專利名稱：酵母啟動子的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的酵母啟動子。更具體而言，本發明涉及一種具有轉錄啟動子活性的新的DNA序列、一種包含所述序列的表達載體、以及其在生產重組蛋白質，例如，異源蛋白質中的用途。此外，本發明還涉及包含所述DNA序列的重組細胞。
背景技術：
近年來，通過對酵母應用遺傳工程技術，試圖制備出可以大量生產諸如藥品或食品等有用的蛋白質的酵母菌株。為了生產異源蛋白質，已知有將編碼異源蛋白質的異源基因導入釀酒酵母屬的酵母，尤其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，以下簡稱為S.cerevisiae)中的技術。為了在釀酒酵母細胞中表達包括基因組DNA、cDNA等的異源基因，需要所述異源基因的上游連接能夠在酵母中表達的啟動子。
所述的啟動子是可以指導目的蛋白質在酵母中大量表達的啟動子，到目前為止已經發現了幾種強啟動子。例如，3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)基因的啟動子(非專利文獻1)翻譯延長因子啟動子(TEF1)(非專利文獻2)等，已知當將它們用作釀酒酵母中的啟動子時可表現出高表達水平，已經將其用于在酵母中表達異源基因。
非專利文獻1Ogden等人，1986，Mol.Cell.Biol.，6(12)，p.4335-4343非專利文獻2Cottrelle等人，1985，J.Biological Chemistry，260(5)，p.3090-3096發明內容(本發明要解決的技術問題)本發明的一個目的在于提供一種與以酵母為宿主的異源基因表達系統中所用的已知啟動子相比更為有效的啟動子。
(解決問題的技術手段)
為了實現本發明的目的，本發明人對釀酒酵母中的基因表達情況進行了深入的研究，結果，從釀酒酵母染色體成功地獲得了包含有效啟動子的DNA片段，由此完成了本發明。
本發明涉及一種具有酵母轉錄啟動子活性的DNA片段，所述的DNA片段具有如SEQ ID NO1所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列3’-末端的部分序列，或可與互補于如SEQ ID NO1所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列3’-末端的部分序列雜交、且保持上述全部或一部分序列的轉錄啟動子活性的序列。本發明還涉及一種表達質粒，其包含所述的DNA序列以及位于該DNA序列下游的異源基因。本發明進一步涉及一種用上述表達質粒轉化宿主細胞所得的轉化體。本發明更進一步涉及一種生產異源蛋白的方法，該方法包含培養所述的轉化體，并從培養物中回收異源蛋白質。
具體地，本發明包含下述實施方案(A)到(K)。
(A)一種具有酵母轉錄啟動子活性的DNA片段，所述的DNA片段具有如SEQ ID NO1所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列3’-末端的部分序列，或可與互補于如SEQ ID NO1所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列3’-末端的部分序列雜交、且保持上述全部或一部分序列的轉錄啟動子活性的序列；(B)如(A)所述的DNA片段，其中所述的部分DNA序列是包含自SEQ ID NO1所示的DNA序列的3’-末端起至少650bp的序列的DNA序列(即SEQ ID NO6；相當于SEQ ID NO1的第751位到1400位的核苷酸)；(C)如(A)或(B)所述的DNA片段，其中所述的部分DNA序列是包含自SEQ ID NO1所示的DNA序列的3’-末端起至少820bp的序列的DNA序列(即SEQ ID NO5；相當于SEQ ID NO1的第581位到1400位的核苷酸)；(D)如(A)到(C)中任一項所述的DNA片段，其中所述的部分DNA序列是包含自SEQ ID NO1所示的DNA序列的3’-末端起至少950bp的序列的DNA序列(即SEQ ID NO4；相當于SEQ ID NO1的第451位到1400位的核苷酸)；(E)如(A)到(D)中任一項所述的DNA片段，其中所述的部分DNA序列是包含自SEQ ID NO1所示的DNA序列的3’-末端起至少1100bp的序列的DNA序列(即SEQ ID NO3；相當于SEQ ID NO1的第301位到1400位的核苷酸)；(F)如(A)到(E)中任一項所述的DNA片段，其中所述的部分DNA序列是包含自SEQ ID NO1所示的DNA序列的3’-末端起至少1258bp的序列的DNA序列(即SEQ ID NO2；相當于SEQ ID NO1的第143位到1400位的核苷酸)；(G)一種重組DNA片段，其包含(A)到(F)中任一項所述的DNA片段，和位于所述的DNA序列下游的編碼異源蛋白質的基因；(H)一種表達質粒，其包含(G)中所述的重組DNA片段；(I)一種宿主細胞，其帶有(G)中所述的重組DNA片段，或(H)中所述的表達質粒；(J)(I)中所述的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是酵母；和(K)一種生產異源蛋白質的方法，其包含培養上述(I)或(J)中所述的宿主細胞，并從培養物中回收異源蛋白質。
