專利名稱：：α-淀粉酶變體的制作方法a-淀粉酶變體發明領域本發明涉及，特別是親本Termamyl-樣a-淀粉酶的新變體，尤其是顯示改變的特性的變體，特別是改變了淀粉親和力(相對于親本)，對于所述變體的應用，特別是工業淀粉處理(processing)(如淀粉液化或糖化)，這是有利的。發明背景oc-淀粉酶(a-l,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2丄1)組成催化淀粉和其它直鏈及支鏈1,4-葡糖苷寡糖和多糖水解的一組酶。有大量的專利和科學文獻涉及此類在工業上十分重要的酵。許多a-淀粉酶，例如Te腿myl-樣a-淀粉酶可了解自，如WO90/11352、WO95/10603、WO95/26397、WO96/23873、WO96/23874和WO97/41213。在最近涉及a-淀粉酶的公開內容中，WO96/23874提供了稱為BA2的Termamyl-樣a-淀粉酶的三維X-射線晶體結構數據，BA2由包含本文SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌CS.w^/o/z'，e/ac/era)a-淀粉酶的300個N-末端氨基酸殘基，以及包含本文SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌(B.//c/7em/0rm&)a-淀粉酶的C-末端的氨基酸301-483(后者可以商品名TermamyFM購得)組成，因此與工業上重要的芽孢桿菌a-淀粉酶(其在本文中包括在術語"Termamyl-樣a-淀粉酶"的含義中，尤其包括地衣芽孑包桿菌，解淀粉芽孢桿菌，和嗜熱脂肪芽孢桿菌(及5^^0^2￡/7^^/2//1)01-淀粉酶)密切相關。WO96/23874進一步描述了在對親本Termamyl-樣a-淀4分酶的結構分析的基礎上，設計相對于親本顯示改變的特性的親本Termamyl-樣a-淀粉酶變體的方法學。發明簡述本發明涉及Termamyl-樣a-淀粉酶的新的a-淀粉分解變體(突變體)，特別是顯示出改變的淀粉親和力(相對于親本)的變體，所述改變在淀粉的工業處理方面(淀粉液化，糖化等等)是有利的。本發明人發現與親本Termamyl-樣a-淀粉酶相比，具有改變的特性、特別是改變的淀粉親和力(a伍nity)的變體改善了淀粉的轉化。本發明進一步涉及編碼本發明變體的DNA構建體，包含本發明變體的組合物，制備本發明變體的方法，以及本發明變體和組合物單獨或與其它a-淀粉分解酶(alpha-amylolyticenzymes)聯合在各種工業處理中的應用，如淀粉液化，在洗滌劑組合物中，例如洗衣、清洗碗碟(dishwashing)和硬表面清洗組合物；乙醇生產，例如燃料，酒類和工業乙醇生產；紡織品(textile)、織物(fabric)或衣物的退漿等。命名法在本說明書和權利要求書中，使用了常規的單字母和三字母編碼表示氨基酸殘基。為便于引用，本發明的a-淀粉酶變體采用下列命名法描述原氨基酸位置取代的氨基酸依照該命名法，例如用天冬酰胺取代第30位的丙氨酸表示為Ala30Asn或A3ON在相同位置處丙氨酸的缺失表示為Ala30*或A30*以及額外的氨基酸殘基例如賴氨酸的插入表示為Ala30AlaLys或A3OAK缺失連續的一段氨基酸殘基，例如氨基酸殘基30-33,表示為(30-33)*或A(A30-N33)。在特定的a-淀粉酶相對于其它a-淀粉酶而言含有"缺失"，并在該位置具有插入，如在第36位插入天冬氨酸的情況下，表示為*36Asp或*36D多個突變由加號隔開，即Ala30Asn+Glu34Ser或A30N+E34S分別表示在第30和34位，天冬酰胺和絲氨酸取代了丙氨酸和谷氨酸。當在給定位置插入一個或多個可選擇的氨基酸殘基時，其表示為A30N,E或A3ON或A30E此外，當本文鑒定出適于修飾的位置，而沒有暗示任何具體的修飾時，應當理解為可用任一氨基酸殘基取代該位置存在的氨基酸殘基。因此，例如，當提及修飾第30位的丙氨酸，但未具體說明時，應當理解為丙氨酸可缺失，或可用任何其他氨基酸，即下列任一氨基酸來取代R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。