上可辨認的界標(包括基因、標記等)的線性順序的圖譜。然而與基因圖譜相比，界標間的距離是絕對的(例如以堿基對測量的或分離的或重疊的鄰接基因片段)并且不基于基因重組(所述基因重組可在不同的種群中有所變化)。“植物”可為整個植株、其任何部分、或來源于植物的細胞或組織培養物。因此，術語“植物”可指代下列任何一種材料:整個植株、植物部分或器官(例如葉片、莖、根等)、植物組織、種子、植物細胞、和/或子代的相同材料。植物細胞是從植物中獲得的細胞或來源于從植物中所獲得細胞經培養出的細胞。“多態性”是在種群內2個或更多個體之間的DNA中的變異。多態性在種群中優選地具有至少1%的頻率。可用的多態性可包括單核苷酸多態性(SNP)、簡單重復序列(SSR)、或插入/缺失多態性，本文也稱為“插入缺失”。當等位基因與性狀連鎖時，以及當存在的等位基因是期望的性狀或性狀形式將發生在包含等位基因的植株中的指示時，等位基因與性狀“正”相關。“概率值”或“P-值”是表型的特定組合和特定標記等位基因的存在或不存在是否隨機的統計學概率。因此，概率計分越低，基因座和表型相關聯的可能性就越高。概率計分可受到第一基因座(通常是標記基因座)與影響該表型的基因座的鄰近度以及表型效應的量級(由等位基因替換導致的表型變化)的影響。在某些方面，認為概率評分是“顯著的”或“不顯著的”。在一些實施例中，認為隨機分離的概率評分為0.05(p=0.05，或5%的概率)是關聯的顯著性指示。然而， 可接受的概率可為小于50% (p=0.5)的任何概率。例如，顯著概率可小于0.25、小于0.20、小于0.15、小于0.1、小于0.05、小于0.01、或小于0.001。“生產標記”或“生產SNP標記”是已經為高通量目的而開發的標記。生產SNP標記被開發用于檢測特異性多態性，并且被設計用于多種化學反應和平臺。本文所使用的標記名稱，以前綴PHM表示“先導雜交標記(Pioneer Hybrid Marker)”,然后是針對其所被設計針對的序列的數字，之后是”或然后是針對DNA多態性的后綴。標記的版本也能夠按照(A、B、C等)表示針對該特異性多態性的標記的版本的方式。術語“子代”指雜交產生的后代。“子代植物”是通過兩個植物間的雜交所生成的植物。術語“數量性狀基因座”或“QTL”指在至少一種遺傳背景下(例如在至少一個育種種群中)，具有與數量表型性狀的差異表達關聯的DNA區域。QTL的區域涵蓋了或緊密地連鎖于影響所關注性狀的基因。 “參考序列”·或“共有序列”是用作序列比對基準的定義序列。通過在該基因座對多個品系測序，在序列比對程序中比對核苷酸序列(例如Sequencher )并且隨后獲得所述比對的最具共同性的序列而獲得PHM標記的參考序列。見于個體序列中的多態性標注于該共同序列中。參考序列通常并非任何個體DNA序列的精確復制，而是可用序列的混合體并且用于設計針對該序列內的多態性的引物和探針。在“相斥”相連鎖中，在受關注基因座上的“有利”等位基因與在鄰近的標記基因座上的“不利”等位基因物理上連鎖，并且兩個“有利”等位基因不被一起繼承(即這兩個基因座彼此“異相”)。技術人員應了解，玉米植物對MRCV的“抗性”相差很大，能夠提供一系列抗性較高至抗性較低的表型，并且其根據感染的嚴重程度能夠發生變化。然而，通過簡單觀察，技術人員可確定不同植物、植物品系或植物家族對MRCV的相對抗性或易感性，并且此外還應認識到“抗性”的表型漸差(示例性的計分系統在下文實例I中給出)。“頂交測試”是通過將各個體(例如，選擇物、自交系、克隆或子代個體)與相同的花粉親本或“測試物(tester)”(通常是純合品系)雜交而實施的測試。短語“在嚴格條件下”指在該條件下探針或多核苷酸將與特定核酸序列雜交，雜交通常在核酸混合物中進行，但是基本上無其它序列。嚴格條件是序列依賴性的并將因不同的環境而異。較長序列具體地講在較高溫度下雜交。特定序列在限定離子強度、PH的情況下，嚴格條件通常選擇比熱解鏈溫度(Tm)低約5-10°C。Tm是(在限定離子強度、pH和核酸濃度的情況下)50%與靶互補的探針平衡雜交到靶序列上(因為存在的靶序列過多，在Tm50%的探針被平衡占用)的溫度。嚴格條件應為如下條件:在PH7.0至8.3下鹽濃度低于約1.0M鈉離子，通常約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，并且對于短探針(例如10至50個核苷酸)溫度為至少約30°C，而對于長探針(例如多于50個核苷酸)溫度為至少約60°C。嚴格條件也可以通過加入諸如甲酰胺之類的去穩定劑來實現。就選擇性雜交或特異性雜交而言，陽性信號是至少兩倍于背景，優選10倍于背景雜交。示例性嚴格雜交條件通常為:50%的甲酰胺，5x SSCJP 1%SDS，在 42°C孵育，或 5x SSC，1%SDS，在 65°C孵育，并用 0.2x SSC 以及0.1%SDS在65°C洗滌。就PCR而言，約36°C的溫度是典型的低嚴格擴增，而退火溫度取決于引物長度可介于約32°C和48°C之間。決定雜交參數的附加準則在多個參考文獻中提供。標記的“不利等位基因”是與不利植物表型共分離的標記等位基因，因此提供鑒定能從育種程序或栽培中移除的植物的有益效果。術語“產量”指具有商業價值的特定植物產品每單位面積的產量。例如玉米產量一般以每季每英畝種子蒲式耳數或每季每公頃種子公噸數來測量。產量受遺傳和環境因素的影響。“農學”、“農學特性”、和“農學性能”指給定植物品種的性狀(以及產生性狀的遺傳因子)，所述性狀有助于經過生長期的產量。單個農學特性包括出苗活力、營養勢、脅迫耐受性、病害抗性或耐受性、除草劑抗性、發生分枝、開花、結實率、種子大小、種子密度、抗倒伏性、脫粒率等等。因此產量是所有農學特性的最終結果。序列比對和同一性百分比可用設計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定，這些方法包括但不限于LASERGENEa'生物信息計算包(DNASTAR Inc.，Madison,