(發明效果)本發明的DNA片段包含在酵母中具有高啟動子活性的序列。將包含本發明的DNA片段和與之相連的異源基因的質粒導入宿主，特別是酵母中，可使所述的異源基因高水平表達。
附圖的簡要說明
圖1-1是質粒pKHA030的結構圖。
圖1-2是質粒pKHA030的結構圖(續)。
圖2是啟動子NCE102的各個片段。
圖3是啟動子NCE102及其他啟動子對rHSA的表達水平的火箭免疫電泳圖。
圖4是用啟動子NCE102及其他啟動子的HSA-mRNA水平的比率。
圖5是用啟動子NCE102的各個片段的HSA-mRNA水平的比率。
本發明的具體實施方式
本發明的具有啟動子活性的DNA片段具有如SEQ ID NO1所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列3’-末端的部分序列。該DNA片段位于酵母中的NCE102基因的開放閱讀框的上游，是包含啟動子區域的片段。
除如SEQ ID NO1所示的序列之外，本發明的具有啟動子活性的DNA片段包含自SEQ ID NO1所示的的DNA序列3’-末端起至少650bp的DNA序列(即SEQ ID NO6)。更優選地，本發明的具有啟動子活性的DNA片段是包含自SEQ ID NO1所示的的DNA序列3’-末端起至少820bp的DNA序列(即SEQ ID NO5)。
本發明的具有啟動子活性的DNA片段還包含可與互補于如SEQID NO1所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列3’-末端的部分序列雜交、且保持如SEQ ID NO1所示序列的全部或部分序列的轉錄啟動子活性的序列。所述的DNA序列還包含在如SEQ ID NO1所示的的DNA序列的全部或包含其3’-末端的部分DNA序列中任意堿基發生缺失、取代或添加及其組合，但仍保持啟動子活性的序列。
此處所用的，″可與......雜交的DNA序列″指可在嚴格條件下雜交的DNA序列。
此處所用的術語″啟動子″指下述的任何DNA序列，即與所述啟動子不存在時相比，在該啟動子與宿主細胞中的結構基因連接時可以促進該結構基因的轉錄、翻譯或mRNA的穩定。此外，此處所用的術語″異源基因″是指在自然狀態下不與某種特定的啟動子在功能上共存的任意基因，其與所述基因是否來源于該特定的生物無關。此處所用的術語″DNA″、″基因″和″基因DNA″基本上彼此之間可以作為同義詞語互換使用。
本發明的包含酵母啟動子的DNA片段可以是利用本領域慣用的核酸合成技術完全合成的。
將包含本發明的啟動子的DNA片段的下游連接的異源基因(以下也稱為″連接啟動子的異源基因″)引入酵母，即可獲得由本發明的啟動子調控其中的異源基因表達的酵母細胞。
將連接啟動子的異源基因引入到酵母中可以通過，例如Hinnen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929-1933，1978的文獻中所述的方法。具體說來，可以將連接啟動子的異源基因整合到載體中，再將所述載體導入到酵母細胞的方法，或將所述基因直接導入到酵母細胞的方法等。
本發明提供一種表達質粒，其是將含有下述DNA片段的DNA連接于載體中獲得的，所述的DNA片段是含有啟動子基因的DNA片段，和連接有定位于其下游的異源基因的DNA片段。
用于構建表達質粒的載體包括例如，Hinnen等人所述的基于酵母2μmDNA的載體，以及通常用于酵母的載體，例如″YRp″載體，即以酵母染色體ARS序列為復制起點的酵母用多拷貝載體；″YEp″載體，即具有酵母2μmDNA復制起點的酵母用多拷貝載體；″YCp″載體，即以酵母染色體ARS序列為復制起點、并具有酵母染色體著絲粒DNA序列的酵母用單拷貝載體；和″YIp″載體，即不帶有酵母復制起點的、用于向酵母染色體中整合的載體。
連接的異源基因包括但不局限于，例如人血清白蛋白(以下也稱為″rHSA″)基因。所連接的異源基因并不限于用于表達其所編碼的基因產物，還包括通過反義RNA調控表達。
表達載體可連接用于選擇轉化子的標記基因，例如LEU2基因，或與待轉化的宿主的種類相適應的終止子，例如ADH1基因的終止子。
表達質粒轉化酵母宿主細胞的方法，可以是但不限于，例如電穿孔法等。
接受表達質粒轉化的酵母宿主細胞包括但不限于，釀酒酵母(S.cerevisiae)。
可以通過培養本發明的轉化體使異源基因表達，由此生產所述的異源蛋白質。可表達的異源蛋白質包括但不局限于，例如人血清白蛋白或免疫球蛋白等在醫療領域有用的物質。
下面，通過實施例對本發明進行詳細說明，但這些實施例不作為對本發明的任何限制。
