抗NogoA的抗體(“11C7”)及其藥物用途的制作方法

專利名稱：抗Nogo A的抗體(“11C7”)及其藥物用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及NogoA結合分子，例如單克隆抗體或者其Fab片段。
成人中樞神經系統(CNS)損傷后的神經元再生由于包蓋軸突的抑制性髓鞘質環境的存在和瘢痕組織的形成而受到限制。最近幾年中，CNS為何不能在損傷后自動修復的分子機制已經獲得重要的進展。髓鞘質中的抑制分子為軸突再生的主要障礙，尤其是在損傷后的早期。到目前為止，NogoA、髓鞘質相關糖蛋白(MAG)和髓鞘質少突膠質細胞糖蛋白(OMgp)已經描述為有效的神經突突起抑制因子。此外，髓鞘質還含有其他抑制性成分如硫酸軟骨素蛋白聚糖。Nogo-A為reticulon蛋白質家族的成員并且其具有命名為氨基-Nogo和Nogo-66的至少兩個生物學活性和藥學獨特的結構域。目前雖然對前者的受體位點尚不清楚，但已知Nogo-66通過神經元受體NgR在體外和體內抑制神經元生長。除了Nogo-66之外，MAG和OMgp也以高親和性與NgR結合并抑制神經突突起(neurite outgrowth)。
目前找尋的用于增強神經修復的潛在新研究方法包括使用酶即軟骨素酶ABC消化瘢痕組織，使用嗅覺包蓋細胞和干細胞以及蛋白質生長因子激發神經元生長的橋接技術。研究表明神經突突起抑制物通過調節胞內信號媒介如Rho而產生的封閉作用似乎為軸突生長抑制的關鍵連接，其中所述的Rho為膜結合的鳥苷三磷酸酶(GTPase)。環腺苷單磷酸(cAMP)在體外能消除髓鞘質相關的抑制并在體內誘導再生。使用NgR受體的肽抑制物(NEP1-40)在大鼠脊髓損傷后能誘導神經元再生和功能恢復。
除了使用上述方法外，人們的注意力也集中在特定單克隆抗體中和中樞及周圍神經系統的神經突突起抑制分子的用途上，尤其是中和NogoA的神經突突起抑制活性。這樣已經表明單克隆抗體IN-1或其IN-1 Fab片段在體外誘導神經突突起并在體內提高神經突長出和再生(Schwab ME等，(1996)Physiol.Rev.76，319-370)。通過檢測NogoA不同結構域的神經突突起抑制活性在該分子中描繪出了數個抑制結構域(Chen等，(2000)Nature 403，434-439；GrandPre等，(2000)Nature 403，439-444；Prinjha等，(2000)Nature 403，383-384；也見于實施例1中的詳細分析)。
天然免疫球蛋白或抗體包含通常為Y-型的多聚體分子，其在每一上臂的末端具有抗原結合位點。結構的其他部分尤其是Y的主干介導免疫球蛋白相關的效應功能。抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。重鏈和輕鏈都包含可變區和恒定區。抗原結合位點由與輕鏈可變區相聯系的重鏈可變區組成。重鏈和輕鏈的可變區具有相同的基本結構。更具體地，抗體的抗原結合特性主要由重鏈和輕鏈可變區中稱為高變區或互補決定區(CDRs)的三個特定區域決定。此三個高變區與四個構架區(FRs)相交替，其中所述構架區的序列相對保守并且不直接參與結合。CDRs形成環并通過主要為β-片層構象的構架區緊密鄰近地固定。重鏈的CDRs與相關的輕鏈CDRs基本組成了抗體分子的抗原結合位點。對組成FR或CDR區域的確定通常通過比較相同物種中產生的大量抗體的氨基酸序列而進行。鑒定CDR和FR區域的常規法則為本領域技術人員的常識并可在例如網頁(http//www.bioinf.org.uk/abs/)中找到。
現在人們驚奇地發現針對大鼠NogoA多肽片段(SEQ ID NO1)產生的新單克隆小鼠抗體(此后稱為“11C7”)并屬于IgG1型的抗體比現有技術的NogoA抗體主要在與包括人(homo sapiens)在內的不同物種的NogoA結合親和性方面和在特定抗體濃度下其較高的NogoA神經突突起中和活性方面具有更好的特性。此外現在可能構建其他與所述抗體具有相同高變區的NogoA結合分子。
因此本發明提供NogoA特定區域或表位的結合分子(此后稱為“本發明的結合分子”或簡單地稱為“結合分子”)。本發明的結合分子優選地以解離常數(Kd)＜1000nM，更優選地以Kd＜100nM，最優選地以Kd＜10nM結合人NogoA_623-640(產生11C7的直向同源片段；＝SEQ ID NO6)、人Nig-D20(與具有神經突突起抑制活性的NogoA最小片段直向同源，SEQ ID NO24)、人NogoA(SEQ ID NO5)或人NiG(為NogoA的最有效神經突突起抑制片段并且從人NogoA 186號氨基酸開始到1004號氨基酸結束，＝SEQ ID NO5)。可通過常規方法(定性測定法)顯示結合反應，例如實施例6所述的ELISA方法和實施例7所述的生物傳感器親和性方法。此外，與人NogoA的結合和幾乎更重要地功效可在神經突突起測定法中顯示，例如如下所述。
這樣在另一個優選的實施方案中結合分子(在培養基中濃度為1mg/ml，更優選地為0.1mg/ml，甚至更優選地為0.01mg/ml)與用不與人NogoA、人NiG、人Nig-D20或NogoA_623-640多肽(即具有＞1000nM的解離常數)結合的對照抗體處理的大鼠小腦粒細胞神經突數量相比，以至少20％，優選地50％，最優選地100％提高提取的大鼠脊髓蛋白質基質上的大鼠小腦粒細胞神經突數量。
另一優選的實施方案中本發明的結合分子包含至少一個抗原結合位點，所述抗原結合位點依次包含高變區CDR1-11C7、CDR2-11C7和CDR3-11C7；所述CDR1-11C7具有SEQ ID NO8氨基酸序列，所述CDR2-11C7具有SEQ ID NO9的氨基酸序列，且所述CDR3-11C7具有SEQ ID NO10的氨基酸序列，以及其直接等同物。
在本發明的另一方面，本發明的結合分子包含至少一個抗原結合位點，所述抗原結合位點a)依次包含高變區CDR1-11C7、CDR2-11C7和CDR3-11C7；所述CDR1-11C7具有SEQ ID NO8氨基酸序列，所述CDR2-11C7具有SEQ ID NO9氨基酸序列，且所述CDR3-11C7具有SEQ ID NO10氨基酸序列；或者b)依次包含高變區CDR1′-11C7、CDR2′-11C7和CDR3′-11C7，所述CDR1′-11C7具有SEQ ID NO11氨基酸序列，所述CDR2′-11C7具有SEQ ID NO12氨基酸序列，且所述CDR3′-11C7具有SEQ ID NO13氨基酸序列；或者c)其直接等同物。
在本發明的另一方面，本發明的結合分子至少包含a)依次包含高變區CDR1-11C7、CDR2-11C7和CDR3-11C7的第一結構域，其中所述CDR1-11C7具有SEQ ID NO8氨基酸序列，所述CDR2-11C7具有SEQ ID NO9氨基酸序列，且所述CDR3-11C7具有SEQ ID NO10氨基酸序列；和b)依次包含高變區CDR1′-11C7、CDR2′-11C7和CDR3′-11C7的第二結構域，其中所述CDR1′-11C7具有SEQ ID NO11氨基酸序列，所述CDR2′-11C7具有SEQ ID NO12氨基酸序列，且所述CDR3′-11C7具有SEQ ID NO13氨基酸序列；或者c)其直接等同物。
此外，本發明還提供了本發明的下列結合分子，其包含至少一個抗原結合位點，其中所述抗原結合位點包含a)11C7重鏈的可變部分(SEQ ID NO2)；或者b)11C7輕鏈的可變部分(SEQ ID NO3)，或其直接等同物。
當抗原結合位點既包含第一結構域也包含第二結構域時，所述結構域可位于同一多肽分子上或者，每一結構域優選地可位于不同的鏈上，第一結構域為免疫球蛋白重鏈或其片段的一部分并且第二結構域為免疫球蛋白輕鏈或其片段的一部分。
本發明結合分子的例子包括B-細胞或雜交瘤產生的抗體、嵌合的或人源化抗體或其任一片段，例如F(ab′)2；和Fab片段，也包括單鏈或單結構域抗體。
單鏈抗體由通過肽鍵共價連接的抗體重鏈和輕鏈可變結構域組成，其由10-30個氨基酸組成，優選地由15-25個氨基酸組成。因此這樣的結構不包括重鏈和輕鏈的恒定部分并且認為小肽間隔臂與全部恒定部分相比為較低抗原性的。“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其重鏈或輕鏈恒定區或都為人源的而重鏈和輕鏈的可變結構域均為非人(如鼠)源的。“人源化抗體”是指這樣的抗體，其高變區(CDRs)為非人(如鼠)源的，而免疫球蛋白的全部或基本上全部其他部分，例如恒定區和可變結構域的高度保守部分即構架區為人源的。然而人源化抗體可在與高變區相鄰的構架區的部分中保留少數幾個氨基酸的鼠序列。
高變區可與任一種構架區相連接，優選地與鼠或人源構架區相連接。適當的構架區由Kabat E.A.等(US department of health and humanservices，Public health service，National Institute of Health)在“Sequencesof proteins of immunological interest”中描述。結合分子的人重鏈恒定部分優選地為IgG4型，包括亞型，人輕鏈的恒定部分優選地為κ或者λ型，更優選地為κ型。
針對所有人中天然存在的蛋白質產生的單克隆抗體可在非人系統如小鼠中產生。作為其直接結果，雜種瘤產生的異源抗體在給人施用時引起不希望有的免疫反應，其主要由異源免疫球蛋白的恒定部分介導。這顯然限制了此類抗體的使用因為其不能長期施用。因此給人施用時使用不可能引起相當程度異源反應的單鏈、單結構域、嵌合或人源化抗體尤其優選。
綜上所述，本發明更優選的結合分子選自嵌合抗體，其至少包含a)一個免疫球蛋白重鏈或其片段，其包含(i)依次包含高變區CDR1-11C7、CDR2-11C7和CDR3-11C7的可變結構域和(ii)人重鏈的恒定部分或其片段；所述CDR1-11C7具有SEQ ID NO8的氨基酸序列；所述CDR2-11C7具有SEQ ID NO9的氨基酸序列，且所述CDR3-11C7具有SEQ ID NO10的氨基酸序列；和b)一個免疫球蛋白輕鏈或其片段，其包含(i)依次包含高變區CDR1′-11C7、CDR2′-11C7和CDR3′-11C7的可變結構域和(ii)人輕鏈恒定部分或其片段；其中所述CDR1’-11C7具有SEQ ID NO11的氨基酸序列，所述CDR2’-11C7具有SEQ ID NO12的氨基酸序列，且所述CDR3’-11C7具有SEQ ID NO13的氨基酸序列；或者其直接等同物。
備選地，本發明的結合分子可選自包含抗原結合位點的單鏈結合分子，其中所述抗原結合位點包含a)依次包含高變的CDR1-11C7、CDR2-11C7和CDR3-11C7的第一結構域；所述CDR1-11C7具有SEQ ID NO8的氨基酸序列；所述CDR2-11C7具有SEQ ID NO9的氨基酸序列，且所述CDR3-11C7具有SEQ ID NO10的氨基酸序列；和b)依次包含高變的CDR1′-11C7、CDR2′-11C7和CDR3′-11C7的第二結構域；其中所述CDR1’-11C7具有SEQ ID NO11的氨基酸序列，所述CDR2’-11C7具有SEQ ID NO12的氨基酸序列，且所述CDR3’-11C7具有SEQ ID NO13的氨基酸序列；和c)肽接頭，其與第一結構域的N-端末端和第二結構域的C-端末端結合或者與第一結構域的C-端末端和第二結構域N-端末端結合；或者其直接等同物。
眾所周知，氨基酸序列的微小改變如一個或數個氨基酸的缺失、添加或替代可引起原始蛋白質的具有基本相同特性的等位形式。這樣術語“其直接等同物”或者是指本發明的任一單結構域結合分子(分子X)(i)其中結合分子的每一高變區CDR1、CDR2和CDR3與CDR1-11C7(SEQ ID NO8)、CDR2-11C7(SEQ ID NO9)和CDR3-11C7(SEQ ID NO10)的等同高變區至少50％或80％同源，優選地至少90％同源，更優選地至少95、96、97、98、99％同源，而CDR1與CDR1-11C7等同，CDR2與CDR2-11C7等同，CDR3與CDR3-11C7等同；(ii)其能與人NogoA、人NiG、人NiG-D20或人NogoA_623-640優選地以解離常數(Kd)＜1000nM，更優選地以Kd＜100nM，最優選地以Kd＜10nM結合；或者是指每個結合位點具有至少兩個結構域的本發明的任一結合分子(分子X′)(iii)其中高變區CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’的每一個至少與CDR1-11C7(SEQ ID NO8)、CDR2-11C7(SEQ ID NO9)、CDR3-11C7(SEQ ID NO10)、CDR1′-11C7(SEQ ID NO11)、CDR2′-11C7(SEQ ID NO12)和CDR3′-11C7(SEQ ID NO13)的等同高變區至少50％或80％同源，優選地至少90％同源，更優選地至少95、96、97、98、99％同源)，而CDR1與CDR1-11C7等同，CDR2與CDR2-11C7等同，CDR3與CDR3-11C7等同，CDR1’與CDR1’-11C7等同，CDR2’與CDR2’-11C7等同，CDR3’與CDR3’-11C7等同；(iv)其能與人NogoA、人NiG、人NiG-D20或人NogoA_623-640優選地以解離常數(Kd)＜1000nM，更優選地以Kd＜100nM，最優選地以Kd＜10nM結合；這樣本發明進一步的實施方案為例如能以＜1000nM的解離常數與人NogoA、人NiG、人NiG-D20或人NogoA_623-640結合并包含至少一個抗原結合位點的結合分子，所述抗原結合位點●依次包含高變區CDR1、CDR2和CDR3，其中每一高變區與其等同高變區CDR1-11C7(SEQ ID NO8)、CDR2-11C7(SEQ ID NO9)和CDR3-11C7(SEQ ID NO10)至少50％同源，優選地80、90、95、96、97、98、99％同源；或者●依次包含高變區CDR1’、CDR2’和CDR3’，其中每一高變區與其等同高變區CDR1’-11C7(SEQ ID NO11)、CDR2’-11C7(SEQ ID NO12)和CDR3’-11C7(SEQ ID NO13)至少50％同源，優選地80、90、95、96、97、98、99％同源。
此外，與人NogoA、人NiG、人NiG-D20或人NogoA_623-640結合的結合分子具有＜1000nM的解離常數并包含●依次包含高變區CDR1、CDR2和CDR3的第一抗原結合位點，其中高變區的每一個與其等同高變區CDR1-11C7(SEQ ID NO8)、CDR2-11C7(SEQ ID NO9)和CDR3-11C7(SEQ ID NO10)至少50％同源，優選地80、90、95、96、97、98、99％同源；●依次包含高變區CDR1’、CDR2’和CDR3’的第二抗原結合位點，其中高變區的每一個與其等同高變區CDR1’-11C7(SEQ ID NO11)，CDR2’-11C7(SEQ ID NO12)和CDR3’-11C7(SEQ ID NO13)至少50％同源，優選地80、90、95、96、97、98、99％同源。
此解離常數可方便地通過包括例如實施例7中的生物傳感器親和性方法在內的多種鑒定法檢測。此外，結合分子的結合和功能作用可在生物測定中顯示，例如如下所述。
人重鏈的恒定部分可為γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2、δ或ε型，優選地為γ型，更優選地為γ4型，而人輕鏈的恒定部分可為κ或λ型(其包括λ1、λ2和λ3亞型)但優選地為κ型。Kabat等(見上文)給出了所有這些恒定部分的氨基酸序列。
本發明結合分子的偶聯物，例如酶或毒素或放射性同位素偶聯物也包括在本發明的范圍之內。
“多肽”除非在此特殊說明，包括包含通過肽鍵互相連接的氨基酸并具有從N-端末端開始到C-端末端結束的氨基酸序列的任何肽或蛋白質。本發明的多肽優選地為單克隆抗體，更優選地為嵌合(也稱為V-移植的(grafted))或人源化(也稱為CDR-移植的)單克隆抗體。人源化(CDR-移植的)單克隆抗體可包括或不包括引入受體抗體構架(FR)序列的其他突變。
在此使用的多肽功能衍生物包括和本發明的多肽具有共同性質上的生物學活性的分子，即具有與人NogoA、人NiG、人NiG-D20或人NogoA_623-640結合的能力。功能衍生物包括根據本發明的多肽的片段和肽類似物。片段包含根據本發明的多肽序列之內的區域，例如指定序列之內的區域。術語“衍生物”用于定義氨基酸序列變體和根據本發明的多肽的共價修飾，例如指定序列的共價修飾。根據本發明的多肽的功能衍生物，例如指定序列的功能衍生物，例如輕鏈和重鏈高變區的功能衍生物，與根據本發明的多肽的氨基酸序列，例如指定序列的氨基酸序列優選地具有至少約65％，更優選地至少約75％，甚至更優選地至少約85％，最優選地至少約95、96、97、98、99％的全部序列同源性，并且基本保留與人NogoA、人NiG、人NiG-D20或人NogoA_623-640結合的能力。
術語“共價修飾”包括根據本發明的多肽的修飾，例如指定序列的修飾；或其帶有有機蛋白質或非蛋白質衍生劑的片段，與異源多肽序列的融合和翻譯后修飾。共價修飾多肽，例如特定序列的共價修飾多肽，仍然具有通過交聯與人NogoA、人NiG、人NiG-D20或人NogoA_623-640結合的能力。共價修飾一般通過使目的氨基酸殘基與能與所選側鏈或末端殘基反應的有機衍生劑反應而引入，或通過在所選宿主細胞中發揮功能的翻譯后修飾機制引入。特定翻譯后修飾為重組宿主細胞對表達的多肽作用的結果。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基經常翻譯后脫酰胺產生谷氨酰和天冬氨酰殘基。備選地，這些殘基在微酸性條件下脫酰胺。其他翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰、酪氨酸或蘇氨酰殘基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈α-氨基的甲基化，參見例如T.E.Creighton，蛋白質結構和分子特性，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，79-86頁(1983)。共價修飾例如包括包含根據本發明的多肽的融合蛋白，例如指定序列和其氨基酸序列變體的多肽的融合蛋白，如免疫粘附素和與異源信號序列的N-端融合。
與天然多肽和其功能衍生物相關的“同源性”在此定義為在比對序列并如果需要為達到最大百分比同源性而引入缺口之后，并且不考慮任何保守替代是序列同一性的部分時，候選序列中與相應天然多肽殘基相同的氨基酸殘基的百分比。N-端或C-端延伸和插入都不解釋為降低同一性或同源性。比對的方法和計算機軟件為人們所熟知的。
“氨基酸”指所有天然存在的L-α-氨基酸，例如并包括D-氨基酸。氨基酸通過熟知的單字母或三字母名稱定義。
術語“氨基酸序列變體”指與根據本發明的多肽例如指定序列相比在其氨基酸序列中存在一些差別的分子。根據本發明的多肽的氨基酸序列變體，例如指定序列的氨基酸序列變體，仍然具有與人NogoA或人NiG或更優選地與NogoA_623-640結合的能力。替代變體為在根據本發明的多肽例如指定序列的同一位點具有至少一個氨基酸殘基去除和在其位置有不同氨基酸插入。這些替代可為單替代，其中分子中只有一個氨基酸發生替代，或者為多替代，其中同一分子中兩個或更多個氨基酸發生替代。插入變體為在緊鄰根據本發明的多肽例如指定序列中的特定位點的氨基酸處插入一個或更多個氨基酸。與氨基酸緊鄰指與氨基酸的α-羧基或者α-氨基官能團連接。缺失變體為去除根據本發明的多肽例如指定序列中的一個或更多個氨基酸去除的變體。缺失變體通常缺失所述分子特定區域中的一個或兩個氨基酸。
本發明的結合分子可通過重組DNA技術產生。考慮到此，必需構建一個或更多個編碼結合分子的DNA分子，置于適當控制序列之下并轉移入適當宿主生物體以表達。
以非常通用的方式相應提供了(i)這樣的DNA分子，其編碼本發明的單結構域結合分子、本發明的單鏈結合分子、本發明結合分子的重鏈或輕鏈或其片段；(ii)本發明DNA分子的用途，用于通過重組方法生產本發明的結合分子。
現有技術水平為基于在此提供的信息例如高變區的氨基酸序列和編碼其的DNA序列，技術人員能合成本發明的DNA分子。例如在EP 239 400中描述了構建可變結構域基因的方法并可簡述如下克隆編碼任何特異性單克隆抗體可變區的基因。確定編碼構架區和高變區的DNA片段然后去掉編碼高變區的DNA片段以便編碼構架區的DNA片段在連接處與適當的限制酶切位點融合在一起。限制酶切位點可在適當位點使用常規方法通過DNA分子的突變產生。雙鏈合成CDR盒通過根據上面給出的CDR1-11C7、CDR2-11C7、CDR3-11C7、CDR1’-11C7、CDR2’-11C7和CDR3’-11C7序列的DNA合成制備。這些盒以粘末端提供以便其可在連接處能通過獲得編碼免疫球蛋白可變結構域的DNA分子的常規方法與構架連接。
此外，不必從生產的雜交瘤細胞系得到mRNA以獲得編碼本發明單克隆抗體的DNA構建體。這樣PCT申請號WO 90/07861提供了只給出基因核苷酸序列的文字信息通過重組DNA技術產生單克隆抗體的全部說明。
方法包含合成大量寡核苷酸，其通過PCR方法擴增和剪接以得到所需的DNA序列。
包含適當啟動子或編碼重鏈和輕鏈恒定部分的基因的表達載體是公開可獲得的。這樣一旦本發明的DNA分子得到制備其可方便地轉移入適當的表達載體中。
編碼單鏈抗體的DNA分子也可通過常規方法制備，例如如WO88/1649中所述。
在本發明特定的實施方案中，產生一些本發明結合分子的重組方法包括下述的第一和第二DNA構建體第一DNA構建體編碼重鏈或其片段并包含a)編碼交替包含構架區和高變區的可變結構域的第一部分，所述高變區依次包含DNA-CDR1-11C7(SEQ ID NO15)、DNA-CDR2-11C7(SEQ ID NO16)和DNA-CDR3-11C7(SEQ ID NO17)；此第一部分從編碼可變結構域第一個氨基酸的密碼子開始并以編碼可變結構域最后一個氨基酸的密碼子結束，b)編碼重鏈恒定部分或其片段的第二部分，其從編碼重鏈恒定部分第一個氨基酸的密碼子開始并以編碼恒定部分或其片段的最后一個氨基酸的密碼子束。
第二部分優選地編碼人重鏈的恒定部分，更優選地編碼人γ4鏈的恒定部分。此第二部分可為基因組來源(包含內含子)的DNA片段或cDNA片段(無內含子)。