WI)的MEGALIGNfj程序。除非另外說明，本文提供的序列的多重比對用Clustal V比對方法(Higgins 和 Sharp, CABI OS.5:151-153 (1989))采用默認參數(GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY= 10)執行。使·用Clustal V方法進行逐對比對和蛋白質序列的百分比同一性計算的默認參數為 KTUPLE=I, GAP PENALTY=3, WIND0W=5、以及 DIAGONALS SAVED=5。對于核酸，這些參數為 KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WIND0W=4、以及 DIAGONALS SAVED=4。用Clustal V程序比對序列后，可以通過查看同一程序中的“序列距離”表來獲得“百分比同一性”和“趨異”值。除非另外說明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計算的。本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域所熟知的并且在如下文獻中有更全面的描述:Sambrook, J., Fritsch, E.F.and Maniatis, T., Molecular Cloning:ALaboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,1989(下文稱為 “Sambrook”)。在詳述本發明之前，應當了解本發明不受特定實施例的限制。也應當了解本文所用的術語僅是為了描述特定實施例，而不旨在進行限制。當在本文和所附權利要求中使用時，除非內容清楚地表明，單數和單數形式的術語包括復數指代。因此，例如術語“一個植物”也包括多個植物；取決于上下文，使用的術語“植物”也可包括該植物遺傳相似或相同的子代；使用的術語“核酸”任選地包括該核酸分子的多個拷貝；現在來看實施例:對馬德早.約柯托病毒(MRCV)所導致疾病的抗性馬德里約柯托病毒(MRCV)所導致的疾病是由斐濟病毒屬物種導致的破壞性玉米疾病。與MRCV抗性相關聯的分子標記和分子標記的等位基因的鑒定允許僅基于子代的遺傳組成來選擇抗性。本文提供了通過評價基因組成(根據使用分子標記及其等位基因進行的估測而進行)來鑒定和/或選擇具有增強的MRCV抗性或對馬德里約柯托病毒(MRCV)所導致的疾病或感染的抗性的玉米植物的方法。某閔作圖已經認識到，在相當一些情況下可在生物體的基因組中標測與特定表型(諸如對馬德里約柯托病毒(MRCV)所導致疾病的抗性)相關聯的基因座。有利的是，植株育種人員可使用分子標記通過檢測標記等位基因鑒定期望的個體，所述標記等位基因顯示與期望表型共分離的統計意義上顯著的概率，表現為連鎖不平衡。通過鑒定與受關注的性狀共分離的分子標記或分子標記簇，植株育種人員能夠對合適的分子標記等位基因進行正選擇(該過程稱為標記輔助選擇或MAS)從而迅速選擇期望表型。
本領域中具有多種熟知的方法用于檢測與所關注的性狀(諸如對馬德里約柯托病毒(MRCV)所導致疾病的抗性)共分離的分子標記或分子標記簇。這些方法的基本原理是檢測具有顯著不同平均表型的供選擇基因型(或等位基因)的標記。因此，比較標記基因座之間的供選擇基因型(或等位基因)之間的差異大小或差異顯著性水平。推斷性狀基因位于最靠近一個或多個標記的位置，所述標記與基因型差異具有最大的關聯性。兩種用于檢測所關注的性狀基因座的此類方法是:1)基于種群的關聯分析和2)傳統的連鎖分析。在基于種群的關聯分析中，從具有多個創始者(例如優良育種品系)的已有種群中獲得品系。基于種群的關聯分析依靠連鎖不平衡(LD)的弱化和下列觀點:在非結構化的種群中，在如此多代隨機交配之后，僅有控制受關注性狀的基因和與這些基因緊密連鎖的標記之間的關聯將保存下來。實際上，大多數已有種群具有種群亞結構。因此，通過把個體分配到種群中，使用得自無規分布于基因組的標記的數據，采用結構關聯方法有助于控制種群結構，從而最小化由于單個種群(也稱為亞種群)內的種群結構帶來的不平衡。表型值與在亞群中每個品系的每個標記基因座上基因型(等位基因)進行比較。顯著的標記-性狀關聯指示標記基因座和涉及該性狀表達的一個或多個基因座接近。傳統的連鎖分析使用相同的原則；然而，LD通過從少量創始者產生種群生成。選擇創始者以最大化結構化種群內的多態性水平，并且評估多態性位點與給定表型的共分離水平。許多統計學方法已經用于鑒定顯著的標記-性狀關聯。一種此類方法是區間作圖方法(Lander和Botstein，Geneticsl21:185-199 (1989)，其中針對控制受關注性狀的基因位于該位點的概率來測試沿基因圖譜(IcM的區間)的許多位點中的每一個位點。基因型/表型數據用于計算每個測試位點的LOD評分(概率比率的對數)。當LOD評分大于閾值時，存在控制受關注性狀的基因位點位于基因圖譜上的該位點上的顯著證據(它將位于兩個特定標記基因座之間)。本發明提供了玉米標記基因座，根據傳統的連鎖分析測定，其顯示了與對馬德里約柯托病毒(MRCV)所導致疾病的抗性的統計上顯著的共分離。這些基因座或附加連鎖基因座的檢測可用于標記輔助玉米育種程序，以產生具有增強的MRCV抗性的植物。標記纟目合物本文鑒定了與對馬德里約柯托病毒(MRCV)所導致疾病的抗性相關聯的標記。方法涉及檢測玉米植物的種質中與增強的抗性相關聯的一個或多個標記等位基因的存在。玉米植株可以是雜交體或自交體。對于在4號染色體上鑒定的QTL，標記基因座可選自表2中提供的任何標記基因座，包括PHM標記PHM1718、PHM669、PHM11786和PHM8008 ；以及與這些標記連鎖的任何其它標記(連鎖的標記能夠從Maize⑶B資源確定)。對于在5號染色體上鑒定的QTL，標記基因座可選自表2和3中提供的任何標記基因座，包括 PHM 標記 PHM15741、PHM12093、PHM15051、PHM8091、PHM6248、PHM9452、PHM12615、PHM5713、PHM6921、PHM1683和PHM17281 ;以及與這些標記連鎖的任何其它標記(連鎖的標記能夠從Maize⑶B資源確定)。QTL的物理圖譜 位置基因元件或位于單個染色體上的基因組DNA的鄰接線性片段上的基因是物理上連鎖的。