實施例1克隆啟動子以及構建rHSA表達質粒利用釀酒酵母S288C菌株的基因組DNA為模板，以下述的合成DNA為引物通過Pwo DNA聚合酶(Roche)進行PCR(第一PCR)，所述合成DNA為合成DNA HA023ATAGCGGCCGCAGAATGCAATGCGGCTTTTGTTTG(SEQ ID NO11)和合成DNA HA024TATGGGATTATATTGTTATTAGGTATGCTTTGAGA(SEQ IDNO12)。所述的第一PCR條件包含94℃，15秒，47℃，30秒和72℃，45秒組成的循環30次，以及最后在72℃保溫5分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳在約0.83kbp大小的位置切出第一PCR產生的第一PCR產物。
混合下述的合成DNA，在96℃下保溫10分鐘后，冷卻至室溫進行退火，所述合成DNA為HA005ATGAAGTGGGTTTTCATCGTCTCCATTTTGTTCTTGTTCTCCTCTGCTTACTCTA(SEQ ID NO13)和HA006GATCTAGAGTAAGCAGAGGAGAACAAGAACAAAATGGAGACGATGAAAACCCACTTCAT(SEQ ID NO14)。
經退火的合成DNA接頭HA005/HA006和第一PCR產物在它們的平末端相連。接下來以該連接反應液為模板，以下述合成DNA為引物進行PCR(第二PCR)，所述的合成DNA為合成DNAHA030ATCCAAAGATCTAGAGTAAGCAGAGGAGAACAAGAAC(SEQ ID NO15)和合成DNA HA039AAGGAAAAAAGCGGCCGCAGAATGCAATGCGGCTTTTGTTTG(SEQ ID NO16)。所述的第二PCR條件包含94℃，15秒，53℃，30秒和72℃，45秒組成的循環30次，以及最后在72℃下保溫5分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳在約0.83kbp大小的位置切出第二PCR產生的第二PCR產物。
用限制性內切酶NotI和BglII消化經純化的第二PCR產物，確認并切出在瓊脂糖凝膠上電泳至相當于約0.90kbp大小的位置的消化產物。
通過將該消化產物與rHSA表達質粒pDB2305的包含PRB1啟動子的NotI-BgIII區域置換，構建新的rHSA表達質粒pKHA030，其中，所述的rHSA表達質粒pDB2305來自于rHSA表達質粒pDB2244(WO00/44772)。
上述的本發明的啟動子的克隆以及rHSA表達質粒的構建如圖1所示。
實施例2啟動子的核苷酸序列的確認通過以pKHA030為模板，利用CEQ DTCS-Quick Start試劑盒(Beckman Coulter K.K.)進行PCR，由CEQ2000XL堿基序列讀取裝置以(Beckman Coulter K.K.)Sanger法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-5467，1977)確認實施例1中克隆的區域的堿基序列。
實施例3啟動子區域的修飾本發明的發明人除了釀酒酵母S288C菌株基因組DNA中的啟動子區域(820bp)之外，進一步研究了所述啟動子上游580bp的區域，制備了這一1400bp的區域以及在其5′末端進行不同程度缺失所得的多個片段。其中，將基因組DNA中本發明的啟動子的基因產物翻譯起始位點(AUG密碼子的A)為0，其上游的啟動子區域(820bp)為″-820bp″(SEQ ID NO5；相當于SEQ ID NO1中第581位到第1400位的核苷酸)。以與實施例1和實施例2所述相同的方法制備下述各DNA片段(圖2)，并分別構建rHSA表達質粒(表1)″-1400bp″(即SEQ IDNO1；相當于SEQ ID NO1的第1位到1400位的核苷酸)；″-1258bp″(即SEQ ID NO2；相當于SEQ ID NO1的第143位到1400位的核苷酸)；″-1100bp″(即SEQ ID NO3；相當于SEQ ID NO1的第301位到1400位的核苷酸)；″-950bp″(即SEQ ID NO4；相當于SEQ ID NO1的第451位到1400位的核苷酸)；″-650bp″(即SEQ ID NO6；相當于SEQ ID NO1的第751位到1400位的核苷酸)；″-500bp″(即SEQ ID NO7；相當于SEQ ID NO1的第901位到1400位的核苷酸)；″-350bp″(即SEQ ID NO8；相當于SEQ ID NO1的第1051位到1400位的核苷酸)；″-200bp″(即SEQ ID NO9；相當于SEQ ID NO1的第1201位到1400位的核苷酸)；″-50bp″(即SEQ ID NO10；相當于SEQ ID NO1的第1351位到1400位的核苷酸)；和″-0bp″。
表1
實例4篩選酵母轉化體依照Hinnen等人文獻中記載的方法，將質粒pKHA030和實施例3中構建的各rHSA表達質粒導入到釀酒酵母菌株(cir0a，leu2-3，leu2-112，can1，pra1，yap3，hsp150)中。在缺失亮氨酸的緩沖基本瓊脂培養基
中篩選轉化子。
實施例5評估分泌的rHSA的表達水平在30℃下，將所得的轉化子在含有10mL緩沖基本液體培養基
的50mL燒瓶中，以200rpm培養96小時，通過火箭免疫電泳評價rHSA的表達水平。首先，將所述培養液(N＝5)離心并分別回收上清液。將各4μL上清液添加到含抗-人白蛋白抗體(Sigma)的1.0％(w/v)瓊脂糖凝膠中進行電泳。將電泳后的凝膠用考馬斯亮藍(R-250)染色，通過觀察所獲得的火箭樣的峰的高度比較各培養物上清液中的rHSA水平。