第二DNA構建體編碼輕鏈或其片段并包含a)編碼交替包含構架區和高變區的可變結構域的第一部分；所述高變區依次包含DNA-CDR1′-11C7(SEQ ID NO17)、DNA-CDR2′-11C7(SEQ ID NO18)和DNA-CDR3′-11C7(SEQ ID NO19)，此第一部分從編碼可變結構域第一個氨基酸的密碼子開始并以編碼可變結構域最后一個氨基酸的密碼子結束，以及b)編碼輕鏈恒定部分或其片段的第二部分，其從編碼輕鏈恒定部分第一個氨基酸的密碼子開始并以編碼恒定部分或其片段最后一個氨基酸的密碼子結束，其后為無義密碼子。
第二部分優選地編碼人輕鏈的恒定部分，更優選地編碼人κ鏈的恒定部分。
第一和第二DNA構建體有利地包含第三部分，其位于第一部分的上游并編碼前導肽部分；此第三部分從編碼前導肽的第一個氨基酸的密碼子開始并以編碼前導肽的最后一個氨基酸結束。此肽為宿主生物體分泌鏈所需，其表達并隨后為宿主生物體去除。第一DNA構建體的第三部分優選地編碼具有與SEQ ID NO21所示重鏈前導序列的氨基酸序列(從-19位氨基酸開始并以-1位氨基酸結束)基本相同的氨基酸序列的前導肽。第二DNA構建體的第三部分也優選地編碼具有SEQ ID NO23所示氨基酸序列的前導肽(輕鏈，從-18位氨基酸開始并以-1位氨基酸結束)。
每一DNA構建體位于適當控制序列的控制之下，尤其是適當啟動子的控制之下。可使用任何種類的啟動子，條件是其適合于所轉入DNA構建體以表達的宿主生物體。然而如果在哺乳動物細胞中表達，尤其優選使用免疫球蛋白基因的啟動子。
目的抗體可在細胞培養物中或轉基因動物中產生。適當的轉基因動物可根據常規方法獲得，其中所述的常規方法包括顯微注射置于適當控制序列下的第一和第二DNA構建體到卵細胞中，轉移如此制備的卵細胞到適當的假孕雌性個體并選自表達目的抗體的后代。
當抗體鏈需要在細胞培養物中產生時，DNA構建體必需首先插入單表達載體中或插入兩個獨立但相容的表達載體中，后一可能性為優選。
因此本發明也提供了能在原核或真核細胞系中復制的表達載體，其包含至少一個上述DNA構建體。
然后將含有DNA構建體的每一表達載體轉入適當的宿主生物體中。當DNA構建體分別插到兩個表達載體上時，其可分別轉移，例如每種細胞一類載體，或者共轉移，此后一可能性為優選。適當的宿主生物體可為細菌、酵母或哺乳動物細胞系，后者為優選。更優選地，哺乳動物細胞系為淋巴樣來源的，例如骨髓瘤、雜交瘤或普通永生的但不表達任何內源抗體重鏈或輕鏈的B-細胞。
宿主生物體每個細胞含有大量拷貝的載體也為優選。如果宿主生物體為哺乳動物細胞系，此所需目的可通過根據常規方法擴增拷貝數量實現。擴增方法通常由選擇增加對藥物的抗性組成，所述抗性為表達載體編碼。
本發明的另一方面提供了產生本發明多鏈結合分子的方法，其包括(i)培養用本發明第一和第二DNA構建體轉化的生物體并且(ii)從培養物中回收本發明的活性結合分子。
備選地，重鏈和輕鏈可分別回收并在體外再折疊之后重建成活性結合分子。重建方法為本領域所熟知；方法的例子尤其在EP 120 674中或EP125 023中提供。因此方法也可包括(i)培養用本發明的第一DNA構建體轉化的第一生物體并從培養物中回收所述重鏈或其片段(ii)培養用本發明的第二DNA構建體轉化的第二生物體并從培養物中回收所述輕鏈或其片段(iii)從(i)中獲得的重鏈或其片段和從(ii)中獲得的輕鏈或其片段體外重建本發明的活性結合分子。
以類似的方式還提供了產生本發明單鏈或單結構域結合分子的方法，其包括(i)培養用分別編碼本發明的單鏈或單結構域結合分子的DNA構建體轉化的生物體，和(ii)從培養物中回收所述分子。
本發明的結合分子表現非常好的神經修復活性如例如粒細胞神經突突起模型中顯示的。
1.粒細胞神經突突起鑒定法(體外)來自解離小腦粒細胞的神經突突起如(Niederst等，(1999)J.Neurosci.198979-8989)所述確定。簡言之，從去頭的5-7天齡大鼠取出小腦并通過胰蛋白酶處理解離。為降低成纖維細胞污染，細胞預鋪到細菌平皿上。然后在4孔(Huber & Co AG，Rheinach，Basel)Greiner組織培養皿(孔表面1cm2)中在培養基中(具有B27的Neurobasal血清替代品，Invitrogen)每孔培養75,000個細胞。培養皿用多聚-L-賴氨酸(Sigma)包被。從成鼠總脊髓勻漿物Chaps提取的蛋白質(Spillmann等，(1998)J.Biol.Chem.27319283-19293)以蛋白質濃度每孔0.5到0.8μg 4℃包被過夜并清洗。然后本發明的結合分子對檢測底物預孵育30分鐘并在細胞加入前去除。加入小腦粒細胞并且孵育24小時。2ml的4％緩沖甲醛緩慢加入培養皿以終止實驗。然后培養物通過免疫熒光染色顯示生長相關蛋白質GAP-43并用Hoechst顯示細胞核(粒細胞用Hoechst染色以觀察是否所有細胞具有神經突(神經突用抗GAP-43觀察))。在Zeiss Axiophot熒光顯微鏡上用40x物鏡于每孔上部、下部和側緣的特定距離隨機取三張圖片。在編號并隨機排列的照片上計算范圍之內所有的神經突。反應(粒細胞神經突的突起)在每孔約0.1-10μg總蛋白范圍(特定制品的比活性在此范圍內變化)內為劑量依賴的。
可觀察到以上通過與本發明的結合分子預孵育制備的脊髓提取物在非允許環境中小腦粒細胞神經突突起的增強。例如下面給出了粒細胞神經突突起模型中小鼠11C7-IgG1抗體中和作用的典型特征分析1每孔1μg包被的大鼠髓磷脂 每個范圍內的神經突百分比無抗體 80,5 100％+小鼠IgG86,5 108％11C7 250μg/ml 160199％分析2每孔8μg包被的大鼠髓磷脂(制品2) 每個范圍內的神經突百分比無抗體 20 100％+小鼠IgG 17,3 86,5％11C7 250μg/ml 31 155％11C7 75μg/ml26 130％11C7 7,5μg/ml 26 130％本發明分子的中和活性也可通過測量體內脊髓損傷模型中再生芽和神經突突起如下進行評估。
2.脊髓損傷模型(體內)
成年路易斯大鼠通過在第八胸椎水平雙面橫切脊髓背側部分進行顯微外科損傷。椎板切除術、麻醉法和外科學技術在Schnell和Schwab 1993中描述(Eur.J.Neurosci.51156-1171)。對照或本發明的結合分子通過兩種不同的途徑應用或者通過植入106個新鮮收獲的雜交瘤細胞到大腦皮層的一側中(移植動物)或者備選地，通過植入心室內的導管連接到皮下植入的2ml Alzet(Alza Corporation，Palo Alto)泵(帶泵動物(pumpanimals))。-雜交瘤移植動物大鼠用環孢菌素A抑制免疫反應7-10天并于損傷后14天通過用4％緩沖的福爾馬林穿心灌注處死。-帶泵動物本發明的結合分子(例如以3.3mg/ml施用小鼠11C7)注入2ml泵以0.5μl/小時的速度遞送到側腦室兩周。脊髓損傷時植入泵并且大鼠在兩周后處死。
神經解剖學追蹤運動和感覺皮層脊髓束通過向與泵或移植物相反的一面的皮層注射順向示蹤物生物素葡聚糖胺(BDA)追蹤。BDA在10-14天內運輸到脊髓并如Brsamle等(2000 J.Neurosci.208061-8068)所述用二氨基苯聯胺(DAB)作為底物觀察。
解剖學結果評價使用兩種評價方法使用了兩種評估方法半定量方法和定量方法。出芽和再生強度的半定量估計使用下列說明評價編號的隨機混合的動物全部矢狀切面系列的損傷的再生芽突起的存在和密度再生芽為從橫切CST發出的纖維；在進程中其為長的，不規則的，比正常的灰質側枝較少分支，并且其朝向損傷周圍和在損傷周圍的腹側或側面生長。再生芽經常終止在生長錐中，其為小的球狀的或大的分支的。出芽的密度對每一動物分為0-3級。-長距離再生認為能穿過損傷到尾部脊髓中的纖維為長距離再生纖維。其從損傷位點的最大距離可以測量，但經常為最小距離因為經常存在小腹索CST的一些非損傷纖維；其分支與再生軸突的混合使之難以區分。
纖維計數(定量分析)位于橫切CST末端-0.5mm喙部的紋在灰質交互部分上形成，并且計算所有CST纖維的交互面(正常側突或芽)。類似的紋位于損傷尾部距離損傷中心+0.5、+2和+5mm處。計算交叉纖維并且3個水平面的相加求和反應尾部脊髓中的CST纖維。這些尾部纖維除以CST末端-0.5mm喙部的纖維數量以獲得比例。
脊髓傷害兩周后破壞約40％脊髓T8節，主要在背部一半，包括兩種主要的CSTs對照動物中追蹤CST表明神經束適中程度的反應性出芽。這個現象與文獻中熟知的對傷害反應的自發出芽相對應。用本發明結合分子處理或用泵遞送本發明結合分子的受傷害大鼠可表現在損傷位置提高的出芽和損壞神經突的損壞軸突神經突突起的再生。
因此本發明也提供(i)本發明的結合分子在哺乳動物神經系統神經修復中的用途，尤其在人神經系統修復中的用途，(ii)修復哺乳動物神經系統神經的方法，尤其是修復人神經系統神經的方法，其包括對需要此類治療的患者施用有效劑量的本發明的結合分子，或者(iii)用于哺乳動物神經系統神經修復的藥物組合物，尤其是用于人神經系統神經修復的藥物組合物，其包含本發明的結合分子和可藥用載體或稀釋劑。
本發明的結合分子尤其對軸突再生和提高神經纖維損壞后的出芽有用。這樣本發明的分子尤其在人受試者中有廣泛的用途。例如本發明的結合分子在治療周圍神經系統(PNS)和中樞神經系統(CNS)的多種疾病有用，例如尤其在神經退行性變疾病如阿爾茨海默病、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)、Lewy樣疾病或其他普通癡呆、顱、腦、脊髓損傷、中風后疾病或脫髓鞘疾病。此類脫髓鞘疾病包括但不限于多發性硬化、單相脫髓鞘、腦脊髓炎、多灶性腦白質炎、全腦炎、Marchiafava-Bignami氏癥、腦橋myelmolysis、腎上腺腦白質失氧癥、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、海綿狀腦病、亞歷山大病、白質海綿狀變性病、異染性腦白質營養不良和克臘伯氏病。在一個實例中，本發明結合分子的施用可用于治療與NogoA蛋白相關的脫髓鞘疾病。另一個實例中，表達本發明結合分子的細胞可移植到定點脊髓傷害以輔助傷害位點的軸突生長。此類移植細胞提供了傷害或損傷之后恢復脊髓功能的方法。此類細胞包括嗅覺包蓋細胞和不同血統胎神經或組織移植物的干細胞。
此外，本發明的結合分子對治療退化視覺疾病有用，其中所述的退化視覺疾病可直接或間接地涉及視網膜或角膜細胞的退化，其包括一般的缺血型視網膜病、前部缺血型視神經病、所有形式的視神經炎、老年黃斑變性、糖尿病視網膜病變、黃斑囊樣水腫(CME)、斯格達氏癥、Best′s卵黃樣視網膜退化、Leber′s先天性黑蒙病和其他遺傳性視網膜退化、病理性近視、早熟視網膜病和Leber′s遺傳性視神經病、視網膜移植或折射角膜外科手術的隨后影響和皰疹角膜炎。
此外，表明NogoA在精神病疾病，尤其是精神分裂癥和抑郁癥中發揮作用。因此本發明的結合分子對治療精神病尤其是精神分裂癥和抑郁癥有用。
本發明的結合分子可以與其他制劑單獨、或聯合或依次聯合地提供。例如，本發明的結合分子可與抗炎癥劑如但不限于中風和脊髓傷害之后作為阻止進一步神經損傷和抑制軸突再生的皮質類固醇、神經營養因子如NGF、BDNF或者其他用于神經退化疾病的藥物如ExelonTM或Levodopa聯合施用。正如在此使用的，當兩制劑以使兩制劑同時發揮作用的方式同時施用或分別施用時稱為兩種制劑聯合施用。
為治療精神病，尤其是精神分裂癥或抑郁癥，本發明的結合分子可單獨提供或與尤其是與選自以下的其它制劑聯合(a)選自巴比妥酸鹽及其衍生物、苯二氮類、氨甲酰、乙內酰脲、琥珀酰亞胺、丙戊酸和其他脂肪酸衍生物及其他抗癲癇藥物的抗癲癇藥物，(b)常規精神抑制藥，(c)非典型精神抑制藥和(d)抗抑郁劑。
在此使用的術語“巴比妥酸鹽及其衍生物”包括但不限于鎮靜安眠劑和去氧巴比妥。在此使用的術語“苯二氮類”包括但不限于氯硝安定、安定和洛拉酮。在此使用的術語“氨甲酰”包括但不限于氨甲酸苯、奧卡西產和10-羥基-10，11-二氫氨甲酸苯。在此使用的術語“乙內酰脲”包括但不限于苯妥英。在此使用的術語“琥珀酰亞胺”包括但不限于乙琥胺和甲琥胺。在此使用的術語“丙戊酸和其他脂肪酸衍生物”包括但不限于丙戊酸鈉鹽、鹽酸替加賓(Tiagabine)一水化物和vigrabatrine。術語“其他抗癲癇藥物”正如在此使用的包括但不限于左乙拉西坦、拉莫三嗪、加巴噴丁和非氨酯。
術語“常規精神抑制藥”正如在此使用的包括但不限于氟哌丁苯和氟非那嗪。
術語“非典型精神抑制藥”正如在此使用的涉及氯氮平、利培酮、奧氮平、奎太平、齊拉西酮(Ziprasidone)和阿利哌唑(aripiprazol)。
術語“抗抑郁劑”正如在此使用的包括但不限于選擇性5羥色胺再攝入抑制劑(SSRI’s)或選擇性5羥色胺和去甲腎上腺素再攝入抑制劑(SNRI-s)。適于本發明的SSRI’s可選自氟西汀、氟伏沙明(fluvoxamine)、舍曲林、帕羅西汀、氫溴酸西酞普蘭和草酸依地普侖。
通過代碼編號、屬名或商品名確定的活性成分結構可從“The MerckIndex”的標準綱要現行版獲得或者從數據庫例如Patents International(例如IMS World Publications)得到。其相應的目錄在此引用作為參考。本領域任何技術人員完全可以鑒定活性成分并基于這些參考文獻同樣能在體外和體內于常規檢測模型中加工和檢測藥物指標和性能。
對上面提到的指標，適當的劑量當然可依賴于例如本發明所用的特定分子、施用方式和治療疾病的性質和嚴重性而改變。本發明的結合分子可方便地通過泵或作為治療劑在損傷部位注射施用，例如其可顱內直接施用到CNS中或鞘內直接施用到脊柱內而至損傷部位。
本發明的藥物組合物可以常規方式生產。例如包含本發明分子的根據本發明的組合物優選地以凍干形式提供。其可溶于適當的水成載體如注射用無菌水或無菌生理鹽水緩沖液以立即施用。
為輔助組成適當的組合物，本發明的結合分子和任選地增強本發明結合分子作用的第二藥物可與施用說明書一起在同一容器中分別包裝，用于混合或同時施用。任選的候選第二藥物在上面提供。
本發明結合分子與生長因子如NGF聯合的協同作用可在體內通過上述脊髓損傷模型證明。
附圖簡述

圖1序列比較不同物種NiG的序列比較，顯示了11C7mAb的免疫原性肽序列。
通過參考下列實施例本發明可更全面的理解。然而其不應解釋為限制本發明的范圍。
下列實施例中所有溫度為攝氏度形式(℃)。
實施例中關注的單克隆抗體為包含輕鏈可變部分(SEQ ID NO3)和重鏈可變部分(SEQ ID NO2)的本發明結合分子。
使用了下列縮寫詞ELISA 酶聯免疫吸附檢測FACS 熒光激活細胞分選器FITC 異硫氰酸熒光素FBS 胎牛血清HCMV 人巨細胞病毒啟動子IgG 免疫球蛋白同種型GMAb 單克隆抗體PBS 磷酸鹽緩沖液PCR 聚合酶鏈式反應實施例1NiG-D20(SEQ ID NO24)為NogoA神經突突起的抑制片段之一方法a)大鼠Nogo-A缺失文庫缺失構建體使用內在限制酶切位點通過核酸外切酶III/綠豆核酸酶處理，并用大鼠Nogo-中的大鼠Nogo-A-特異性引物的PCR(WO00/31235中的方法)建立大鼠Nogo-A(1-1163氨基酸；此后顯示的DNA涉及大鼠NogoA的氨基酸序列(SEQ ID NO26)，例如1-1163氨基酸指編碼大鼠NogoA多肽序列從第1個氨基酸開始到第1163個氨基酸結束的多肽的cDNA構建體)，大鼠Nogo-B(1-172+976-1163氨基酸)，大鼠Nogo-C(Nogo-C N-端11氨基酸+976-1163氨基酸)，大鼠Nogo-66(1019-1083氨基酸)，大鼠GST-Nogo-66(1026-1091氨基酸)，大鼠NiR-G(1-979氨基酸)，大鼠NiR(1-172)，大鼠NiR-D1(1-31氨基酸)，大鼠NiR-D2(59-172氨基酸)，大鼠NiR-D3(1-31+59-172氨基酸)，大鼠EST-Nogo1(762-1163氨基酸)，大鼠NiG(174-979氨基酸)，，大鼠NiG-D1(174-909氨基酸)，大鼠NiG-D2(174-865氨基酸)，大鼠NiG-D3(172-723氨基酸)，大鼠NiG-D4(172-646氨基酸)，大鼠NiG-D5(293-647氨基酸)，大鼠NiG-D6(763-975氨基酸)，大鼠NiG-D7(174-235+294-979氨基酸)，大鼠NiG-D8(218-653氨基酸)，大鼠NiG-D9(172-259+646-974氨基酸)，大鼠NiG-D10(293-979氨基酸)，大鼠NiG-D11(209-268氨基酸)，大鼠NiG-D12(198-233氨基酸)，大鼠NiG-D13(174-216氨基酸)，大鼠NiG-D14(174-260氨基酸)，大鼠NiG-D15(174-190+493-979氨基酸)，大鼠NiG-D16(174-190+621-979氨基酸)，大鼠NiG-D17(174-190+259-979氨基酸)，大鼠NiG-D18(174-190+263-979氨基酸)，大鼠NiG-D19(763-865氨基酸)，大鼠NiG-D20(544-725氨基酸)，大鼠NiG-D21(812-918氨基酸)，大鼠NiG-D22(866-975氨基酸)，大鼠NiG-D23(914-975氨基酸)，大鼠NiG-D24(544-685氨基酸)，大鼠NiG-D25(614-725氨基酸)，大鼠NiG-D26(544-613氨基酸)，大鼠NiG-D27(581-648氨基酸)，大鼠NiG-D28(614-685氨基酸)，大鼠NiG-D29(648-725氨基酸)，大鼠NiG-D30(682-725氨基酸)，大鼠NiG-D31(544-580氨基酸)，大鼠NiG-D32(581-613氨基酸)，大鼠NiG-D33(614-648氨基酸)，大鼠NiG-D34(648-685氨基酸)，大鼠NiG-D35(260-556氨基酸)，大鼠NiG-D36(260-415氨基酸)。NiR-G和NiR-a來源于限制酶消化的Nogo-A-pET28。NiG來源于限制酶消化和綠豆核酸酶處理的NiR-G。NiG-D1、-D3、-D4、-D5、-D7、-D8、-D9、-D10來源于限制酶消化的NiG-pET28。NiG-D15、-D16、-D17、-D18來源于外切核酸酶III消化的NiG-pET28。NiR-b、NiR-D1、-D2、-D3來源于用NiR-a-pET28作為模板的PCR。NiG-D2、-D6、-D11、-D12、-D13、-D14、-D19、-D20、-D21、-D22、-D23、-D24、-D25、-D26、-D27、-D28、-D29、-D30、-D31、-D32、-D33、-D34、-D35、-D36來源于用NiG-pET28作為模板的PCR。所有構建體亞克隆到pET28。pET28用于上面提到的所有構建體。pGEX-6P用于周質表達大鼠NiG的GST-Nogo66和pET26。人GST-Nogo-66(人Nogo-A的1055-1120氨基酸)通過以人NogoA DNA(SEQ ID NO4)作為模板的PCR克隆。然后缺失構建體克隆到pET28(Novagen)載體、pGEX-6P(Amersham Pharmacia Biotech)和pET26載體(Novagen)中。人GST-Nogo-66與GrandPré等(見上文)出版的GST-nogo蛋白質相對應。合成大鼠肽4EELVQKYSNSALGHVNSTIKELRRL(SEQ ID NO27)與人肽4(已表明人肽4為Nogo-66結構域的抑制性區域(GrandPré等，2000))相對應。直向同源的大鼠肽具有單一錯配C-＞S(見GrandPré等，2000(見上文)中的肽4序列)。合成的富含Pro/Ser肽PSSPPPSSPPPSSPPPS(SEQ ID NO28)和大鼠肽4已得到產生并通過Primm SA進行了HPLC純化。人NogoA_623-640(SEQ ID NO6)已得到合成并由Research Genetics Inc.純化。
b)人Nogo-A表達構建體(pRK7-hNogo-A)的產生λgt10(Clontech)中構建的人cDNA文庫使用常規方法用重復篩選組(duplicate filter sets)篩選。人Nogo-A片段使用常規方案從人腦總cDNA(Clontech)中PCR擴增并隨后克隆到pBluescript中，消化，分離或直接用作篩選探針。400bp的XhoI/SmaI片段用作5’探針，3’探針用引物CA-NA-2F5’-AAG CAC CATTGA ATT CTG CAG TTC C-3’(SEQ ID NO29)和CA-NA-3R5’-AACTGC AGT ACT GAG CTC CTC CAT CTG C-3’(SEQ ID NO30)擴增。分離陽性克隆，亞克隆并測序驗證。為獲得全長人Nogo-A cDNA，使用人Nogo-A序列中單一的EcoRI限制酶切位點組合重疊克隆并亞克隆到Bluescript載體中，命名為Pbsnogoa。為獲得pRK7-hNogo-A，全長cDNA通過定向克隆插入真核表達載體pRK-7中。
c)用于細菌產生的人NiG(hNiG)表達質粒(pET28a-hNiG)的產生hNiG編碼DNA片段自Pbsnogoa在PCR擴增各自編碼區之后按N-端His-和T7-tag閱讀框亞克隆到BamHI/XhoI消化的pET28a(Novagen)中以細菌表達，其使用引物正向5’-GTC GCG GAT CCA TGG AGA CCC TTTTTG CTC TTC-3’(SEQ ID NO31)；反向5’-GTT CTC GAG TTA TGAAGT TTT ACT CAG-3’(SEQ ID NO32)。最終質粒命名為pET28a-hNiG。然后hNiG在大腸桿菌(E.coli)BL21pRP中通過用1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPGT)誘導表達。
d)小鼠NiG-外顯子3(mNiG-exon3)表達質粒的產生編碼小鼠外顯子3的區域從小鼠基因組BAC模板擴增，使用引物正向5’-GTG CGG ATCCAT GGA TTT GAA GGA GCA GC-3’(SEQ ID NO33)；反向5’-GTTTCT CGA GTG AAG TTT TAT TCA GCT C-3’(SEQ ID NO34)并亞克隆到pET28a的BamHI/XhoI克隆位點中。最終質粒構建體命名為pET28a-mNiG-exon3。
猴NiG的克隆從冷凍猴腦組織中分離PolyA RNA并使用oligo dT引物合成cDNA。覆蓋cDNA5’和3’區域的兩個重疊片段使用序列特異引物和校正讀碼酶通過PCR擴增。引物使用人NiG cDNA的已知序列設計。為擴增5’片段，引物為5′-TCCACCCCGGCCGCGCCCAA-3′(SEQ IDNO35)和5′-AATGATGGGCAAAGCTGTGCTG-3′(SEQ ID NO36)，為擴增3’-片段引物為5′-GGTACAAAGATTGCTTATGAAACA-3′(SEQID NO37)和5′-AGCAGGGCCAAGGCAATGTAGG-3′(SEQ ID NO38)。然后兩個片段亞克隆并且每一片段至少測序4個獨立的克隆。全長cDNA使用上面提到的引物通過重疊PCR組合，克隆得到的產物并再次測序。