在關聯分析中發現PHM1718和PHM8008劃定了 4號染色體上的MRCV抗性的QTL。PHM1718和PHM8008位置是基于PHB基因圖譜，其如表I中的描述對標記排序。然而，來源于公開玉米品系B73的公開物理圖譜表現出如下的順序:PHM669、PHM1718、PHMl 1786和PHM8008。能與介于下列序列之間并包括所述序列的鄰接DNA裝配的任何多核苷酸可覆蓋與MRCV抗性性狀相關聯的標記基因座:SEQ ID N0:41(PHM1718的參考序列)或基于ClustalV比對方法與SEQ ID N0:41具有95%相同的核苷酸序列與SEQ ID NO:44 (PHM8008的參考序列)或基于Clustal V比對方法與SEQ ID NO: 44具有95%相同的核苷酸序列。此外，能與介于下列序列之間并包括所述序列的鄰接DNA裝配的任何多核苷酸可覆蓋與MRCV抗性性狀相關聯的標記基因座:SEQ ID NO:42 (PHM669的參考序列)或基于Clustal V比對方法與SEQ ID NO:42具有95%相同的核苷酸序列與SEQ ID NO:44 (PHM8008的參考序列)或基于Clustal V比對方法與SEQ ID NO: 44具有95%相同的核苷酸序列。在實施于475個品系組上的關聯作圖分析中發現，PHM12615和PHM17281劃定了5號染色體上的MRCV抗性的QTL。PHM12615和PHM17281位置是基于PHB基因圖譜，其如表2中的描述對標記排序。然而，來源于公開玉米品系B73的公開物理圖譜表現出如下的順序:PHM12615、PHM5713、PHM6921、PHM17281和PHM1683。能與介于下列序列之間并包括所述序列的鄰接DNA裝配的任何多核苷酸可覆蓋與MRCV抗性性狀相關聯的標記基因座:SEQ ID N0:71 (PHM12615的參考序列)或基于Clustal V比對方法與SEQ ID N0:71具有95%相同的核苷酸序列與SEQ ID NO: 75 (PHM17281的參考序列)或基于Clustal V比對方法與SEQ ID NO: 75具有95%相同的核苷酸序列。此外，能與介于下列序列之間并包括所述序列的鄰接DNA裝配的任何多核苷酸可覆蓋與MRCV抗性性狀相關聯的標記基因座:SEQ IDNO: 71 (PHM12615的參考序列)或基于Clustal V比對方法與SEQ ID NO: 71具有95%相同的核苷酸序列與SEQ ID NO:74 (PHM1683的參考序列)或基于Clustal V比對方法與SEQID NO: 74具有95%相同的核苷酸序列。在實施于阿根廷自交系的組上的關聯作圖分析中發現，PHM15741和PHM9452劃定了 5號染色體上的MRCV抗性的QTL。能與介于下列序列之間并包括所述序列的鄰接DNA裝配的任何多核苷酸可覆蓋與MRCV抗性性狀相關聯的標記基因座:SEQ ID NO:45 (PHMl5741的參考序列)或基于Clustal V比對方法與SEQ ID N0:45具有95%相同的核苷酸序列與SEQ ID NO:50(PHM9452的參考序列)或基于Clustal V比對方法與SEQ ID N0:50具有95%相同的核苷酸序列。5號染色體上涵蓋一個或多個QTL的較大QTL區間以PHM12615和PHM9452為界。能與介于下列序列之間并包括所述序列的鄰接DNA裝配的任何多核苷酸可覆蓋與MRCV抗性性狀相關聯的標記基因座:SEQ ID N0:71 (PHM12615的參考序列)或基于Clustal V比對方法與SEQ ID N0:71具有95%相同的核苷酸序列與SEQ ID NO:50 (PHM9452的參考序列)或基于Clustal V比對方法與SEQ ID NO: 50具有95%相同的核苷酸序列。連鎖關系連鎖的常見量度是性狀共分離的頻率。這可以共分離百分比(重組頻率)表示，或以厘摩(CM)表示。CM是基因 重組頻率的量度單位。IcM等于由于在一代中的交換導致的在一個基因座上的性狀將與在另一個基因座上的性狀分離的概率為1%(意味著性狀99%的情況下共分離)。因為染色體距離與性狀間交換事件的頻率大約成比例，有與重組頻率關聯的近似物理距離。標記基因座本身是性狀，并且在分離期間能夠通過跟蹤標記基因座、根據標準連鎖分析進行評估。因此，IcM等于經過單代雜交的標記基因座將與在另一個基因座分離的1%的概率。標記距離控制受關注性狀的基因越近，則標記作為期望性狀的指示越有效和有利。緊密連鎖的基因座顯示約10%或更低，優選約9%或更低，更優選約8%或更低，更優選約7%或更低，更優選約6%或更低，更優選約5%或更低，更優選約4%或更低，更優選約3%或更低，更優選約2%或更低的基因座內交換頻率。在高度優選的實施例中，相關基因座(例如標記基因座和靶基因·座)顯示約1%或更低的重組頻率,例如約0.75%或更低，更優選地約0.5%或更低，或更優選地約0.25%或更低的重組頻率。因此，所述基因座分開距離為約10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0.75cM、0.5cM 或 0.25cM 或更低。換句話說，位于相同染色體上，并且它們間的距離使得兩個基因座間的重組發生頻率小于10% (例如約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%,0.5%、0.25%、或更低)的兩個基因座稱為彼此“接近”。