如圖3所示，與引入了包含PGK1啟動子、TEF1啟動子的質粒的酵母相比，引入了包含NCE102啟動子(-820bp)的質粒pKHA030的酵母中rHSA表達水平顯著提高。
實施例6對HSA-mRNA轉錄水平的評估在30℃下，將實例4中所得的轉化子在含有10mL緩沖基本液體培養基
的50mL燒瓶中，以200rpm培養72小時后回收酵母菌體。用RNeasyMini試劑盒(QIAGEN)從回收的菌體中提取總RNA，同時用DNase進行處理。
以所提取的總RNA為模板，利用下述合成DNA以及QuantiTectSYBR Green RT-PCR試劑盒(QIAGEN)，通過LightCycler系統(Roche)比較各啟動子的轉錄活性，所述的合成DNA指用于檢測HSA基因的合成DNA，即合成DNA HA045GTCCGAAGTCGCTCACAGATTCAA(SEQ ID NO17)和合成DNA HA046GCAGATTCGTCAGCAACACAAGTC(SEQ ID NO18)，或用于檢測PGK1基因的合成DNA HA062GCGTGTCTTCATCAGAGTTGACTTC(SEQ ID NO19)和合成DNA HA063CCAAGTGAGAAGCCAAGACAACGTA(SEQ ID NO20)。將該混合物先在50℃下溫育20分鐘進行反轉錄，然后在96℃下熱變性15分鐘。然后，通過40次由94℃下15秒，53℃下20秒和72℃下10秒三個步驟組成的循環測定由HA045/HA046擴增的HSA基因片段和由HA062/HA063擴增的PGK1基因片段的擴增量，其中，假定在各樣品中HSA-cDNA量和PGK1-cDNA量的絕對值與它們兩者相應的mRNA量相等。各啟動子的轉錄活性用HSA-mRNA量/PGK1-mRNA量(以下簡稱″HSA-mRNA量比)量化。
與引入了包含PGK1啟動子、TEF1啟動子的質粒的酵母的HAS-mRNA量比相比，引入了包含NCE102啟動子(-820bp)的質粒pKHA030的酵母中HSA-mRNA量的比率顯著提高。(圖4)制備NCE102啟動子的各個片段時，如圖5所示，HSA-mRNA量比發生變化，使用比650bp(SEQ ID NO6；相當于SEQ ID NO1中第751位到1400位的核苷酸)長的啟動子片段時，HSA-mRNA量比升高。
序列表<110>Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute<120>酵母啟動子<130>666117<140>JP 2004-230227<141>2004-08-06<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1400<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>misc_feature<223>啟動子<400>1atgaacatat atgaagttgc acacatcagc gggaaagatg tctctaccgc tcgaggagcc 60acacgtttga tttgcaatcc atgaaataga actgctaatc ccatatacaa ttaactatat120caatttcctg aacaaagaga ttacaatcaa cggcaaagcc gcctgcctct ccggagatct180ccttttttct tctttctttt gtcctatgtt gcatagttgc tcatgtcttt tccttaggcg240gacaattaag agcagccaca atatttccaa aactaaattg ctaaaaaagc gtagcaaaaa300attctcgtca ttcccacttt ccctacctta acccttgatg ttaacgccgt ttcgctcatc360ggaacaaact atacagataa ttaagctttt cggcagcggt gagaaaggaa gcagccagga420ggaatacgcg gctttctcgc ggagcccgat tgccgataca aaggaactgt tgcctcctcc480cggctatttc cataggcctt cattcagcat actgttgtgt agttgcatca catccttgtt540gaatgaattc caactatttc gataaaccat cccatgaagg agaatgcaat gcggcttttg600tttgtaaacg ggcttgagag gttctatgcg gttaattctg tcactagggg tccgaatctc660ggattaagta taaaatatgt attaccctga tgattgaccg gatgatgtaa ggatgcatgt720ccctactgtt ttggtatttc cacatacgga cggggccccg aaacaccacc cccattttaa780cggccgcatc