e)以上定義的重組NogoNiG蛋白質和Nogo-A-缺失文庫的產生細菌Nogo-A-缺失文庫在大腸桿菌中表達。蛋白質通過在含0.75mg/ml溶菌酶的超聲處理緩沖液(20mM Tris，50mM NaH2PO4，100mM NaCl，pH8.0)重復超聲處理提取，或者通過用B-PerTM(Pierce)或8M尿素溶解。與pelB前導序列表達的NiG根據Novagen的周質蛋白質純化方案從周質間隙獲得。pET28-構建體的上清在分批方法中使用Co2+-TalonTMMetal AffinityResin(Clontech)純化。8M尿素和B-PerTM溶解的裂解物在樹脂分批過程中通過逐漸用超生處理緩沖液逐漸取代其緩沖液恢復到非變性條件。蛋白質在重力柱(BioRad)上用含250mM咪唑的超聲處理緩沖液洗脫。NiG蛋白質進一步通過在Superdex 200 HiLoad 16/60上通過凝膠過濾純化。pGEX-6P構建體上清根據生產商(Amersham Pharmacia)的提示用G-瓊脂糖柱在分批過程中純化。通過孵育溶解的GST-Nogo-66與PreScission蛋白酶完成GST-Nogo-66的切割并隨后進行HPLC純化。IMAC-純化的重組Nogo通過預備SDS-PAGE進行凝膠電洗脫，并用BioRadElectro-Eluter，250mA，1小時然后顛倒電極30秒電洗脫到50mM Tris，pH7.4，100mM NaCl，0.2％(w/v)CHAPS中。經層析純化的蛋白質的蛋白質濃度使用Pierce Coomassie Stain并以BSA作為標準蛋白質確定。凝膠洗脫蛋白質的蛋白質濃度基于銀染凝膠的條帶強度用BSA作為標準估計(Merril CR，Dunau ML，Goldman D(1981)聚丙烯酰胺凝膠中多肽快速靈敏的銀染，Analyt.Biochem.110201-207)。
f)在CHO細胞中產生重組NogoA片段從部分HincII消化的大鼠Nogo-A cDNA得到的3119bp片段即NiR-G克隆到pSecTag2表達載體(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)中。轉染pNiR-G到CHO細胞中引起NiR-G的胞內、胞質表達。穩定的NiR-G CHO細胞系用250μg/mlzeocin(Invitrogen)選擇。細胞裂解物中的重組NiR-G用Ni2+-NTA柱(Qiagen AG，Basel，Switzerland)純化。大鼠NiG-D20和Nogo-66通過PCR克隆到pAPtag5載體中。轉染pNiG-D20-AP到CHO細胞中得到分泌到培養物上清中的NiG-δ20-AP。穩定的pNiG-D20-AP和pNogo-66-AP細胞系用250μg/ml Zeocin(Invitrogen)選擇。將兩個細胞系于無血清培養基(Gibco)條件中適應并生長于細胞系室中(Integra)。上清在使用前濃縮十倍，融合蛋白的濃度如別處所述進行評定(Flanagan JG，Leder P(1990)Kit配體青灰突變成纖維細胞中改變的細胞表面分子，Ceu 63185-194)。
g)3T3成纖維細胞和CHO鋪展鑒定法3T3鋪展鑒定法如以前所述進行(Spillmann AA，Bandtlow CE，Lottspeich F，Keller F，Schwab ME(1998)牛神經突突起抑制劑(bNI-220)的鑒定和特征描述，J.Biol.Chem.27319283-19293)。CHO鋪展鑒定法基本以3T3成纖維細胞相同的方式進行。簡而言之，CHO細胞分成1∶2。24小時后其在PBS-EDTA中胰酶消化30秒并且鋪展～8'000個CHO細胞到用5、1、0.5和0.2μg/孔NiG或Nogo-66預包被的培養皿上。30-45分鐘后細胞用4％(w/v)PFA、5％(w/v)蔗糖固定然后如Spillmann等(見上文)所述進行分析。用光學顯微鏡每孔計算～100個細胞；鋪展細胞的標準(a)與平皿黏附，且(b)片狀偽足的延伸形態學標志；光學顯微鏡下比未鋪展的圓形細胞表現得更暗更大；認為未鋪展細胞為(a)未與平皿黏附或(b)與平皿黏附但為小的圓形，觀察不到片狀偽足突出到平皿上。鋪展和未鋪展細胞的比例定義了基底的非允許程度。
h)PC12神經突突起鑒定法PC12神經突突起鑒定法如以前所述進行(Rubin BP，Spillmann AA，Bandtlow CE，Keller F，Schwab ME(1995)洗滌劑溶解的CNS髓磷脂蛋白質對PC-12細胞黏附和神經突突起的抑制，Europ.J.Neurosci.72524-2529)。PC12細胞(能不依賴層粘連蛋白生長的PC12細胞克隆，從Moses Chao，New York獲得)用含50-100ng/mlNGF(Harlan Bioproducts，Indianapolis)的DMEM，5％胎牛血清，10％馬血清，100U/ml青霉素和0.5mg/ml鏈霉素(Pen-Strep from Gibco-BRL)致敏兩天。機械脫吸附PCl2細胞，用含0.05％胰蛋白酶(Sigma)的HBSS(Gibco)胰酶消化5分鐘并在含100ng/ml NGF的培養基中鋪成密度3,000-5,000個細胞/cm2。24小時后通過加入含4％(w/v)PFA、5％(w/v)蔗糖的PBS，pH8停止分析。細胞培養皿以3T3細胞同樣的方式包被用于PC12細胞。
i)視網膜神經節細胞條紋鑒定法視網膜神經節細胞條紋鑒定法根據修改的Vielmetter(見Vielmetter J，Stolze B，Bonhoeffer F，Stuermer CA(1990)體外分析以檢測生長的軸突和游走細胞的不同底物親和性，Exp.Brain Res.81283-287)進行(見Schmalfeldt M，Bandtlow CE，Dours-Zimmermann MT，Winterhalter KH，Zimmermann CDR(2000)大腦來源的多能聚糖V2為有效的軸突生長抑制劑，J.Cell Sci.113807-816)。用含4％(w/v)PFA、0.1％(v/v)戊二醛的PBS常溫固定10分鐘之后評價外植塊。對免疫染色來說，固定的外植塊用RNO-封閉液(含0.5％(w/v)BSA，0.3％(w/v)TopBlock(Juro Supply)，0.1％(w/v)NaN3的PBS)室溫封閉1小時，用含0.05％(v/v))Tx-100的RNO-封閉液透化10分鐘，在-20℃冷凍1分鐘并用一抗孵育(AS Bianca用作NiR，AS Laura用作Nogo-A、NiR-G、NiG、NiG-D3和NiG-D20，Novagen mAb anti-T7用作Nogo-C和β-Gal對照蛋白質)。用PBS洗過之后，外植塊中加入(1∶150)FITC-和TRITC(FITC異硫氰酸熒光素；TRITC四甲基異硫氰酸羅丹明)-偶聯抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)。樣品在50％(v/v)甘油，25mM NaHCO3，40mM NaCl，1％(w/v)對苯二胺(Sigma)中蓋片培養。
結果a)Nogo-A N-端部分的兩個區域抑制3T3成纖維細胞的鋪展為鑒定Nogo-A中能抑制3T3成纖維細胞鋪展的區域，建立50個Nogo缺失構建體的文庫并在細菌中表達重組蛋白質(見方法1a)。3T3成纖維細胞鋪展抑制的表觀EC50約為400-500ng/0.1ml Nogo-A包被過夜每cm2培養皿(～4pmol/cm2)。用8M尿素處理Nogo-A或其片段造成抑制活性的顯著降低，表明構象非常重要。在成纖維細胞鋪展鑒定法中分析Nogo片段表明至少兩段Nogo-A蛋白的序列介導了新鋪成纖維細胞鋪展的抑制，即NiR-D2(59-172氨基酸)和NiG-D20(544-725氨基酸)。所有來源于NiG-區域顯示抑制活性的片段(例如NiG-D4和NiG-D8)與NiG-D20部分重疊。高蛋白濃度下可見NiG-D6區域內的NiG-D19較低的抑制活性。Nogo-C、Nogo-66和大鼠肽4(GrandPré等，2000研究表明其為Nogo-66的抑制性區域)不抑制成纖維細胞鋪展。這些數據表明Nogo-A對3T3成纖維細胞的抗鋪展活性在于兩個限定的位于蛋白質N-端(NiR-D2)和Nogo-A-特異部分(NiG-D20)之內。非特異的物理化學特性(片段的酸性，由于脯氨酸和絲氨酸殘基的結構影響)與這種作用無關。C-端RTN結構域不參與成纖維細胞鋪展的抑制。
b)Nogo-A的NiG-D20區域抑制神經突突起為確定對細胞鋪展非允許的Nogo-A片段是否也抑制神經突突起，在不同的神經鑒定法中檢測了一系列細菌產生的Nogo-A片段和真核產生的Nogo-AP嵌合體。在條紋鑒定法中(方法1)，神經突避免了層粘連蛋白/Nogo-A包被的條紋，僅在層粘連蛋白條紋上生長，而用層粘連蛋白/β-半乳糖苷酶包被的條紋不受圍繞。全長Nogo-A肯定地為視網膜神經節細胞(RGC)神經突突起非允許，而N-端部分(NiR)僅有臨界影響。Nogo-C活性與對照蛋白質β-半乳糖苷酶區別不大。Nogo-A-特異區域NiG-D20似乎含有造成對RGC神經突突起非允許活性的主要區域；當遇到NiG-D20-包被條紋時生長暈停止。非允許作用為濃度依賴。在較低Nogo-A濃度下交聯纖維的數量增加。未觀察到鼻面和顳RGC神經突之間關于其與Nogo-A區域有關的區別。PC12細胞的不依賴層粘連蛋白的NGF-響應克隆用50ng/ml NGF敏化24小時然后鋪到用細菌產生的0.1-3μg/cm2的Nogo片段包被的平皿上。一天以后給神經突突起評分。Nogo-A-特異區域(NiG)和其片段NiG-δ20強烈抑制PC12神經突突起。相反地，N-端片段NiR僅有較小的活性，僅在高蛋白濃度下能檢測到。Nogo-C和Nogo-66不具有活性。
實施例23T3成纖維細胞和大鼠皮質腦膜上存在NiR-G和NiG-D20的結合位點方法a)放射性標記和結合實驗IMAC-純化的NiG-D20通過ANAWATrading SA(Wangen，Switzerland)(2,030Ci/mmol)使用乳過氧化物酶(Lactoperoxidase)碘化并通過反相HPLC純化。來源于大鼠腦皮質的膜如(Olpe HR，Karlsson G，Pozza MF，Brugger F，Steinmann M，VanRiezen H，Fagg G，Hall RG，Froestl W，Bittiger H(1990)CGP 35348GABAB受體中心活性的阻斷劑，Eur.J.Pharmacol.18727-38)所述制備。結合基本如(Kaupmann K，Huggel K，Heid J，Flor PJ，Bischoff S，MickelSJ，McMaster G，Angst C，Bittiger H，Froestl W，Bettler B(1997)GABA(B)受體的表達克隆揭示了與代謝型谷氨酸受體的相似性，Nature386239-246)所述使用用1％(w/v)牛血清白蛋白預孵育2小時以降低非特異結合的1.5ml管室溫1小時進行。膜勻漿物在含蛋白酶抑制劑(RcheDiagnostics，Mannheim，FRG)的HEPES緩沖液pH7.4(125mM NaCl，5mM KCl，0.6mM MgCl2，1.8mM CaCl2，20mM HEPES，6mM葡萄糖)中與1.3nM碘化NiG-D20在存在或不存在增加濃度的未標記NiG-D20條件下孵育。
b)流式細胞術流式細胞術和細胞分選在Cytomation MoFlo高速細胞分選儀(Fort Collins，Colorado)上進行。流式細胞儀配有用130mW的電能調節到488nm的氬離子/UV Enterprise II激光。熒光素(FITC)熒光通過530/40nm帶通濾波器收集。為了分析，3T3成纖維細胞用Ceu DissociationBuffer(Gibco)分離。用于檢測NiR-G與3T3成纖維細胞結合的預形成復合物如下制備NiR-G和抗-Myc抗體(9E10)按1∶1的摩爾比于4℃孵育30分鐘。接下來，加入FITC偶聯的F(ab)2山羊抗小鼠IgG并于4℃再孵育30分鐘。得到的三聚復合體的摩爾比為1∶1∶0.5。復合體以終體積0.1ml加至1×1063T3成纖維細胞中，于4℃孵育2小時，洗滌，通過流式細胞術分析。
結果3T3成纖維細胞和大鼠皮質腦膜上存在NiR-A特異的活性片段的結合位點由于Nogo-A的NiR-D2和NiG-D20區域盡管在不存在Nogo-66條件下抑制細胞鋪展和神經突突起并且不依賴于NgR，推測存在單獨的、Nogo-A-特異受體。這樣結合研究用多聚體的myc-標記和IMAC-純化的NiR-G對活的流式細胞術分析的3T3成纖維細胞進行。Ab-復合的NiR-G有效地與3T3細胞結合，如所見的大于90％的3T3細胞的熒光漂移。相反地，與FITC-偶聯的二級F(ab)2山羊抗小鼠IgG復合的9E10一級小鼠抗-myc mAb孵育之后或僅與二級Ab孵育之后3T3細胞不能標記。為檢測NiG-D20與大鼠皮質膜的結合，在放射性配體結合試驗中使用[125I]-標記的NiG-D20。在[125I]-NiG-D20濃度為1.3nM時，通過未標記NiG-D20的濃度依賴性放射性配體結合競爭所顯示在腦膜上發現特異的NiG-D20結合位點的證據。這些結果表明Nogo-A的氨基端片段能與3T3細胞的表面結合并能與大鼠皮質膜結合，證明了膜結合的Nogo-A-特異結合位點或受體的存在。
實施例3小鼠11C7-IgG1的產生小鼠(C3H-和C57BI6/J-系)用與NiG-D20中的特定表位對應的合成肽SYDSIKLEPENPPPYEEA(＝大鼠NogoA_623-640；SEQ ID NO1)皮下免疫。此表位在人、cynomologus猴和小鼠NiG-D20 Nogo-A的特定區域中高度保守并從人NogoA氨基酸序列(SEQ ID NO5)的623氨基酸開始到640氨基酸結束(也見于序列比對圖1)。
mAb 11C7從大鼠NogoA_623-640與載體蛋白質鑰孔血藍蛋白(KLH)融合蛋白免疫的小鼠獲得。單克隆抗體通過ELISA在大鼠NogoA_623-640-KLH、大鼠NogoA_623-640游離肽和不相關肽-KLH上篩選。在進一步的篩選中，mAbs通過ELISA在NiR-G對β-半乳糖苷酶上檢測，兩者均以組氨酸標記的蛋白質形式表達并通過金屬親和層析純化。隨后檢測mAbs在少突細胞和腦裂解物(大鼠來源)的Western印跡中對Nogo-A的識別。在大鼠Nogo-A-轉染的CHO或COS細胞和大鼠少突細胞(透化細胞)的內源Nogo-A的免疫細胞化學中檢測抗體對蛋白質的識別。也檢測其與活的大鼠少突膠質細胞的表面結合。物種交叉反應通過ELISA在大鼠、小鼠、人和牛來源的重組NiG上檢測并通過組織或細胞提取物的Western印跡在內源大鼠、小鼠、人和猴的Nogo-A上檢測。
Western印跡分析如前所述進行SDS-PAGE和Western印跡(Huber AB，Weinmann O，Brosamle C，Oertle T，Schwab ME(2002)發育中的和成體大鼠中和CNS損傷后的Nogo mRNA和蛋白質表達模式，J.Neurosci.223553-3567)，用3％(w/v)Top Block(Juro Supply，Lucerne，Switzerland)進行封閉。抗體如下稀釋純化的單克隆11C7或雜交瘤上清1∶150。二抗為HRP-偶聯抗小鼠((Pierce；1∶5000，)1∶50,000)。與11C7抗體的雜交于4℃過夜進行。為檢測ECL，使用Amersham Pharmacia的檢測試劑。
結果11C7mAb識別少突細胞培養勻漿物的Western印跡上190kD的Nogo-A條帶。11C7也在Western印跡中識別人NiG、獼猴NiG細胞裂解物和大鼠NiG-D20。11C7mAb的特征描述為IgG1同種型(IsoStrip Kit，Roche)。
實施例4小鼠11C7mAb的特征描述免疫細胞化學視神經少突細胞如(Schwab，Caroni，1988，Neuron)所述制備。多聚-L-賴氨酸包被的玻片上生長的3-5天培養物用PBS洗兩次，在含4％(w/v)多聚甲醛(PFA)、5％(w/v)蔗糖的PBS中室溫固定15分鐘并用10％(v/v)FCS封閉非特異結合。然后用小鼠11C7(1∶100)孵育細胞。二抗為山羊抗小鼠TRITC(Jackson ImmunoResearch Laboratories)。對于細胞表面染色，將兩天的大鼠視神經培養物與培養基中的單克隆抗體室溫孵育25分鐘。堿性磷酸酶偶聯的二級抗體(Milan Analytica，Lausanne)以1∶7,500在含1％(w/v)封閉劑的0.1M馬來酸中使用(1小時)。培養物用馬來酸緩沖液洗兩次，用堿性磷酸酶緩沖液(0.1M Tris-HCl pH9.5，0.1MNaCl，5mM MgCl2)洗一次，在含0.175mg/ml BCIP(Sigma)和0.338mg/mlNBT(Sigma)的堿性磷酸酶緩沖液中室溫進行顯色3小時。
培養的少突細胞的細胞表面存在Nogo-A的NogoA_623-640表位少突細胞的活培養物與小鼠11C7mAb孵育染出分化的少突細胞胞體和其輻射過程。對照小鼠IgG和針對胞內蛋白CNP酶的抗體不能使活細胞著色。預孵育小鼠11C7與相應免疫原性肽(＝大鼠NogoA_623-640SED ID NO1)降低染色至背景水平(競爭性分析)。細胞表面著色存在于所有主要和次要過程和胞體上。這樣小鼠11C7mAb所識別分子的Nogo-A特異部分暴露于少突細胞質膜上的胞外間隙。
小鼠11C7mAb的產生和純化使用10-L的玻璃生物反應器用于產生小鼠11C7mAb的雜交瘤克隆的連續模式培養。生物反應器配有放于中央管中以溫和攪拌的海洋葉輪，用于細胞滯留的旋轉濾器和用于無泡沫通風的盤繞硅氧烷管道系統。雜交瘤細胞在基于我們RPMI的無血清培養基中培養。培養基接種3.7×105/ml的細胞。28小時之后通過生物反應器的連續培養基從0.5發酵體積/天(5升/天)的速度起始。另一24小時后流速增加到1發酵體積/天(10升/天)的最終水平。一周后培養物達到11×105個細胞/ml的穩定狀態，此過程再持續一周。通過HPLC每天確定小鼠11C7mAb的滴度。從生物反應器中收150升總培養物上清獲，無菌過濾去除細胞和細胞碎片。使用Pellikon切向流動設備(tangential flow device)(Millipore；10kDa截留)將150L培養物上清濃縮到6L。濃縮的上清在220ml床體積的蛋白A Sepharose Cl-4B柱(Pharmacia；11cm床高度)上3輪純化。簡而言之，培養物上清在pH校正到8.1后以4ml/分鐘加入，柱子用100mM Na2HPO4，pH8.1以8ml/分鐘的速度洗到基線。結合物質最終用50mM NaH2PO4，pH3.0，140mM NaCl以8ml/分鐘的速度洗脫。并立即用5N NaOH中和(pH7.0)然后無菌過濾。280nm下檢測光吸收。純化物質部分最后進一步通過超濾和/或對PBS透析濃縮。純化中使用的所有緩沖液在10kDa ULTRASETTETM切向流動設備(FiltronTechnology Corporation)上過濾以去除可能的內毒素污染。因為同樣的原因，蛋白A樹脂充分用20％乙醇洗滌并且所有的管道系統/泵使用前用0.1M NaOH處理。蛋白濃度在280nm下使用1.35的吸光度作為1mg/ml的參考用分光光度測量。純度在還原條件下使用4-20％Novex梯度凝膠通過SDS-PAGE常規測定。內毒素濃度根據制造商說明書(Endotell AG，Allschwil，Switzerland)通過標準的Limulus Amoebocyte Lysate(LAL)反應測定。
Fab片段的產生小鼠11C7mAb的一部分充分地對100mM乙酸鈉，pH5.5，2mM EDTA透析并調整到6mg/ml的濃度。Fab片段在存在0.25mM半胱氨酸條件下通過木瓜蛋白酶消化(1∶200w/w比例)產生。允許反應在37℃進行16小時并通過過量(10μM)加入特異的木瓜蛋白酶抑制劑E64(N-[N-(L-3-反式-碳環氧乙烷(carboxirane)-2-羰基)-L-亮氨酰]-精胺)停止。然后消化的抗體通過蛋白A Sepharose Fast Flow柱以去除完整抗體和Fc片段。Fab級分充分地對PBS透析并濃縮到約3mg/ml(木瓜蛋白酶和E64購自Roche Molecular Biochemicals)。
VL和VH區域的HPLC、質譜和N-端氨基酸測序a)還原和烷基化純化干燥的11C7抗體溶解于40μl的8M尿素、0.4M NH4HCO3，pH8.3的溶液中。60μg DTT(Calbiochem)預溶解于10μl與蛋白質相同的緩沖液中加入。還原在氬環境中50℃進行30分鐘(DTT摩爾超過蛋白質硫醇100倍)。還原之后，樣品冷卻到室溫。304μg的碘乙酰胺(Sigma Ultra，I-1149)溶解于蛋白質相同的緩沖液中加入。于黑暗中室溫15分鐘進行酰胺甲基化。加入1μl β-巰基乙醇結束反應。
b)重鏈和輕鏈的分離酰胺甲基化的抗體重鏈和輕鏈通過在帶有CDR5泵吸系統和二級陣列UV探測器的Hewlett Packard 1090M HPLC系統上反向高效液相色譜層析(RP-HPLC)分離。層析的條件為R1/H材料填充的PerSeptive Biosystems Poros 2.1×100mm柱；流速0.5ml/分鐘；溶劑(A)0.1％TFA水溶液和(B)0.09％TFA/乙腈/水9∶1；80℃下8分鐘的梯度25-70％B；218/280nm下檢測。
c)LC-ESI-MS質譜使用配有Micromass Z-type電噴灑離子化源(ESI)的Q-Tof(Micromass，Manchester，UK)四極飛行時間雜交串聯質譜儀進行。獲得的質量范圍一般為m/z 500-2000。記錄數據并用MassLynx軟件加工。500-2500m/z范圍的校準通過使用馬心臟肌紅蛋白(MW 16951.5)多電荷離子峰獲得。