此外，"A30X"表示任何一種下列取代A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y或A30V;或簡言之A30R,N,D,C,Q，E，G，H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y，V。如果使用這種編號方式的親本酶已具有建議在該位置被取代的所述氨基酸殘基，在例如N或V之一存在于野生型中的情況下，使用下列命名法"X30N"或"X30N,V"。因此，其表示其他相應的親本酶在第30位被"Asn"或"Val"取代。氨基酸殘基特性帶電氨基酸Asp、Glu、Arg、Lys、His帶負電荷氨基酸(帶有最多負電荷的殘基列于最前)Asp、Glu帶正電荷氨基酸(帶有最多正電荷的殘基列于最前)Arg、Lys、His中性氨基酸Gly、Aa、Val、Leu、IJe、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Asn、Gln、Ser、Thr、Pro疏水氨基酸殘基(具有最大疏水性的殘基列于最后)Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、Ile、Tyr、Phe、Trp親水氨基酸(具有最大親水性的殘基列于最后)Thr、Ser、Cys、Gln、Asn發明詳述Termamyl-樣a-淀粉酶眾所周知，通過芽孢桿菌CBac///^w.)產生的多種a-淀粉酶在氨基酸水平上是高度同源的。例如，已發現包含SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶(商品名為TermamylTM)與包含SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌ot-淀粉酶約89%同源，與包含SEQIDNO:8中所示的氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶約79。/。同源。其他同源的a-淀粉酶包括來源于芽孢桿菌菌抹NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的a-淀粉酶，皆詳述于WO95/26397，以及Tsul(amoto等,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,151(1988),pp.25-31所描述的#707a-淀4分酶。更多同源的a-淀粉酶包括由EP0252666中所述的地衣芽孢桿菌菌抹(ATCC27811)所產生的a-淀粉酶，以及WO91/00353和WO94/18314中鑒定的a-淀粉酶。其他商用Termamyl-樣a-淀粉酶包括在以下列商品名出售的產品'中OptithermTM和TakathermTM(可購自Solvay);MaxamyFM(可購自Gist-brocades/Genencor)、SpezymAA丁m和SpezymeDeltaAA頂(可購自Ge-nencor)和Keistase丁m(可購自Daiwa)、PurastarST5000E、PURASTRATMHPAML(來自Ge腦corlnt.)。由于發現這些a-淀粉酶之間基本上同源，因此它們被認為屬于相同一類的a-淀粉酶，即"Termamyl-樣a-淀粉酶"。因此，在本發明上下文中，術語"Termamyl-樣a-淀粉酶"意在指示在氨基酸水平上具有與Termamyl,即具有本文SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶，基本上(substantial)同源的a-淀粉酶。換言之，Termamyl-樣a-淀粉酶是具有本文SEQIDNO:2、4或6中所示的氨基酸序列,和WO95/26397或Tsukamoto等，1988中的SEQIDNO:1或2所示的氨基酸序列的a-淀粉酶，或者是i)顯示與至少一種上述氨基酸序列至少60%,優選至少70%,更優選至少75%,甚至更優選至少80%，尤其是至少85%,尤其優選至少90%，甚至尤其更優選至少95%，更優選至少為97%,更優選至少99%同源性的a-淀粉酶，和/或ii)顯示與針對至少一種上述a-淀粉酶產生的抗體免疫交叉反應性的a-淀粉酶，和/或iii)由與編碼上述特定a-淀粉酶的DNA序列雜交的DNA序列編碼的a-淀粉酶，所述編碼特定a-淀粉酶的DNA序列分別示于本申請的SEQIDNO:1、3和5，以及WO95/26397的SEQIDNOS:4和5。