tgagcatcgg cccatttggc acacgcccgt tagtgacgtt ggtaggggca840tttccctgag gtaggcccaa ggttgcttta aaaggtccat cgcaaacccc ttgtccgcgg900acctctgcgt cataattaaa atgcccaaaa cataaaagtg atcgccccct cacagaaact960tatgggcagc ttgctgcctt aacggaattg actagaattg gtttgatttt tttttcttcc 1020tacttcttct tccatttccc tcccctcttc ctcatatatg tatacagaaa aatcataccc 1080ctataaattc cttggcccca atcttctgtc agattttcct ttataaaaga gtctttgttt 1140
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<221>misc_feature<223>啟動子<400>5agaatgcaat gcggcttttg tttgtaaacg ggcttgagag gttctatgcg gttaattctg 60tcactagggg tccgaatctc ggattaagta taaaatatgt attaccctga tgattgaccg120gatgatgtaa ggatgcatgt ccctactgtt ttggtatttc cacatacgga cggggccccg180aaacaccacc cccattttaa cggccgcatc tgagcatcgg cccatttggc acacgcccgt240tagtgacgtt ggtaggggca tttccctgag gtaggcccaa ggttgcttta aaaggtccat300cgcaaacccc ttgtccgcgg acctctgcgt cataattaaa atgcccaaaa cataaaagtg360atcgccccct cacagaaact tatgggcagc ttgctgcctt aacggaattg actagaattg420gtttgatttt tttttcttcc tacttcttct tccatttccc tcccctcttc ctcatatatg480tatacagaaa aatcataccc ctataaattc cttggcccca atcttctgtc agattttcct540ttataaaaga gtctttgttt tgtaattaaa agatactttt ttctttcttc ttctacgtct600cctttttttt ttttaagaaa atttaactta taccactatt ttgttcgcaa ttgatcaaga660aaaaatacaa ttgaaaaggt tttacatttt taatttttct gctcatcgcg cttttttaaa720aggataaata aacatttctt taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt taaaaaaact780tttcttctca aagcatacct aataacaata taatcccata 820<210>6<211>650<212>DNA<213>釀酒酵母<220>
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<223>啟動子<400>6cggggccccg aaacaccacc cccattttaa cggccgcatc tgagcatcgg cccatttggc 60acacgcccgt tagtgacgtt ggtaggggca tttccctgag gtaggcccaa ggttgcttta120aaaggtccat cgcaaacccc ttgtccgcgg acctctgcgt cataattaaa atgcccaaaa180cataaaagtg atcgccccct cacagaaact tatgggcagc ttgctgcctt aacggaattg240actagaattg gtttgatttt tttttcttcc tacttcttct tccatttccc tcccctcttc300ctcatatatg tatacagaaa aatcataccc ctataaattc cttggcccca atcttctgtc360agattttcct ttataaaaga gtctttgttt tgtaattaaa agatactttt ttctttcttc420ttctacgtct cctttttttt ttttaagaaa atttaactta taccactatt ttgttcgcaa480ttgatcaaga aaaaatacaa ttgaaaaggt tttacatttt taatttttct gctcatcgcg540cttttttaaa aggataaata aacatttctt taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt600taaaaaaact tt tcttctca aagcatacct aataacaata taatcccata 650<210>7<211>500<212>DNA<213>釀酒酵母<220>