盡管特定的標記等位基因可與MRCV抗性共分離，重要的是注意所述標記基因座不一定引起所述MRCV抗性表型的表達。例如，該標記多核苷酸序列是產生增強的MRCV抗性或對MRCV所導致的疾病或感染的基因的一部分(例如，是基因開放閱讀框的一部分)并非必需條件。特定標記等位基因與增強的MRCV抗性表型的關聯，是由于在等位基因從中起源的祖先玉米品系中，標記等位基因和等位基因之間的最初“相引”相連鎖。最后通過反復重組，標記和基因座間的交換事件能夠改變這種取向。正是因為這個原因，有利標記等位基因可根據存在于耐受性親本中的相連鎖發生改變，所述耐受性親本用于制備分離種群。這不改變可使用標記監控表型分離的事實。它僅僅改變在給定分離種群中認為哪個標記等位基因是有利的。對于4號染色體上的QTL，表I中列出的標記可用于推測玉米植物中MRCV抗性性狀的狀態。這包括處于 PHM 標記 PHM1718、PHM669、PHMl 1786 和 PHM8008 的 50cM、40cM、30cM、20cM、15cM、10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0.75cM、0.5cM 或 0.25cM內的任何標記。對于5號染色體上的QTL，表2和3中列出的標記可用于推測玉米植物中MRCV抗性性狀的狀態。這包括處于 PHM 標記 PHMl5741、PHMl2093、PHMl5051、PHM8091、PHM6248、PHM9452、PHM12615、PHM5713、PHM6921、PHM1683 和 PHM17281 的 50cM、40cM、30cM、20cM、15cM、10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0.75cM、0.5cM 或 0.25cM 內的任何標記。染色體區間提供了與MRCV抗性關聯的染色體區間。本領域熟知的多種方法可用于鑒定染色體區間。此類染色體區間的邊界擴展到涵蓋將與控制受關注性狀的基因連鎖的標記。換句話說，擴展染色體區間使得位于區間內的任何標記(包括限定區間邊界的末端標記)可用作MRCV抗性標記。每個區間包含至少一個QTL，此外甚至可包含一個以上的QTL。相同區間中非常接近的多個QTL可攪亂特定標記與特定QTL的關聯，因為一個標記可顯示與一個以上的QTL連鎖。相反地，例如如果非常接近的兩個標記顯示與期望表型性狀共分離，有時分不清楚是否那些標記中的每一個鑒定相同QTL或兩個不同的QTL。無論如何，完成或實施本發明不需要了解在特定區間中有多少QTL。下文描述的區間示出了與MRCV抗性共分離的標記簇。該簇標記發生在染色體上相對小的結構域內，并且指示那些染色體區域中的一個或多個QTL的存在。區間擴展到涵蓋與MRCV抗性共分離的標記。區間被它們末端的標記限定，其中區間涵蓋在區間內作圖的標記以及限定末端的標記。通過限定區間端點的末端標記描述的區間將包括末端標記和位于該染色體結構域內的任何標記，無論這些標記目前是否已知。對于4號染色體上的QTL，區間可被如下標記限定并且包括它們:PHM1718與PHM8008,或PHM669和PHM8008。位于這些區間內的任何標記可作為MRCV抗性標記使用。對于5號染色體上的QTL，位于下列任何區間內的任何標記可作為MRCV抗性標記使用，所述區間由下列限定并且包括下列:i.PHMl2615 和 PHM9452 ；ii.PHM12615 和 PHM17281 ；iii.PHM12615 和 PHM1683 ;以及iv.PHM15741 和 PHM8452。染色體區間也可通過與QTL標記連鎖(表現出連鎖不平衡)的標記限定，r2是關聯性研究中連鎖不平衡(LD)的常見量度。如果，例如，位于PHM12615和PHM9452區間內的5號染色體標記基因座與另一個緊鄰的5號染色體標記基因座之間的LD的r2值大于1/3(Ardlie 等人,Nature Reviews Genetics3:299-309 (2002)),則這兩個基因座彼此連鎖不平衡。標記等位基因和單倍型組合本發明的標記也可為一個或多個標記基因座上的等位基因的組合，其通常稱為單倍型。下列4號染色體單倍型在本文中據顯示連鎖于對MRCV感染的增強抗性，并且可用于標記輔助的選擇以選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物:a)包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:44，在位置324處的“G”、在位置345處的“C”、在位置504處的“G”和在位置565處的“A” ；b)包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:42，在位置85處的“A”、在位置344處的“C”和在位置355處的“A” ；和c)包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:43，在位置58處的“G”、在位置61處的插入、在位置70處的“C”、在位置85處的“C”、在位置90處的“T”、在位置194處的“G”和在位置287處的“A”。任何上述單倍型均可單獨使用或組合使用來鑒定和選擇具有增強的MRCV感染抗性的植物。技術人員將期望可能存在附加的多態性位點，所述位點位于本文鑒定的5號染色體和4號染色體標記內部的以及周圍的標記基因座上，其中一個或多個多態性位點與單倍型的一個或多個多態性位點上的等位基因連鎖不平衡(LD)。不同多態性位點上的兩個特定等位基因，在其中一個位點上所述等位基因的存在傾向于推測在相同染色體上的另一位點上存在等位基因的情況下，所述等位基因被稱為處于LD (Stevens, Mol.Diag.4:309-17(1999))。技術人員將理解等位基因頻率(進而單倍型頻率)可因種質庫不同而不同。種質庫由于成熟期差異、雜種優勢群、地理分布等等而不同。