d)重鏈和輕鏈的HPLC-MS還原的和酰胺甲基化的重鏈和輕鏈的分離在HP1100HPLC系統上(Hewlett Packard，Palo-Alto，CA，USA)使用用Perseptive Biosystems POROS R1/H填充的1mm×150mm LC填充柱進行。柱子保存于60℃。10μl的樣品體積使用備有Valco model C6UWHPLC閥(Valco，Houston，TX，USA)和10μl注射環的CTC PAL自動進樣器(CTC，Zwingen，Switzerland)注入柱子。HPLC通過MassLynx軟件Micromass，Manchester，UK)控制。UV檢測在214nm下進行。洗脫液A為含0.05％TFA的水溶液。洗脫液B為1∶9的水∶含0.045％TFA的乙腈混合物。80℃下在20分鐘內進行20％B-90％B的梯度。流速一般為60μl/分鐘。LC系統的總液流引入UV檢測室，然后是不含任何分離的ESI源。控制HPLC系統并將來自UV探測器的信號用MassLynx(Micromass，Manchester，UK)軟件處理。檢測了以下5個信號表1
d)VL和VH區域的N-端氨基酸測序從HPLC收集的H+L鏈峰用于序列分析。在Hewlett Packard G1000A N-端蛋白質測序系統上確定氨基酸序列。此系統對滯留在縮微吸附雙相柱上的蛋白質樣品進行自動Edman化學法。使用優化的化學方法(雙偶合(double couple)3.0)以提高化學效率，最小化延遲并因此延伸序列分析到約50個殘基。PTH-氨基酸的分析在配有三重泵吸系統和窄內徑(narrowbore)(2.1mm×25cm)PTH柱的聯機Hewlett Packard HP1090HPLC系統上進行。
結果從質量分析確定小鼠11C7-IgG1的同源重鏈和輕鏈。H-鏈為單糖基化并且C-端賴氨酸有兩種不同形式。重鏈和輕鏈的總質量分析表明兩鏈的單一質量。小鼠11C7-IgG1的HPLC層析顯示了單一的峰。HPLC純化之后然后還原和烷基化可獲得純的重鏈和輕鏈。在輕鏈和重鏈上進行N-端序列降解。通過序列降解確定輕鏈和重鏈N-端序列的45-55氨基酸。
輕鏈1 5 10 15 20 25 30      DVLLTQTPLTLSITIGQPASISCKSSQSLL31 35 40 45 50 55 60      HSDGKTYLNWLLQRPGQ重鏈1 5 10 15 20 25 30      EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCVVSGFDFR31 35 40 45 50 55 60      RNWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPD實施例5小鼠11C7mAb重鏈和輕鏈基因的克隆根據制造商說明書使用TriPure試劑(Roche diagnostics，Germany，Cat.#1667157)從107雜交瘤細胞(克隆11C7)中制備總RNA。使用OligotexResin(Qiagen，Germany，cat.#70022)從以上制備的總RNA中分離mRNA用于cDNA合成。
cDNA使用下列條件通過反轉錄產生2μl mRNA，2μl10×反轉錄緩沖液，2μl(dT)20引物(10μM)，0.5μl RNasin(Promega，40U/ml)，2μldNTPs(每種5mM)，1μl OmniscriptTM反轉錄酶(Qiagen，Cat#205110)，10.5μl ddH2O，反應37℃1小時。為PCR擴增編碼VH和VL的cDNA，使用校正酶即ProofStartTMDNA聚合酶。
重鏈和輕鏈的PCR反應混合物2μl cDNA，5μl10×反應緩沖液，3μl dNTPs(每種5mM)，2μl 5’引物(10μM)(見表2)，2μl 3’引物(10μM)(見表2)，1μl ProofStart(Qiagen，Cat#202203)，36μl ddH2O。PCR條件95℃/5分鐘，(95℃/40秒，53℃/1分鐘，72℃1分鐘)×35，72℃/10分鐘。得到的PCR產物直接連接到pCRbluntTOPO(Invitro0gen)中。連接混合物轉染到TOP 10細胞(Invitrogen)中并選擇數個克隆。11C7mAb重鏈(V-H，SEQ ID NO43)和11C7mAb輕鏈(V-L，SEQ ID NO44)可變部分的核苷酸序列cDNas在ABI測序儀上確定。SEQ ID NO2(V-H)和SEQ ID NO3(V-L)顯示了V-H和V-L隨后的氨基酸序列。用于PCR擴增VH和VLcDNAs的引物；所有引物由MWG Biotech，Germany合成。
表2
實施例6使用ELISA的11C7和Fab與Nogo-A結構域的結合Greiner 96孔PS板(#655161)用0.4-2μg/ml Nogo蛋白質片段的PBS溶液(100μl/孔)包被，覆蓋并室溫孵育4小時。輕彈平板并用200μl/孔的封閉緩沖液(PBS+2％BSA)重新填充，覆蓋并室溫孵育1小時或4℃孵育過夜，然后用水和PBS洗4次。不同濃度的小鼠11C7mAb或11C7Fab用PBS+2％BSA(100μl/孔)稀釋，并室溫孵育2小時或4℃孵育過夜。重復洗滌步驟并加入在PBS/0.1％BSA/0.1％Nonidet 40(100μl/孔)中1∶5000(ICN#55550)稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的山羊抗小鼠IgG，然后室溫孵育2小時或4℃孵育過夜并重復洗滌步驟。HRP反應通過加入100μl/孔BMblue POD(Roche#1484281)起始并于黑暗條件下室溫孵育15分鐘。加入H2SO450μl/孔1M終止HRP底物反應然后使用設置于450nm的微板讀數儀(Packard Spectra Count)確定光學密度。
小鼠11C7mAb在非常低的0.02至2.5nM濃度下與人NiG、大鼠NiG、小鼠NiG、大鼠NiG-D20和肽472結合。在低濃度下結合人NiG、大鼠NiG、小鼠NiG通過非常高的親和性(Kd 0.1-0.44nM生物傳感器親和性測量)證實，并與肽472與大鼠和小鼠的等同區域相比除了2-3個氨基酸外在人類中相同的事實一致。小鼠11C7mAb在相同的濃度范圍內根本不表現任何與大鼠NiG-D6和Nogo-66片段結合的事實說明了結合的特異性。Fab單價片段在0.025-25nM濃度下與人NiG和大鼠NiG-D20結合，并且在相同濃度范圍內不表現任何與大鼠NiG-D6和Nogo-66片段的結合。人NiG通過生物傳感器測量的Kd為7.14。
實施例7小鼠11C7-IgG1和Fab與Nogo-A結構域的生物傳感器親和性測量小鼠11C7mAb和11C7Fab的親和性根據制造商說明書(見圖2)使用BIAcore 2000光學生物傳感器(Biacore，Uppsala，Sweden)通過表面胞質共振分析技術(SPR)測量。重組人、小鼠和大鼠NIG使用胺偶聯化學方法與三個單獨的CM5傳感器芯片流室共價連接。簡而言之，羧甲基化的葡聚糖基質通過注射入35μl含0.025M NHS和0.1M EDC的溶液活化。為固定到生物傳感器芯片上，重組小鼠、人和大鼠NIG在0.01M的3.5-4.5的檸檬酸緩沖液中稀釋并以5μl/分鐘的流速注入以獲得允許親和性測量的偶聯水平。通過注入35μl 1M鹽酸乙醇胺(pH 8.5)鈍化殘留的NHS-酯基。通過注入5μl 0.1M HCl再生生物傳感器芯片的表面。為測量親和性，抗體以范圍從0.50nM到100nM的不同濃度以200μl/分鐘的流速注入。每一次注入之后生物傳感器的表面通過注入10μl 0.1M HCl再生而不喪失表面的結合活性。動力學常數ka和kd以及親和性常數KA和KD使用制造商提供的BIAevaluations 3.0軟件評估。
BIAcore中的親和性測量小鼠11C7mAb和11C7衍生的單價Fab片段與重組NogoA的動力學和親和結合常數使用表面胞質共振分析(SPR)技術(Biacore)實時測量。此測量中重組人、小鼠和大鼠NIGs在三個獨立的生物傳感器芯片表面上偶聯并注入不同濃度的抗體。結合作用的動力學參數來自通過非線性曲線擬合的sensorgrams。小鼠11C7-IgG1對人、大鼠和小鼠NIG平衡的親和常數分別為KD＝0.1nM、KD＝0.4nM和KD＝0.19nM(表3)。11C7衍生的Fab片段對人NIG的親和常數為KD＝7.14nM。Fab片段較低的親和性源于兩個動力學常數即結合和解離常數(ka，kd)的降低。與完整抗體相比Fab片段較低的親和性可能與單體Fab中缺少親合力效應有關。
表3
序列表<110>諾瓦提斯公司<120>抗Nogo A的抗體(″11C7″)及其藥物用途<130>4-32761P1/UNZ<160>44<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>18<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>肽
<222>(1)..(18)<223>大鼠NogoA_623-640<400>1Ser Tyr Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu1 5 10 15Glu Ala<210>2<21l>221<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<220>
<221>鏈<222>(1)..(221)<223>具有前導序列的11C7重鏈可變部分<400>2
Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val1 5 10 15Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro20 25 30Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Asp Phe Arg35 40 45Arg Asn Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu50 55 60Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro65 70 75 80Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr85 90 95Leu Tyr Leu Gln Val Ser Thr Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr100 105 110Tyr Cys Val Arg Pro Val Trp Met Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln115 120 125Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val130 135 140Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
145 150 155 160Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr165 170 175Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val180 185 190Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser195 200 205Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala210 215 220<210>3<211>238<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>鏈<222>(1)..(238)<223>具有前導序列的11C7輕鏈
<400>3Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu1 5 10 15Thr Ser Gly Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Ile20 25 30Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu35 40 45Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser65 70 75 80Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys100 105 110Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu145 150 155 160Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly165 170 175Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser180 185 190Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp195 200 205Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr210 215 220Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>4<211>3919<212>DNA<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS<222>(1)..(3579)<223>人NogoA<400>4atg gaa gac ctg gac cag tct cct ctg gtc tcg tcc tcg gac agc cca 48Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro1 5 10 15ccc cgg ccg cag ccc gcg ttc aag tac cag ttc gtg agg gag ccc gag 96Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu20 25 30gac gag gag gaa gaa gag gag gag gaa gag gag gac gag gac gaa gac 144Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp35 40 45ctg gag gag ctg gag gtg ctg gag agg aag ccc gcc gcc ggg ctg tcc 192Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser50 55 60gcg gcc cca gtg ccc acc gcc cct gcc gcc ggc gcg ccc ctg atg gac 240Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp65 70 75 80ttc gga aat gac ttc gtg ccg ccg gcg ccc cgg gga ccc ctg ccg gcc 288Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala85 90 95gct ccc ccc gtc gcc ccg gag cgg cag ccg tct tgg gac ccg agc ccg 336Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro
100 105 110gtg tcg tcg acc gtg ccc gcg cca tcc ccg ctg tct gct gcc gca gtc 384Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val115 120 125tcg ccc tcc aag ctc cct gag gac gac gag cct ccg gcc cgg cct ccc 432Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro130 135 140cct cct ccc ccg gcc agc gtg agc ccc cag gca gag ccc gtg tgg acc 480Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr145 150 155 160ccg cca gcc ccg gct ccc gcc gcg ccc ccc tcc acc ccg gcc gcg ccc 528Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro165 170 175aag cgc agg ggc tcc tcg ggc tca gtg gat gag acc ctt ttt gct ctt 576Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu180 185 190cct gct gca tct gag cct gtg ata cgc tcc tct gca gaa aat atg gac 624Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp195 200 205ttg aag gag cag cca ggt aac act att tcg gct ggt caa gag gat ttc 672Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe210 215 220cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gct tct ctt cct tct ctg tct cct 720Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro225 230 235 240ctc tca gcc gct tct ttc aaa gaa cat gaa tac ctt ggt aat ttg tca 768Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser245 250 255
aca gta tta ccc act gaa gga aca ctt caa gaa aat gtc agt gaa gct 816Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala260 265 270tct aaa gag gtc tca gag aag gca aaa act cta ctc ata gat aga gat 864Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp275 280 285tta aca gag ttt tca gaa tta gaa tac tca gaa atg gga tca tcg ttc 912Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe290 295 300agt gtc tct cca aaa gca gaa tct gcc gta ata gta gca aat cct agg 960Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn Pro Arg305 310 315 320gaa gaa ata atc gtg aaa aat aaa gat gaa gaa gag aag tta gtt agt 1008Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser325 330 335aat aac atc ctt cat aat caa caa gag tta cct aca gct ctt act aaa 1056Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys340 345 350ttg gtt aaa gag gat gaa gtt gtg tct tca gaa aaa gca aaa gac agt 1104Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser355 360 365ttt aat gaa aag aga gtt gca gtg gaa gct cct atg agg gag gaa tat 1152Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr370 375 380gca gac ttc aaa cca ttt gag cga gta tgg gaa gtg aaa gat agt aag 1200Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys385 390 395 400gaa gat agt gat atg ttg gct gct gga ggt aaa atc gag agc aac ttg 1248Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu
405 410 415gaa agt aaa gtg gat aaa aaa tgt ttt gca gat agc ctt gag caa act 1296Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr420 425 430aat cac gaa aaa gat agt gag agt agt aat gat gat act tct ttc ccc 1344Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro435 440 445agt acg cca gaa ggt ata aag gat cgt tca gga gca tat atc aca tgt 1392Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys450 455 460gct ccc ttt aac cca gca gca act gag agc att gca aca aac att ttt 1440Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe465 470 475 480cct ttg tta gga gat cct act tca gaa aat aag acc gat gaa aaa aaa 1488Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys485 490 495ata gaa gaa aag aag gcc caa ata gta aca gag aag aat act agc acc 1536Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr500 505 510aaa aca tca aac cct ttt ctt gta gca gca cag gat tct gag aca gat 1584Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp515 520 525tat gtc aca aca gat aat tta aca aag gtg act gag gaa gtc gtg gca 1632Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr Glu Glu Val Val Ala530 535 540aac atg cct gaa ggc ctg act cca gat tta gta cag gaa gca tgt gaa 1680Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu545 550 555 560
agt gaa ttg aat gaa gtt act ggt aca aag att gct tat gaa aca aaa 1728Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys565 570 575atg gac ttg gtt caa aca tca gaa gtt atg caa gag tca ctc tat cct 1776Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro580 585 590gca gca cag ctt tgc cca tca ttt gaa gag tca gaa gct act cct tca 1824Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser595 600 605cca gtt ttg cct gac att gtt atg gaa gca cca ttg aat tct gca gtt 1872Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val610 615 620cct agt gct ggt gct tcc gtg ata cag ccc agc tca tca cca tta gaa 1920Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu625 630 635 640gct tct tca gtt aat tat gaa agc ata aaa cat gag cct gaa aac ccc 1968Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro645 650 655cca cca tat gaa gag gcc atg agt gta tca cta aaa aaa gta tca gga 2016Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly660 665 670ata aag gaa gaa att aaa gag cct gaa aat att aat gca gct ctt caa 2064Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Ash Ile Ash Ala Ala Leu Gln675 680 685gaa aca gaa gct cct tat ata tct att gca tgt gat tta att aaa gaa 2112Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu690 695 700aca aag ctt tct gct gaa cca gct ccg gat ttc tct gat tat tca gaa 2160Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu
705 710 715 720atg gca aaa gtt gaa cag cca gtg cct gat cat tct gag cta gtt gaa 2208Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu725 730 735gat tcc tca cct gat tct gaa cca gtt gac tta ttt agt gat gat tca 2256Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser740 745 750ata cct gac gtt cca caa aaa caa gat gaa act gtg atg ctt gtg aaa 2304Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val Lys755 760 765gaa agt ctc act gag act tca ttt gag tca atg ata gaa tat gaa aat 2352Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn770 775 780aag gaa aaa ctc agt gct ttg cca cct gag gga gga aag cca tat ttg 2400Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu785 790 795 800gaa tct ttt aag ctc agt tta gat aac aca aaa gat acc ctg tta cct 2448Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro805 810 815gat gaa gtt tca aca ttg agc aaa aag gag aaa att cct ttg cag atg 2496Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met820 825 830gag gag ctc agt act gca gtt tat tca aat gat gac tta ttt att tct 2544Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser835 840 845aag gaa gca cag ata aga gaa act gaa acg ttt tca gat tca tct cca 2592Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro850 855 860
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1010 1015 1020agc cta ttc ctg ctg ctt tca ttg aca gta ttc agc att gtg agc 3114Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser1025 1030 1035gta aca gcc tac att gcc ttg gcc ctg ctc tct gtg acc atc agc 3159Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser1040 1045 1050ttt agg ata tac aag ggt gtg atc caa gct atc cag aaa tca gat 3204Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp1055 1060 1065gaa ggc cac cca ttc agg gca tat ctg gaa tct gaa gtt gct ata 3249Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile1070 1075 1080tct gag gag ttg gtt cag aag tac agt aat tct gct ctt ggt cat 3294Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His1085 1090 1095gtg aac tgc acg ata aag gaa ctc agg cgc ctc ttc tta gtt gat 3339Val Asn Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp1100 1105 1110gat tta gtt gat tct ctg aag ttt gca gtg ttg atg tgg gta ttt 3384Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe1115 1120 1125acc tat gtt ggt gcc ttg ttt aat ggt ctg aca cta ctg att ttg 3429Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu1130 1135 1140gct ctc att tca ctc ttc agt gtt cct gtt att tat gaa cgg cat 3474Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His1145 1150 1155
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Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu20 25 30Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp35 40 45Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser50 55 60Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp65 70 75 80Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala85 90 95Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro100 105 110Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val115 120 125Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro130 135 140Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr145 150 155 160
Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro165 170 175Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu180 185 190Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp195 200 205Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe210 215 220Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro225 230 235 240Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser245 250 255Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala260 265 270Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp275 280 285Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe290 295 300Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn Pro Arg305 310 315 320
Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser325 330 335Ash Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys340 345 350Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser355 360 365Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr370 375 380Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys385 390 395 400Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu405 410 415Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr420 425 430Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro435 440 445Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys450 455 460
Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe465 470 475 480Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys485 490 495Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val Thr Glu Lys Ash Thr Ser Thr500 505 510Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp515 520 525Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr Glu Glu Val Val Ala530 535 540Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu545 550 555 560Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys565 570 575Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro580 585 590Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser595 600 605Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val610 615 620
Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu625 630 635 640Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro645 650 655Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly660 665 670Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln675 680 685Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu690 695 700Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu705 710 715 720Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu725 730 735Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser740 745 750Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val Lys755 760 765
Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn770 775 780Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu785 790 795 800Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro805 810 815Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met820 825 830Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser835 840 845Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro850 855 860Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp865 870 875 880Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser His885 890 895Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys900 905 910Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val915 920 925
Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala930 935 940Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr945 950 955 960Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Val Lys Glu965 970 975Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro980 985 990Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val Val Asp Leu9951000 1005Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala1010 1015 1020Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser1025 1030 1035Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser1040 1045 1050Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp1055 1060 1065
Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile1070 1075 1080Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His1085 1090 1095Val Asn Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp1100 1105 1110Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe1115 1120 1125Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu1130 1135 1140Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His1145 1150 1155Gln Ala Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val1160 1165 1170Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys1175 1180 1185Arg Lys Ala Glu1190<210>6