<221>misc_feature<223>啟動子<400>7acctctgcgt cataattaaa atgcccaaaa cataaaagtg atcgccccct cacagaaact 60tatgggcagc ttgctgcctt aacggaattg actagaattg gtttgatttt tttttcttcc120tacttcttct tccatttccc tcccctcttc ctcatatatg tatacagaaa aatcataccc180ctataaattc cttggcccca atcttctgtc agattttcct ttataaaaga gtctttgttt240tgtaattaaa agatactttt ttctttcttc ttctacgtct cctttttttt ttttaagaaa300atttaactta taccactatt ttgttcgcaa ttgatcaaga aaaaatacaa ttgaaaaggt360tttacatttt taatttttct gctcatcgcg cttttttaaa aggataaata aacatttctt420taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt taaaaaaact tttcttctca aagcatacct480aataacaata taatcccata500<210>8<211>350<212>DNA<213>釀酒酵母<220>
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<223>啟動子<400>8ctcatatatg tatacagaaa aatcataccc ctataaattc cttggcccca atcttctgtc 60agattttcct ttataaaaga gtctttgttt tgtaattaaa agatactttt ttctttcttc120ttctacgtct cctttttttt ttttaagaaa atttaactta taccactatt ttgttcgcaa180ttgatcaaga aaaaatacaa ttgaaaaggt tttacatttt taatttttct gctcatcgcg240cttttttaaa aggataaata aacatttctt taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt300taaaaaaact tttcttctca aagcatacct aataacaata taatcccata 350<210>9<211>200<212>DNA<213>釀酒酵母<220>
<221>misc_feature<223>啟動子<400>9atttaactta taccactatt ttgttcgcaa ttgatcaaga aaaaatacaa ttgaaaaggt 60tttacatttt taatttttct gctcatcgcg cttttttaaa aggataaata aacatttctt120taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt taaaaaaact tttcttctca aagcatacct180aataacaata taatcccata200<210>10<211>50<212>DNA<213>釀酒酵母<400>10taaaaaaact tttcttctca aagcatacct aataacaata taatcccata50<210>11<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用作PCR引物的合成DNA
<400>11atagcggccg cagaatgcaa tgcggctttt gtttg35<210>12<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用作PCR引物的合成DNA<400>12tatgggatta tattgttatt aggtatgctt tgaga35<210>13<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用作PCR引物的合成DNA<400>13atgaagtggg ttttcatcgt ctccattttg ttcttgttct cctctgctta ctcta 55<210>14<211>59<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用作PCR引物的合成DNA<400>14gatctagagt aagcagagga gaacaagaac aaaatggaga cgatgaaaac