因此，SNP和其它多態性可能在一些種質庫中無法提供信息。標記輔助詵擇分子標記可用于多種植株育種應用(如參見Staub等人(1996) Hortscience31:729-741 ;Tanksley (1983)Plant Molecular Biology Reporter.1:3-8)。受關注的主要領域之一是使用標記輔助選擇(MAS)增加回交和基因滲入的效率。展示出與影響期望表型性狀的基因座連鎖的分子標記提供了在植株種群中選擇性狀的有用工具。當表型難以測定(例如很多病害抗性性狀)，或表型發生在植株發育的晚期(例如籽粒特征)時，尤其如此。由于DNA標記測定比田間表型分析更省力并且占用的物理空間更小，可測定更大的種群，增加了發現具有從供體·品系移動至受體品系的靶片段的重組體的概率。連鎖越緊密，標記越有用，這是因為重組不太可能發生于標記和引起性狀的基因之間，所述重組可導致假陽性。由于需要雙重組事件，側接標記減少了假陽性選擇發生的概率。理想情況是基因本身具有標記，使得標記和基因之間的重組不能發生。此類標記稱為“完美標記”。當基因通過MAS滲入時，不僅引入了基因而且引入了側接區域(G印ts.(2002)Crop Sci ;42:1780-1790)。這稱為“連鎖累贅”。在供體植株與受體植株極不相關的情況下，這些側接區域攜帶可編碼農學上不良性狀的附加基因。該“連鎖累贅”也可導致產量減少或其它負面農學特性，即便與優良玉米品系回交多個周期后。這有時也稱為“產量累贅”。側接區域的大小可通過附加的回交而減小，雖然這并不總是成功的，因為育種人員不能控制該區域或重組斷點的大小(Young等人(1998) Genetics 120:579-585)。在經典育種中，通常只是單憑偶然因素選取有助于減小供體片段大小的重組(Tanksley等人(1989)Biotechnology7:257-264)。即使在此類回交次數達20次后，可預期找到的仍與所選基因連鎖的供體染色體還是具有相當大的片段。然而如果使用標記的話，就可能選取那些在受關注的基因附近經歷了重組的稀有個體。在150株回交植株中，至少一株植株經歷交換有95%的概率，所述交換在基于單次減數分裂圖距的IcM基因內進行。標記使得能夠明確鑒定這些個體。對于300株植株的一次附加回交，在基因另一側的IcM單次減數分裂圖距內有95%的交換概率，從而產生在基于單次減數分裂圖距小于2cM的靶基因附近的片段。用標記時在兩代就可實現，而不用標記時則需要平均100代(參見Tanksley等人，同上)。當基因的確切位置已知時，圍繞基因的側接標記可用于在不同的種群大小中對重組進行正選擇。例如，在更小的種群中，預期重組可進一步遠離基因，因此需要更遠端的側接標記來檢測重組。包含增強密度的公開玉米標記的玉米基因組整合連鎖圖譜的可用性促進了玉米基因作圖和MAS。參見如IBM2Neighbors圖譜，該圖譜可在Maize⑶B網站上在線獲得。具體實施MAS的關鍵是:(i)限定標記-性狀的關聯在其中將被測定的群體，其能夠是分離群體、或隨機的或結構化的群體；(ii)監測多態性標記相對于性狀的分離或關聯，并使用統計學方法確定連鎖或關聯；(iii)基于統計學分析的結果限定一組所期望的標記，和(iv)運用和/或外推該信息至當前的育種種質，以使得能夠作出基于標記的選擇決定。本公開中描述的標記，以及其它標記類型例如SSR和FLP，可用于標記輔助選擇方案。
簡單重復序列(SSR)能夠被定義為相對少量的6bp或更短的DNA的串聯重復(Tautz (1989)Nucleic Acid Researchl7:6463_6471 ;Wang 等人(1994)Theoretical andApplied Genetics,88:1_6)。多態性由于重復單元數量的變化而增加,這種變化很可能是由 DNA 復制過程中的滑移導致的(Levinson 和 Gutman (1987)Mol Biol Evol4:203_221)。重復長度的變化可通過在保守的非重復側接區域設計PCR引物來檢測(Weber和May(1989)Am J Hum Genet.44:388-396)。SSR非常適于作圖和MAS，因為它們是多等位基因的、共顯性的、可再現的，并且適合高通量自動化(Rafalski等人(1996)Generating and using DNAmarkers in plants, In:Non-mammaIian genomic analysis:a practical guide.Academicpress，第 75-135 頁) 可生成各種類型的SSR標記，并且來自抗性品系的SSR特征圖可通過擴增產物的凝膠電泳獲得。標記基因型的評分基于擴增片段的大小。由位于Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canada 的 DNA Landmarks 依據合同規定向公眾提供玉米的SSR服務。也可生成各種類型的FLP標記。最常見地，擴增引物用于生成片段長度多態性。此類FLP標記在很多方面類似于SSR標記，不同的是由引物擴增的區域通常不是高度重復區域。通常由于插入或缺失，擴增區域或擴增子在種質間還具有足夠的可變性，使得由擴增引物產生的片段能夠在多態性個體中區分開，并且已知此類插入缺失常常發生于玉米中(Bhattramakki 等人(2002) Plant Mol Biol48, 539-547 ；Rafalski (2002b)，同上)。SNP標記檢測單堿基對核苷酸取代。在所有分子標記類型當中，SNP是最多的，因此具有提供最高基因圖譜分辨率的能力(Bhattramakki等人，2002，Plant MolecularBiology48:539-547)。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平上進行檢測，即以所謂的“超高通量”模式進行檢測，因為它們不需要大量DNA，并且可直接進行自動化檢測。