<2ll>18<212>PRT<213>人<220>
<221>肽<222>(1)..(18)<223>人NogoA_623-640<400>6Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu1 5 10 15Glu Ala<210>7<211>819<212>PRT<213>人
<220>
<221>肽<222>(1)..(819)<223>人Nig<400>7Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg1 5 10 15Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile20 25 30Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala35 40 45Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His50 55 60Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu65 70 75 80Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys85 90 95
Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr100 105 110Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala115 120 125Val Ile Val Ala Asn Pro Arg Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp130 135 140Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser Asn Asn Ile Leu His Ash Gln Gln Glu145 150 155 160Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser165 170 175Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu180 185 190Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val195 200 205Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly210 215 220Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe225 230 235 240Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser
245 250 255Ash Asp Asp Thr Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg260 265 270Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu275 280 285Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu290 295 300Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val305 310 315 320Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala325 330 335Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys340 345 350Val Thr Glu Glu Val Val Ala Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp355 360 365Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr370 375 380Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val385 390 395 400
Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu405 410 415Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu420 425 430Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln435 440 445Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile450 455 460Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val465 470 475 480Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu485 490 495Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile500 505 510Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro515 520 525Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro530 535 540Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val
545 550 555 560Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp565 570 575Glu Thr Val Met Leu Val Lys Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu580 585 590Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro595 600 605Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn610 615 620Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys625 630 635 640Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser645 650 655Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu660 665 670Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr675 680 685Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr690 695 700
Thr Asp Leu Glu Val Ser His Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp705 710 715 720Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu725 730 735Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp740 745 750Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro755 760 765Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys770 775 780Pro Lys Val Leu Val Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr785 790 795 800Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser805 810 815Lys Thr Ser<210>8<211>10
<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>結合<222>(1)..(10)<223>11C7重鏈高變部分<400>8Gly Phe Asp phe Arg Arg Asn Trp Met Ser1 5 10<210>9<211>17<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>結合
<222>(1)..(17)<223>11C7重鏈高變部分<400>9Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys1 5 10 15Asp<210>10<211>9<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>結合<222>(1)..(9)<223>11C7重鏈高變部分<400>10
Pro Val Trp Met Tyr Ala Met Asp Tyr1 5<210>11<211>16<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>結合<222>(1)..(16)<223>11C7輕鏈高變部分<400>11Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn1 5 10 15<210>12<211>7<212>PRT
<213>小鼠<220>
<221>結合<222>(1)..(7)<223>11C7輕鏈高變部分<400>12Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>結合<222>(1)..(9)
<223>11C7輕鏈高變部分<400>13Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr1 5<210>14<211>30<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>misc_結合<222>(1)..(30)<223>DNA-CDRl-11C7<400>14ggattcgatt ttagaagaaa ttggatgagt 30<210>15
<211>51<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>misc_結合<222>(1)..(51)<223>DNA-CDR2-11C7<400>15gaaattaatc cagatagcag taagataaac tatacgccat ctctaaagga t 51<210>16<211>27<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>misc_結合
<222>(1)..(27)<223>DNA-CDR3-11C7<400>16ccggtctgga tgtatgctat ggactac 27<210>17<211>48<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>misc_結合<222>(1)..(48)<223>DNA-CDR′1-11C7<400>17aagtcaagtc agagcctctt gcatagtgat ggaaagacat atttgaat 48<210>18
<211>21<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>misc_結合<222>(1)..(21)<223>DNA-CDR′2-11C7<400>18ctggtgtcta aactggactc t 21<210>19<211>27<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>misc_結合
<222>(1)..(27)<223>DNA-CDR′3-11C7<400>19tggcaaggta cacattttcc tcagacg 27<210>20<211>54<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>CDS<222>(1)..(54)<223>11C7重鏈的前導序列<400>20atg gat ttt ggg ctg att ttt ttt att gtt ggt ctt tta aaa ggg gtc 48Met Asp phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val1 5 10 15cag tgt 54Gln Cys
<210>21<211>18<212>PRT<213>小鼠<400>21Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val1 5 10 15Gln Cys<210>22<211>57<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>CDS
<222>(1)..(57)<223>11C7輕鏈的前導序列<400>22atg agt cct gcc cag ttc ctg ttt ctg tta gtg ctc tgg att cgg gaa 48Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu1 5 10 15acc agc ggt 57Thr Ser Gly<210>23<211>19<212>PRT<213>小鼠<400>23Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu1 5 10 15Thr Ser Gly
<210>24<211>181<212>PRT<213>人<220>
<221>肽<222>(1)..(181)<223>人Nig-D20<400>24Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Met Asp Leu Val Gln Thr Ser1 5 10 15Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser20 25 30Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val35 40 45Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val50 55 60
Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu65 70 75 80Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met85 90 95Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu100 105 110Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile115 120 125Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro130 135 140Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro145 150 155 160Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu165 170 175Pro Val Asp Leu Phe180<210>25<211>3492
<212>DNA<213>大鼠<220>
<221>CDS<222>(1)..(3492)<223>大鼠NogoA<400>25atg gaa gac ata gac cag tcg tcg ctg gtc tcc tcg tcc acg gac agc 48Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser1 5 10 15ccg ccc cgg cct ccg ccc gcc ttc aag tac cag ttc gtg acg gag ccc 96Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro20 25 30gag gac gag gag gac gag gag gag gag gag gac gag gag gag gac gac 144Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp35 40 45gag gac cta gag gaa ctg gag gtg ctg gag agg aag ccc gca gcc ggg 192Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly50 55 60ctg tcc gca gct gcg gtg ccg ccc gcc gcc gcc gcg ccg ctg ctg gac 240Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp65 70 75 80
ttc agc agc gac tcg gtg ccc ccc gcg ccc cgc ggg ccg ctg ccg gcc 288Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala85 90 95gcg ccc cct gcc gct cct gag agg cag cca tcc tgg gaa cgc agc ccc 336Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro100 105 110gcg gcg ccc gcg cca tcc ctg ccg ccc gct gcc gca gtc ctg ccc tcc 384Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser115 120 125aag ctc cca gag gac gac gag cct ccg gcg agg ccc ccg cct ccg ccg 432Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro130 135 140cca gcc ggc gcg agc ccc ctg gcg gag ccc gcc gcg ccc cct tcc acg 480Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr145 150 155 160ccg gcc gcg ccc aag cgc agg ggc tcc ggc tca gtg gat gag acc ctt 528Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu165 170 175ttt gct ctt cct gct gca tct gag cct gtg ata ccc tcc tct gca gaa 576Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu180 185 190aaa att atg gat ttg atg gag cag cca ggt aac act gtt tcg tct ggt 624Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly195 200 205caa gag gat ttc cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gcc tct ctt cct 672Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro210 215 220tct cta tct cct ctc tca act gtt tct ttt aaa gaa cat gga tac ctt 720Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu
225 230 235 240ggt aac tta tca gca gtg tca tcc tca gaa gga aca att gaa gaa act 768Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr245 250 255tta aat gaa gct tct aaa gag ttg cca gag agg gca aca aat cca ttt 816Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Ash Pro Phe260 265 270gta aat aga gat tta gca gaa ttt tca gaa tta gaa tat tca gaa atg 864Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met275 280 285gga tca tct ttt aaa ggc tcc cca aaa gga gag tca gcc ata tta gta 912Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val290 295 300gaa aac act aag gaa gaa gta att gtg agg agt aaa gac aaa gag gat 960Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp305 310 315 320tta gtt tgt agt gca gcc ctt cac agt cca caa gaa tca cct gtg ggt 1008Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser Pro Val Gly325 330 335aaa gaa gac aga gtt gtg tct cca gaa aag aca atg gac att ttt aat 1056Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn340 345 350gaa atg cag atg tca gta gta gca cct gtg agg gaa gag tat gca gac 1104Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp355 360 365ttt aag cca ttt gaa caa gca tgg gaa gtg aaa gat act tat gag gga 1152Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly370 375 380
agt agg gat gtg ctg gct gct aga gct aat gtg gaa agt aaa gtg gac 1200Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp385 390 395 400aga aaa tgc ttg gaa gat agc ctg gag caa aaa agt ctt ggg aag gat 1248Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu Gly Lys Asp405 410 415agt gaa ggc aga aat gag gat gct tct ttc ccc agt acc cca gaa cct 1296Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro420 425 430gtg aag gac agc tcc aga gca tat att acc tgt gct tcc ttt acc tca 1344Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser435 440 445gca acc gaa agc acc aca gca aac act ttc cct ttg tta gaa gat cat 1392Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His450 455 460act tca gaa aat aaa aca gat gaa aaa aaa ata gaa gaa agg aag gcc 1440Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala465 470 475 480caa att ata aca gag aag act agc ccc aaa acg tca aat cct ttc ctt 1488Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu485 490 495gta gca gta cag gat tct gag gca gat tat gtt aca aca gat acc tta 1536Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu500 505 510tca aag gtg act gag gca gca gtg tca aac atg cct gaa ggt ctg acg 1584Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr515 520 525cca gat tta gtt cag gaa gca tgt gaa agt gaa ctg aat gaa gcc aca 1632Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr
530 535 540ggt aca aag att gct tat gaa aca aaa gtg gac ttg gtc caa aca tca 1680Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr Ser545 550 555 560gaa gct ata caa gaa tca ctt tac ccc aca gca cag ctt tgc cca tca 1728Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro Ser565 570 575ttt gag gaa gct gaa gca act ccg tca cca gtt ttg cct gat att gtt 1776Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val580 585 590atg gaa gca cca tta aat tct ctc ctt cca agc gct ggt gct tct gta 1824Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val595 600 605gtg cag ccc agt gta tcc cca ctg gaa gca cct cct cca gtt agt tat 1872Val Gln Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr610 615 620gac agt ata aag ctt gag cct gaa aac ccc cca cca tat gaa gaa gcc 1920Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala625 630 635 640atg aat gta gca cta aaa gct ttg gga aca aag gaa gga ata aaa gag 1968Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu645 650 655cct gaa agt ttt aat gca gct gtt cag gaa aca gaa gct cct tat ata 2016Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile660 665 670tcc att gcg tgt gat tta att aaa gaa aca aag ctc tcc act gag cca 2064Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro675 680 685
agt cca gat ttc tct aat tat tca gaa ata gca aaa ttc gag aag tcg 2112Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser690 695 700gtg ccc gaa cac gct gag cta gtg gag gat tcc tca cct gaa tct gaa 2160Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu705 710 715 720cca gtt gac tta ttt agt gat gat tcg att cct gaa gtc cca caa aca 2208Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr725 730 735caa gag gag gct gtg atg ctc atg aag gag agt ctc act gaa gtg tct 2256Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser740 745 750gag aca gta gcc cag cac aaa gag gag aga ctt agt gcc tca cct cag 2304Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gln755 760 765gag cta gga aag cca tat tta gag tct ttt cag ccc aat tta cat agt 2352Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser770 775 780aca aaa gat gct gca tct aat gac att cca aca ttg acc aaa aag gag 2400Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu785 790 795 800aaa att tct ttg caa atg gaa gag ttt aat act gca att tat tca aat 2448Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn805 810 815gat gac tta ctt tct tct aag gaa gac aaa ata aaa gaa agt gaa aca 2496Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr820 825 830ttt tca gat tca tct ccg att gag ata ata gat gaa ttt ccc acg ttt 2544Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe
835 840 845gtc agt gct aaa gat gat tct cct aaa tta gcc aag gag tac act gat 2592Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp850 855 860cta gaa gta tcc gac aaa agt gaa att gct aat atc caa agc ggg gca 2640Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala865 870 875 880gat tca ttg cct tgc tta gaa ttg ccc tgt gac ctt tct ttc aag aat 2688Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn885 890 895ata tat cct aaa gat gaa gta cat gtt tca gat gaa ttc tcc gaa aat 2736Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn900 905 910agg tcc agt gta tct aag gca tcc ata tcg cct tca aat gtc tct gct 2784Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala915 920 925ttg gaa cct cag aca gaa atg ggc agc ata gtt aaa tcc aaa tca ctt 2832Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu930 935 940acg aaa gaa gca gag aaa aaa ctt cct tct gac aca gag aaa gag gac 2880Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp945 950 955 960aga tcc ctg tca gct gta ttg tca gca gag ctg agt aaa act tca gtt 2928Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val965 970 975gtt gac ctc ctc tac tgg aga gac att aag aag act gga gtg gtg ttt 2976Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe980 985 990
ggt gcc agc tta ttc ctg ctg ctg tct ctg aca gtg ttc agc att gtc 3024Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val995 1000 1005agt gta acg gcc tac att gcc ttg gcc ctg ctc tcg gtg act atc 3069Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile1010 1015 1020agc ttt agg ata tat aag ggc gtg atc cag gct atc cag aaa tca 3114Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser1025 1030 1035gat gaa ggc cac cca ttc agg gca tat tta gaa tct gaa gtt gct 3159Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala1040 1045 1050ata tca gag gaa ttg gtt cag aaa tac agt aat tct gct ctt ggt 3204Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly1055 1060 1065cat gtg aac agc aca ata aaa gaa ctg agg cgg ctt ttc tta gtt 3249His Val Asn Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val1070 1075 1080gat gat tta gtt gat tcc ctg aag ttt gca gtg ttg atg tgg gtg 3294Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val1085 1090 1095ttt act tat gtt ggt gcc ttg ttc aat ggt ctg aca cta ctg att 3339Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile1100 1105 1110tta gct ctg atc tca ctc ttc agt att cct gtt att tat gaa cgg 3384Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg1115 1120 1125cat cag gtg cag ata gat cat tat cta gga ctt gca aac aag agt 3429His Gln Val Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser
1130 1135 1140gtt aag gat gcc atg gcc aaa atc caa gca aaa atc cct gga ttg 3474Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu1145 1150 1155aag cgc aaa gca gat tga3492Lys Arg Lys Ala Asp1160<210>26<211>1163<212>PRT<213>大鼠<400>26Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser1 5 10 15Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro20 25 30Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp35 40 45Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly50 55 60
Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp65 70 75 80Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala85 90 95Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro100 105 110Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser115 120 125Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro130 135 140Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr145 150 155 160Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu165 170 175Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu180 185 190Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly195 200 205
Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro210 215 220Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu225 230 235 240Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr245 250 255Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe260 265 270Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met275 280 285Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val290 295 300Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp305 310 315 320Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser Pro Val Gly325 330 335Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn340 345 350Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp355 360 365
Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly370 375 380Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp385 390 395 400Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu Gly Lys Asp405 410 415Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro420 425 430Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser435 440 445Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His450 455 460Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala465 470 475 480Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu485 490 495Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu500 505 510
Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr515 520 525Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr530 535 540Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr Ser545 550 555 560Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro Ser565 570 575Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val580 585 590Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val595 600 605Val Gln Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr610 615 620Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala625 630 635 640Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu645 650 655Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile660 665 670
Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro675 680 685Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser690 695 700Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu705 710 715 720Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr725 730 735Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser740 745 750Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gln755 760 765Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser770 775 780Thr Lys Asp Ala Ala Ser Ash Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu785 790 795 800Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn805 810 815
Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr820 825 830Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe835 840 845Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp850 855 860Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala865 870 875 880Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn885 890 895Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Ash900 905 910Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala915 920 925Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu930 935 940Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp945 950 955 960Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val965 970 975
Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe980 985 990Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val995 1000 1005Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile1010 1015 1020Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser1025 1030 1035Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala1040 1045 1050Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly1055 1060 1065His Val Asn Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val1070 1075 1080Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val1085 1090 1095Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile1100 1105 1110
Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg1115 1120 1125His Gln Val Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser1130 1135 1140Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu1145 1150 1155Lys Arg Lys Ala Asp1160<210>27<211>25<212>PRT<213>大鼠<220>
<221>肽<222>(1)..(25)<223>大鼠PEP4<400>27
Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn1 5 10 15Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu20 25<210>28<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>富含PRO/SER的肽<220>
<221>肽<222>(1)..(17)<223>合成肽<400>28Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Pro1 5 10 15
Ser<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CA-NA-2F<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(25)<223>CA-NA-2F引物<400>29aagcaccatt gaattctgca gttcc 25<210>30
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CA-NA-3R<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(28)<223>
<400>30aactgcagta ctgagctcct ccatctgc 28<210>31<211>33<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>正向5′<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(33)<223>正向引物<400>31gtcgcggatc catggagacc ctttttgctc ttc 33<210>32<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向5′<220>
<221>引物_結合
<222>(1)..(27)<223>反向引物<400>32gttctcgagt tatgaagttt tactcag 27<210>33<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向5′-1<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(29)<223>引物<400>33gtgcggatcc atggatttga aggagcagc 29
<210>34<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向5′-1<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(28)<223>引物<400>34gtttctcgag tgaagtttta ttcagctc28<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>5′引物<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(20)<223>引物<400>35tccaccccgg ccgcgcccaa 20<210>36<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′引物2<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(22)<223>引物<400>36aatgatgggc aaagctgtgc tg 22<210>37<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′引物<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(24)<223>引物
<400>37ggtacaaaga ttgcttatga aaca24<210>38<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′引物2<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(22)<223>引物<400>38agcagggcca aggcaatgta gg 22<210>39<211>28
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′-VL前導序列<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(28)<223>引物<400>39aatatgagtc ctgcccagtt cctgtttc28<210>40<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′-Ck
<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(32)<223>引物<400>40ttaggaattc ctaacactct cccctgttga ag 32<210>41<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′-VH前導序列<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(31)<223>引物
<400>41aatatggatt ttgggctgat tttttttatt g31<210>42<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′-CH鉸合部<220>
<221>引物_結合<222>(1)..(24)<223>引物<400>42aattgggcaa cgttgcaggt gacg24<210>43
<211>663<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>misc_結合<222>(1)..(663)<223>11C7重鏈可變區<400>43atggattttg ggctgatttt ttttattgtt ggtcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg 60aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt120gtagtctcag gattcgattt tagaagaaat tggatgagtt gggtccggca ggctcctggg180aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtaagataaa ctatacgcca240tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaatgcca agaatacgct gtacctgcaa300gtgagcacag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgtgagacc ggtctggatg360tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc caaaacgaca420cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc480ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga540
tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg600agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt660gcc 663<210>44<211>717<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>misc_結合<222>(1)..(717)<223>11C7輕鏈可變區<400>44atgagtcctg cccagttcct gtttctgtta gtgctctgga ttcgggaaac cagcggtgat 60gttctgttga cccagactcc tctcactttg tcgataacca ttggacaacc agcctccatc120tcttgcaagt caagtcagag cctcttgcat agtgatggaa agacatattt gaattggttg180ttacagaggc caggccagtc tccaaagcgc ctaatctatc tggtgtctaa actggactct240ggagtccctg acaggttcac tggcagtgga tcagggacgg atttcacact gaaaatcagc300
agagtggagg ctgaggattt gggactttat tattgctggc aaggtacaca ttttcctcag360acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc420atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg480aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa540aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc600agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc660actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggggaga gtgttag 71權利要求
1.結合分子，該結合分子能與人NogoA多肽(SEQ ID NO5)或人NiG(SEQ ID NO7)或人NiG-D20(SEQ ID NO24)或人NogoA_623-640(SEQ ID NO6)以＜1000nM的解離常數結合。
2.結合分子，該結合分子能與人NogoA多肽(SEQ ID NO5)或人NiG(SEQ ID NO7)或人NiG-D20(SEQ ID NO24)或人NogoA_623-640(SEQ ID NO6)以＜1000nM的解離常數結合并包含至少一個抗原結合位點，其中所述抗原結合位點·依次包含高變區CDR1、CDR2和CDR3，其中每一高變區與其等同高變區CDR1-11C7(SEQ ID NO8)、CDR2-11C7(SEQ ID NO9)和CDR3-11C7(SEQ ID NO10)至少50％同源；或者·依次包含高變區CDR1’、CDR2’和CDR3’，其中每一高變區與其等同高變區CDR1’-11C7(SEQ ID NO11)、CDR2’-11C7(SEQ ID NO12)和CDR3’-11C7(SEQ ID NO13)至少50％同源。
3.結合分子，該結合分子能與人NogoA多肽(SEQ ID NO5)或人NiG(SEQ ID NO7)或人NiG-D20(SEQ ID NO24)或人NogoA_623-640(SEQ ID NO6)以＜1000nM的解離常數結合并包含·第一抗原結合位點，其依次包含高變區CDR1、CDR2和CDR3，其中每一高變區與其等同高變區CDR1-11C7(SEQ ID NO8)、CDR2-11C7(SEQ ID NO9)和CDR3-11C7(SEQ ID NO10)至少50％同源；以及·第二抗原結合位點，其依次包含高變區CDR1’、CDR2’和CDR3’，其中每一高變區與其等同高變區CDR1’-11C7(SEQ ID NO11)、CDR2’-11C7(SEQ ID NO12)和CDR3’-11C7(SEQ ID NO13)至少50％同源。
4.結合分子，該結合分子包含至少一個抗原結合位點，其中所述抗原結合位點·依次包含高變區CDR1-11C7(SEQ ID NO8)、CDR2-11C7(SEQID NO9)和CDR3-11C7(SEQ ID NO10)；或者·依次包含高變區CDR1’-11C7(SEQ ID NO11)、CDR2’-11C7(SEQ ID NO12)和CDR3’-11C7(SEQ ID NO13)；或者·其直接等同物。
5.結合分子，該結合分子包含·第一抗原結合位點，其依次包含高變區CDR1-11C7(SEQ ID NO8)、CDR2-11C7(SEQ ID NO9)和CDR3-11C7(SEQ ID NO10)；以及·第二抗原結合位點，其依次包含高變區CDR1’-11C7(SEQ ID NO11)、CDR2’-11C7(SEQ ID NO12)和CDR3’-11C7(SEQ ID NO13)；或者·其直接等同物。
6.根據權利要求1-5的結合分子，其至少包含·一個免疫球蛋白重鏈或其片段，其包含(i)依次包含高變區CDR1-11C7(SEQ ID NO8)、CDR2-11C7(SEQ ID NO9)和CDR3-11C7(SEQ ID NO10)的可變結構域和(ii)人重鏈的恒定部分或其片段；和·一個免疫球蛋白輕鏈或其片段，其包含(i)依次包含高變區CDR1’-11C7(SEQ ID NO11)、CDR2’-11C7(SEQ ID NO12)和CDR3’-11C7(SEQ ID NO13)的可變結構域和(ii)人輕鏈的恒定部分或其片段；或者·其直接等同物。
7.根據權利要求6的結合分子，其中人重鏈的恒定部分或其片段為γ4型并且人輕鏈的恒定部分或其片段為κ型。
8.根據權利要求1-7的結合分子，該結合分子為嵌合的或人源化的單克隆抗體。
9.結合分子，該結合分子包含如SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示的多肽序列。
10.多核苷酸，該多核苷酸包含編碼根據權利要求1-9中任意一項所述的結合分子的多核苷酸。
11.多核苷酸，該多核苷酸包含·如SEQ ID NO14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示的多核苷酸序列；或者·如SEQ ID NO17、SEQ ID NO18和SEQ ID NO19所示的多核苷酸序列。
12.表達載體，該表達載體包含根據權利要求10或11所述的多核苷酸。
13.包含根據權利要求10或11所述多核苷酸的表達系統，其中當所述表達系統或其部分在相容的宿主細胞中存在時，所述的表達系統或其部分能產生權利要求1-9中任意一項所述的多肽。
14.經分離的宿主細胞，該宿主細胞包含根據權利要求13的表達系統。
15.根據權利要求1-9中任意一項所述的結合分子作為藥物的用途。
16.根據權利要求1-9中任意一項所述的結合分子在治療神經修復中的用途。
17.藥物組合物，該藥物組合物包含根據權利要求1-9中任意一項所述的結合分子與至少一種可藥用載體或稀釋劑的聯合。
18.治療與神經修復相關的疾病的方法，該方法包括對需要此種治療的受試者施用有效量的根據權利要求1-9中任意一項所述的結合分子。
全文摘要
本發明涉及這樣的分子，例如單克隆抗體或其片段，其能與人NogoA多肽或人NiG或人NiG－或人NogoA_623－640以＜1000nM的解離常數結合；涉及編碼此種結合分子的多核苷酸；涉及包含此類多核苷酸的表達載體；涉及此種結合分子在治療神經修復中的用途；涉及包含此種結合分子的藥物組合物；還涉及治療與神經修復相關的疾病的方法。
文檔編號C12N15/13GK1747971SQ200380109622
公開日2006年3月15日 申請日期2003年12月9日 優先權日2002年12月10日
發明者C·巴爾斯克, A·K·米爾, T·厄特爾, L·施內爾, M·E·施瓦布, A·維塔利蒂, M·祖里尼 申請人:諾瓦提斯公司, 蘇黎士大學