同源性(同一性)同源性可測定為兩條序列之間的同一性水平，指示第一序列與第二序列的偏差(derivation)。可通過本領域已知的計算機程序例如GCG程序包中提供的GAP(上述的)適當地測定同源性。因此，可使用具有用于同一性的默認得分矩陣(defaultscoringmatrix)和下列默認參數的GapGCGv8:用于核酸序列比較，分別為缺口(GAP)產生罰分5.0和缺口延伸罰分0.3,以及用于蛋白序列比較，分別為缺口(GAP)產生罰分3.0和缺口延伸罰分0.1。GAP使用了Needleman和Wunsch，(1970)，J.Mol.Biol.48,p.443-453的方法進4亍比對和計算同一性。可使用Termamyl和Termamyl-樣a-淀粉酶之間的結構對比來鑒定其它Termamyl-樣a-淀粉酶中等同的/相應的位置。一種獲得所述結構對比的方法是使用GCG程序包中的PileUp程序，該程序使用默認的缺口罰分值，即缺口產生罰分3.0和缺口延伸罰分0.1。其它結構對比方法包括疏水性聚類分析(Gaboriaud等，(1987),FEBSLETTERS224，pp.149-155)和反向穿梭法(reversethreading)(Huber,T;Torda,AE,PROTEINSCIENCEVol.7,No,1pp.142-149(1998))。a-淀粉酶的特性ii)，即可使用針對相關的Termamyl-樣a-淀粉酶的至少一個表位產生的、或與之反應的抗體測定免疫交叉反應性。可以是單克隆或多克隆的所述抗體可用本領域已知的方法產生，如Hudson等,PracticalImmunology,第3版(1989),BlackwellScientificPublications中所述的。免疫交叉反應性可使用本領域已知測定法來測定，如蛋白質印跡法或放射免疫擴散，如Hudson等，1989所述。在這方面，在分別具有氨基酸序列SEQIDNOS:2、4、6或8的a-淀粉酶之間發現了免疫交叉反應性。雜交可以在所述a-淀粉酶的完整或部分核苷酸或氨基酸序列的基礎上適當地制備寡核苷酸探針，用于鑒定符合上述特性iii)的Termamyl-樣a-淀粉酶。用于檢測雜交的合適條件包括在5xSSC中預浸泡，并在20%曱酰胺、5xDenhardt's溶液、50mM磷酸鈉，pH6.8和50mg變性的經超聲處理的小牛胸腺DNA溶液中于40。C預雜交1小時，接著于40。C，在補充有100mMATP的相同溶液中雜交18小時，然后于40。C在2xSSC,0.2%SDS中洗滌濾月莫三次，每次30分鐘(低嚴謹性)，優選于50。C(中等嚴謹性)，更優選于65。C(高嚴謹性)，甚至更優選于75。C(非常高嚴謹性)。有關雜交方法的更多細節可見于Sambrook等，Molecular—Cloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,1989中。在本發明上下文中，"來源于(derivedfrom)，，并不意在只表示由所述生物菌抹產生的或可由所述生物菌抹產生的a-淀粉酶，還表示由分離自這樣的菌抹的DNA序列編碼的a-淀粉酶以及由所述DNA序列轉化的宿主生物產生的a-淀粉酶。最后，該術語還意在表示由合成的和/或cDNA來源的DNA序列編碼的，并具有所述a-淀粉酶的鑒定特征的a-淀粉酶。該術語還意在表示親本a-淀粉酶可以是天然存在的a-淀粉酶的變體，即天然存在的a-淀粉酶的一個或多個氨基酸殘基的修飾(插入、取代、缺失)所得到的變體。親本雜合a-淀粉酶親本a-淀粉酶可以是雜合a-淀粉酶，即包含來源于至少兩種a-淀粉酶的部分氨基酸序列組合的a-淀粉酶。親本雜合a-淀粉酶可以是在氨基酸同源性和/或免疫交叉反應性和/或DNA雜交(如上所定義的)的基礎上可被確定為屬于Termamyl-樣a-淀粉酶家族的一種雜合a-淀粉酶。