SNP也具有成為相對低成本系統的前景。這三個因素一起使得SNP對在MAS中的應用具有高度吸引力。若干種方法可用于SNP基因分型，包括但不限于雜交、引物延伸、寡核苷酸連接、核酸酶酶解、微測序和編碼球。此類方法已經被下列文獻敘述:Gut (2001) Hum Mutatl7,第475-492 頁；Shi (2001) Clin Chem47，第 164-172 頁；Kwok (2000) Pharmacogenomics 1，第 95-100 頁；Bhattramakki 和 Rafalski (2001)Discovery and application of singlenucleotide polymorphism markers in plants, In:R.J.Henry 編輯，Plant Genotyping:The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford。多種可商購獲得的技術利用這些方法和其它方法檢查SNP,包括Masscode.TM.(Qiagen)、invadd' " (Third
Wave Technologies)和 Invader Plus > SnapShot (Applied Biosystems)> Taqman
(Applied Biosystems)和 BeadarrayS* (Illumina)。許多一起在單條序列內、或跨越連鎖序列的SNP可用于描述任何特定基因型的單倍型(Ching 等人(2002) BMC Genet.3:19 ;Gupta 等人 2001 ；Rafalski (2002b) PlantScience 162:329-333)。單倍型可比單個的SNP提供更多信息，并且可描述較多的任何特定基因型。例如，單個 的SNP可以是具有增強的MRCV感染抗性的特定品系或品種的等位基因“T”，但是等位基因“T”也可發生在用于輪回親本的玉米育種種群中。在這種情況下，單倍型例如在連鎖SNP標記上的等位基因組合可提供較多的信息。一旦已經將唯一的單倍型分配給供體染色體區域，該單倍型可用于種群或其任何亞群以確定是否個體具有特定基因。參見例如W02003054229。使用本領域普通技術人員已知的那些自動化高通量標記檢測平臺使得這一方法高效和有效。由于存在插入/缺失多態性，很多PHM標記可易于用作FLP標記來對4號和5號染色體上的基因座進行正選擇。PHM標記的引物也可用于將這些標記轉化為在相同區域內的SNP或其它結構上類似或功能上等同的標記(SSR、CAP、插入缺失等)。一種非常高效的SNP 轉化方法描述于 Rafalski (2002a)Current opinion in plant biology5 (2):94-100以及Rafalski (2002b)Plant Sciencel62:329_333。使用PCR時，引物用于擴增來自個體(優選地自交體)的DNA片段，所述個體代表受關注種群的多樣性。將PCR產物在一個或兩個方向直接測序。比對所得的序列并且鑒定多態性。多態性不限于單核苷酸多態性(SNP)，還包括插入缺失、CAPS、SSR、和VNTR (可變數目串聯重復)。具體地講，針對本文所述的精細圖譜信息，人們可易于使用本文提供的信息來獲得在通過本公開列出的引物擴增的區域內的附加多態性SNP (和其它標記)。可將在所述圖譜區域內的標記雜交到BAC或其它基因組文庫，或與基因組序列電子比對，以便在與所述標記的基本近似的位置處查找新序列。除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外，其它類型的分子標記也廣泛使用，包括但不限于表達序列標簽(EST)、來源于EST序列的SSR標記、隨機擴增多態性DNA (RAPD)、和其它基于核酸的標記。在一些情況下，同功酶特征圖和連鎖的形態學特征也可間接用作標記。盡管它們不直接檢測DNA差異，它們通常也受特定的遺傳差異影響。然而，檢測DNA變異的標記遠遠多于同功酶或形態學標記并且更具多態性(Tanksley (1983)Plant Molecular BiologyReporter 1:3_8)。序列比對或重疊群也可用于查找本文列出的特定標記的上游或下游序列。這些新序列靠近本文所述的標記，然后被用于發現和開發功能等同的標記。例如將不同的物理和/或基因圖譜進行比對以定位等同標記，所述標記不在所述公開中描述，但是位于相似區域內。這些圖譜可在玉米物種中，或甚至包括已經與玉米進行了遺傳上或物理上的比對的其它物種，如大米、小麥、大麥或高粱。一般來講，MAS使用的多態性標記是經鑒定具有與表型(諸如MRCV抗性)共分離的顯著概率的多態性標記。推測此類標記在圖譜上接近賦予植株MRCV抗性表型的一個或多個基因，并且認為此類標記是期望性狀的指示，或是標記。測試植株是否在標記中存在期望的等位基因，并且期望在一個或多個基因座上包含期望基因型的植株將期望基因型與期望表型一起轉移到它們的子代。因此，具有增強的MRCV感染抗性的植物可通過檢測一種或多種標記等位基因進行選擇，并且此外還可選擇源于這些植物的子代植物。因此，獲得了在給定的染色體區域中包含所期望的基因型(即，與增強的MRCV感染抗性關聯的基因型)的植株并將其與另一植株進行雜交。隨后可使用一種或多種標記對這一雜交的子代進行基因型評價并且隨后應選擇在給定染色體區域具有相同基因型的子代植物以作為具有增強的MRCV感染抗性。本文鑒定的標記可用于MAS中，以選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物。單倍型也可用于MAS中 ，以將增強的MRCV感染抗性引入易感玉米品系或品種。