ccacttcat 59<210>15<211>37<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>用作PCR引物的合成DNA<400>15atccaaagat ctagagtaag cagaggagaa caagaac 37<210>16<211>42<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用作PCR引物的合成DNA<400>16aaggaaaaaa gcggccgcag aatgcaatgc ggcttttgtt tg42<210>17<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用作PCR引物的合成DNA<400>17gtccgaagtc gctcacagat tcaa24<210>18<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用作PCR引物的合成DNA<400>18gcagattcgt cagcaacaca agtc24
<210>19<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用作PCR引物的合成DNA<400>19gcgtgtcttc atcagagttg acttc 25<210>20<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用作PCR引物的合成DNA<400>20ccaagtgaga agccaagaca acgta 2權利要求
1.一種具有酵母轉錄啟動子活性的DNA片段，所述的DNA片段具有如SEQ ID NO1所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列3’-末端的部分序列，或具有可與互補于如SEQ ID NO1所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列3’-末端的部分序列雜交的、且保持如SEQ ID NO1所示序列的全部或部分序列的轉錄啟動子活性序列。
2.如權利要求1所述的DNA片段，其中所述的部分DNA序列是包含自SEQ ID NO1所示的DNA序列的3’-末端起至少650bp的序列，即SEQ ID NO6的DNA序列。
3.如權利要求1或2所述的DNA片段，其中所述的部分DNA序列是包含自SEQ ID NO1所示的DNA序列的3’-末端起至少820bp的序列，即SEQ ID NO5的DNA序列。
4.權利要求1～3中任一項所述的DNA片段，其中所述的部分DNA序列是包含自SEQ ID NO1所示的DNA序列的3’-末端起至少950bp的序列，即SEQ ID NO4的DNA序列。
5.權利要求1～4中任一項所述的DNA片段，其中所述的部分DNA序列是包含自SEQ ID NO1所示的DNA序列的3’-末端起至少1100bp的序列，即SEQ ID NO3的DNA序列。
6.權利要求1～5中任一項所述的DNA片段，其中所述的部分DNA序列是包含自SEQ ID NO1所示的DNA序列的3’-末端起至少1258bp的序列，即SEQ ID NO2的DNA序列。
7.一種重組DNA片段，其包含權利要求1～6中任一項所述的DNA片段和位于所述DNA序列下游的編碼異源蛋白質的基因。
8.一種表達質粒，其包含如權利要求7所述的重組DNA片段。
9.一種宿主細胞，其通過如權利要求7所述的重組DNA片段，或權利要求8所述的表達質粒轉化得到。
10.如權利要求9所述的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是酵母。
11.一種制備異源蛋白質的方法，其包含培養如權利要求9或10所述的宿主細胞，并從培養物中回收異源蛋白質。
全文摘要
本發明提供一種在酵母中具有高啟動子活性的DNA片段。本發明涉及一種具有酵母轉錄啟動子活性的DNA片段，所述的DNA片段具有SEQ ID NO1所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列3’－末端的部分序列，或可與互補于如SEQ ID NO1所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列3’－末端的部分序列雜交、且保持如SEQ IDNO1所示序列全部或一部分序列的轉錄啟動子活性的序列；一種表達質粒，其由包含所述的DNA序列以及位于該DNA序列下游的編碼異源蛋白質的基因的重組DNA片段構成；一種由所述的重組DNA片段或所述的表達質粒轉化得到的酵母宿主細胞；一種制備異源蛋白質的方法，其包含培養所述的宿主細胞，并從培養物中回收異源蛋白質。本發明的提供一種用于以酵母為宿主的異源基因表達系的有效啟動子。
文檔編號C12N15/81GK101035895SQ20058003410
公開日2007年9月12日 申請日期2005年8月2日 優先權日2004年8月6日
發明者米田明廣, 中原洋, 樋口浩文 申請人:財團法人化學及血清療法研究所