在該情況下，雜合a-淀粉酶一般由Termamyl-樣a-淀粉酶的至少一個部分和一種或多種其它a-淀粉酶的部分組成，所述其它a-淀粉酶選自微生物(細菌或真菌)和/或哺乳動物來源的Termamyl-樣a-淀粉酶或非-Termamyl-樣a-淀粉酶。因此，親本雜合a-淀粉酶可包含來源于至少兩種Termamyl-樣a-淀粉酶，或來源于至少一種Termamyl-樣和至少一種非-Termamyl-樣細菌a-淀粉酶，或來源于至少一種Termamyl-樣和至少一種真菌a-淀粉酶的部分氨基酸序列的組合。部分氨基酸序列所來源的Termamyl-樣a-淀粉酶可以是例如本文所提及的任何那些特定的Termamyl-樣a-淀粉酶。例如，親本a-淀粉酶可包含來源于地衣芽孢桿菌菌4朱的a-淀粉酶的C-末端部分，和來源于解淀粉芽孢桿菌菌林或嗜熱脂肪芽孢桿菌菌抹的a-淀粉酶的N-末端部分。例如，親本a-淀粉酶可包含地衣芽3包桿菌a-淀粉酶的C-末端部分的至少430個氨基酸殘基，也可包含如a)相應于具有SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶的37個N端氨基酸殘基的氨基酸區段(segment)，和相應于具有SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的445個C末端氨基酸殘基的氨基酸區段，或b)相應于具有SEQIDNO:8中所示的氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶的68個N-末端氨基酸殘基的氨基酸區段，和相應于具有SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的415個C-末端氨基酸殘基的氨基酸區段。在一個優選的實施方案中，親本Termamyl-樣a-淀粉酶是與SEQIDNO:4中所示的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶相同的雜合Termamyl-樣a-淀4分酶，不同之處在于(成熟蛋白的)N-末端的35個氨基酸殘基為SEQIDNO:6中所示的解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶(BAN)的成熟蛋白的N-末端的33個氨基酸殘基所取代。上述雜合Termamyl-樣a-淀粉酶可進一步具有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(使用SEQIDNO:4中的編號)，稱為LEI74。另一個優選的親本雜合a-淀粉酶是SEQIDNO:2中所示的LE429。非-Termamyl-樣a-淀粉酶可以是例如真菌a-淀粉酶、哺乳動物或植物a-淀粉酶或細菌a-淀粉酶(不同于Termamyl-樣a-淀粉酶)。這樣的a-淀粉酶的具體例子包括米曲霉(A^ergW^oo;zae)TAKAa-淀粉酶、黑曲霉(Am'ger)酸性a-淀粉酶、枯草芽孢桿菌a-淀粉酶、豬胰腺a-淀粉酶和大麥a-淀粉酶。所有的這些a-淀粉酶都具有已闡明的，與本文所述典型的Termamyl-樣a-淀粉酶的結構明顯不同的結構。上述真菌a-淀粉酶，即來源于黑曲霉和米曲霉的a-淀粉酶在氨基酸水平上高度同源，一般認為屬于相同的a-淀粉酶家族。來源于米曲霉的真菌a-淀粉酶可以商品名FungamylTM從市場上買到。此外，當提及Termamyl-樣a-淀粉酶的特定變體(本發明的變體)時，所提及的變體是通過常規的方法，修飾(如缺失或取代)特定Termamyl-樣a-淀粉酶的氨基酸序列中的特定氨基酸殘基而獲得的，應理解在等同位置(由各個氨基酸序列之間可能達到最好的氨基酸序列對比所測定的)修飾得到的另一個Termamyl-樣a-淀粉酶的變體也包括在本發明的范圍內。本發明變體的一個優選的實施方案是來源于地衣芽孢桿菌a-淀粉酶(作為親本Termamyl-樣a-淀粉酶)的變體，如上述a-淀粉酶中的一個的變體，例如具有SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的變體。本發明變體的構建可通過在有助于生產變體的條件下，培養包含編碼所述變體的DNA序列的微生物來實現目標變體的構建。所述變體可隨后從所得到的培養物中回收。