下列4號染色體單倍型可用于標記輔助選擇，以對具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物進行選擇:a)包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:44，在位置324處的“G”、在位置345處的“C”、在位置504處的“G”和在位置565處的“A” ；b)包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:42，在位置85處的“A”、在位置344處的“C”和在位置355處的“A” ；或c)包含下列的單倍型:相對于SEQ ID N0:43，在位置58處的“G”、在位置61處的插入、在位置70處的“C”、在位置85處的“C”、在位置90處的“T”、在位置194處的“G”和在位置287處的“A”。實魁提供下列實例以示·出受權利要求書保護的本發明，但本發明不受下列實例的限制。應當理解本文所述的實例和實施例僅用于例證性的目的，并且本領域的技術人員將認識到在不脫離本發明精神或所附權利要求范圍的情況下可改變多種試劑或參數。實例1
表征對MRCV感染的反應玉米品系可根據其對MRCV感染的抗性或易感性程度進行表征。使用了從一到九的標度，其中“I”是指高度易感的植物而“9”是指高度抗性植物。在這類標度中，1-3的計分表示多數植物表現出嚴重的矮化、嚴重的節間縮短、不良的穗發育或無穗發育，或過早死亡；4_6的計分表示多數植物僅僅顯示耳突和/或中度節間縮短，很少植物顯示出嚴重的癥狀；并且7-9的計分顯示了無癥狀或少量耳突的高度抗性植物。通常在具有天然感染的地點作出疾病計分。本實驗中包括了對照或對MRCV感染具有為人熟知的反應的品系以標定任何具體地點的疾病壓力。如果某一地點據信具有足夠的疾病壓力，則通常在開花后采集疾病計分。實例 2475個品系的組中的關聯作圖分析實施了關聯作圖策略來鑒定玉米中與MRCV抗性關聯的標記。在該關聯分析中，通過對4，000-10, 000個基因(基因座)進行DNA測序分析475個玉米品系的集合。所述品系包括優良種質、可商購獲得的栽培變種、以及其它公開的品種。根據實例I中的描述對所述玉米品系進行表型分型。在本分析中使用了疾病計分的組合，這包括在2006年獲自大田的計分和在多個地點和多個年份上收取的同意以歷史記錄。使用標準關聯作圖方法進行基于結構的關聯分析，其中使用標記數據控制種群結構。使用由Pritchard等人開發的基于模型的集分析軟件Structure以880個優良玉米自交系在兩百種標記上的數據來估測混合系數(admixture coefficient)并且將所述自交系分成七個亞種系(J.K.Pritchard, M.Stephens 和 P.J.Donnelly (2000) “Inference ofpopulation structure using multilocus genotype data, ”Geneticsl55:945-959)。這降低了假陽性的發生概率，假陽性可能由對關聯作圖統計的群體結構效應引發。使用了用于檢驗兩種分布是否相同的柯伊伯統計來針對給定亞種群中單倍型和表型之間的關聯檢驗給定標記(W.H.Press, S.A.Teukolsky,ff.T.Vetterling, B.P.Flannery, 2002 !NumericalRecipes in C,第二版，Cambridge University Press, NY)。在熱帶亞種群的4號染色體上鑒定顯著標記性狀關聯的峰(
圖1)。基于模型的集分析軟件Structure將80個品系分配為這一熱帶亞種群。與MRCV抗性表現出最顯著性關聯的標記是PHM8008 (P-值=9.4Χ1(Γ5)，其位于內源遺傳圖譜(PHB)上的136.03位置。此夕卜，另外三種標記也在該熱帶亞種群中顯著地關聯于MRCV抗性，P-值彡0.01。表I示出了顯著關聯于MRCV抗性的4號染色體標記，p-值< 0.01。復1所述熱帶亞種群中顯著關聯MRCV抗性的4號染色體標記，p-值< 0.0權利要求
1.鑒定和/或選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，包括: a.在所述玉米植物中檢測第一標記等位基因，所述第一標記等位基因連鎖并關聯: 1.由下列組成的單倍型:相對于SEQID NO:44，在位置324處的“G”、在位置345處的“C”、在位置504處的“G”和在位置565處的“A” ； i1.由下列組成的單倍型:相對于SEQID NO:42，在位置85處的“A”、在位置344處的“C”和在位置355處的“A” ；或 ii1.由下列組成的單倍型:相對于SEQID NO:43，在位置58處的“G”、在位置61處的插入、在位置70處的“C”、在位置85處的“C”、在位置90處的“T”、在位置194處的“G”和在位置287處的“A”；以及 b.鑒定和/或選擇所述玉米植物，所述玉米植物具有所述第一標記等位基因。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述第一標記等位基因在單次減數分裂圖上以20cM 連鎖 i)、ii)或 iii)。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述第一標記等位基因在單次減數分裂圖上以2cM 連鎖 i)、ii)或 iii)。
4.鑒定和/或選擇具有增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，包括: a.在所述玉米植物中檢測: 1.包含下列的單倍 型:相對于SEQID N0:44，在位置324處的“G”、在位置345處的“C”、在位置504處的“G”和在位置565處的“A” ； i1.包含下列的單倍型:相對于SEQID NO:42，在位置85處的“A”、在位置344處的“C”和在位置355處的“A”； ii1.包含下列的單倍型:相對于SEQID NO:43，在位置58處的“G”、在位置61處的插入、在位置70處的“C”、在位置85處的“C”、在位置90處的“T”、在位置194處的“G”和在位置287處的“A”；或 iv.1-1ii的任何組合；以及 b.鑒定和/或選擇所述玉米植物，所述玉米植物具有(a)中1-1v的任何項。
5.鑒定和/或選擇表現出增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的種質中檢測在一個或多個標記基因座處包含等位基因的單倍型，其中: a.所述一個或多個標記基因座位于染色體區間內，所述染色體區間包含并側接:1.PHM1718 和 PHM8008 ;或i1.PHM669 和 PHM8008 ;并且 b.所述單倍型關聯增強的MRCV感染抗性。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述單倍型選自: a.包含下列的單倍型:相對于SEQID N0:44，在位置324處的“G”、在位置345處的“C”、在位置504處的“G”和在位置565處的“A” ； b.包含下列的單倍型:相對于SEQID NO:42，在位置85處的“A”、在位置344處的“C”和在位置355處的“A”； c.包含下列的單倍型:相對于SEQID NO:43，在位置58處的“G”、在位置61處的插入、在位置70處的“C”、在位置85處的“C”、在位置90處的“T”、在位置194處的“G”和在位置287處的“A”；或d.a-c的任何組合。
7.鑒定和/或選擇表現出增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括: a.獲得第一玉米植物，所述第一玉米植物在其基因組內包含: i.包含下列的單倍型:相對于SEQID N0:44，在位置324處的“G”、在位置345處的“C”、在位置504處的“G”和在位置565處的“A” ； i1.包含下列的單倍型:相對于SEQID NO:42，在位置85處的“A”、在位置344處的“C”和在位置355處的“A”； ii1.包含下列的單倍型:相對于SEQID NO:43，在位置58處的“G”、在位置61處的插入、在位置70處的“C”、在位置85處的“C”、在位置90處的“T”、在位置194處的“G”和在位置287處的“A”； 或 iv.1-1ii的任何組合； b.將所述第一玉米植物與第二玉米植物雜交； c.針對(a)中1-1v的任何項評價子代植物；以及 d.鑒定和/或選擇具有(a)中1-1v的任何項的子代植物。
8.鑒定和/或選擇表現出增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在玉米植物中檢測標記基因座,其中: a.將包含全部或部分所述標記基因座或其互補序列的標記探針在嚴格條件下與鄰接DNA雜交，所述鄰接DNA介于下列序列之間并包括下列序列:SEQ ID NO: 71或基于ClustalV比對方法與SEQ ID NO:71具有95%相同的核苷酸序列、以及SEQ ID NO: 50或基于ClustalV比對方法與SEQ ID NO: 50具有95%相同的核苷酸序列；并且 b.所述標記基因座包含至少一個關聯所述增強的MRCV感染抗性的等位基因。
9.鑒定和/或選擇表現出增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的種質中檢測標記基因座的等位基因,其中: a.所述標記基因座位于選自下列的染色體區間內: i.包含并側接PHM12615和PHM9452的染色體區間； i1.包含并側接PHM12615和PHM17281的染色體區間； ii1.包含并側接PHM12615和PHM1683的染色體區間； iv.包含并側接PHM15741和PHM9452的染色體區間；并且 b.所述等位基因關聯增強的MRCV感染抗性。
10.鑒定和/或選擇表現出增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的種質中檢測在一個或多個標記基因座處包含等位基因的單倍型，其中: a.所述一個或多個標記基因座位于染色體區間內，所述染色體區間包含并側接PHM15741 和 PHM9452 ;并且 b.所述單倍型關聯增強的MRCV感染抗性。
11.鑒定和/或選擇表現出增強的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括: a.獲得第一玉米植物，所述第一玉米植物具有至少一個標記基因座的等位基因，其中所述標記基因座位于選自下列的染色體區間內: i.包含并側接PHM12615和PHM9452的染色體區間； i1.包含并側接PHM12615和PHM17281的染色體區間；ii1.包含并側接PHM12615和PHM1683的染色體區間；和iv.包含并側接PHM15741和PHM9452的染色體區間；并且此外其中所述等位基因關聯增強的MRCV感染抗性；b.將所述第一玉米植物與第二玉米植物雜交；c.針對所述第一玉米植物的等位基因評價子代植物；以及d.鑒定和/或選擇具有所述第一玉米植物的等位基因的子代植物。
12.通過權利要求1- 11的方法中的任何方法鑒定和/或選擇的玉米植物。
全文摘要
本發明涉及鑒定和/或選擇玉米植物的方法和組合物，所述玉米植物具有新產生的斐濟病毒屬抗性或增強的斐濟病毒屬抗性，或易感于斐濟病毒屬，尤其是馬德里約柯托病毒(MRCV)和/或玉米粗縮病毒(MRDV)。所述方法使用分子遺傳標記鑒定、選擇和/或構建抗性植物或鑒定并反向選擇易感植物。通過本發明的方法產生的表現出新產生的斐濟病毒屬抗性或增強的斐濟病毒屬抗性(或由該病毒所導致的感染或疾病)的玉米植物也是本發明的特征。
文檔編號A01H1/04GK103220904SQ201180054738
公開日2013年7月24日 申請日期2011年11月10日 優先權日2010年11月17日
發明者A.托馬斯, S.拉克, T.馬丁, E.D.克雷夫 申請人:納幕爾杜邦公司