這進一步詳述于下。改變的特性改變(相對于親本Termamyl-樣a-淀粉酶的特性)之間的關系。本發明的第一方面涉及具有a-淀粉酶活性并包含R437W取代的親本Termamyl-樣a-淀粉酶的變體，其中所述位置相應于具有SEQIDNO:4氨基酸序列的親本Termamyl-樣a-淀粉酶的氨基酸序列的位置。在淀粉液化過程以及其中涉及a-淀粉酶的其他過程中，增加a-淀粉酶的淀粉親和力并由此增加如生(mw)淀粉水解(RSH)是有利的。本發明人已發現通過在僅具有兩個色氨酸之一的ot-淀粉酶的C-末端區域導入色氨酸殘基，由此產生一對色氨酸，形成推定的淀粉結合位點，發現其在吸附至淀粉中起主要作用，因而對于高的淀粉轉化率是關鍵性的。應當強調的是不僅以下特別提及的Termamyl-樣a-淀粉酶可被使用。而且其他商用Termamyl-樣a-淀粉酶也可使用。這樣的a-淀粉酶的不太詳細的列表如下EP0252666(ATCC27811)中所述的地衣芽孢桿菌菌抹產生的a-淀粉酶，和WO91/00353和WO94/18314中鑒定的a-淀粉酶。其他商用Termamyl-樣地衣芽孢桿菌a-淀粉酶是OptithermTM和TakathermTM(可購自Solvay)、MaxamylTM(可購自Gist-brocades/Genencor)、SpezymAATMSpezymeDeltaAATM(可購自Genencor)和Keistase((可購自Daiwa)。但是，只有在C-末端不具有兩個色氨酸殘基的Termamyl-樣oc-淀粉酶能合適地用作為骨架用于制備本發明變體。在本發明一個優選的實施方案中，親本Termamyl-樣a-淀粉酶是SEQIDNO:4或SEQIDNO:6或它們的變體的a-淀粉酶。在一個具體的實施方案中，所述變體包含一個或多個下列額外的突變R176*、G177*、N190F、E469N，更特別是R176*+G177*+N190F，還特別是R176承+G177氺+N190F+E469N(使用SEQIDNO:6中的編號)。在本發明另一個優選的實施方案中，親本Termamyl-樣a-淀粉酶是SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的雜合a-淀粉酶。特別是，所述親本雜合Termamyl-樣a-淀粉酶可以是包含SEQIDNO:4中所示的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的445個C-末端氨基酸殘基和SEQIDNO:6中所示的來源于解淀粉芽孢桿菌的成熟的a-淀粉酶的37個N-末端氨基酸殘基的雜合a-淀粉酶，其可合適地進一步具有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(使用SEQIDNO:4中的編號)。該雜合體稱為LE174。LE174雜合體可以與更進一步的突變I201F結合以形成具有以下突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(使用SEQIDNO:4的編號)的親本雜合Termamyl-樣a-淀粉酶。該雜合變體如SEQIDNO:2所示，并被用于以下實施例中，稱為LE429。當通過結合LE174與突變I201F(SEQIDNO:4編號)，使用LE429(示于SEQIDNO:2)作為主鏈時(即作為親本Termamyl-樣a-淀粉酶)，突變/改變，特別是取代、缺失和插入，根據本發明可在一個或多個以下位置上進行R176*、G177*、E469N(使用SEQIDNO:6中的編號)。在一個特別的實施方案中，變體包含額外的突變E469N(使用SEQIDNO:6中的編號)。在一個更特別的實施方案中，變體包含額外的突變R1764+G177f+E469N(使用SEQIDNO:6中的編號)。在本發明變體中的常規突變除以上概述的那些修飾之外，最好讓本發明的變體包含一個或多個修飾。制備a-淀粉酶變體的方法本領域已知幾種將突變導入基因中的方法。在對編碼a-淀粉酶的DNA序列克隆的簡短討論之后，將要討論在編碼a-淀粉酶的序列中的特定位點處產生突變的方法。克隆編碼a-淀粉酶的DNA序列可使用本領域眾所周知的多種方法，從產生所述a-淀粉酶的任何細胞或微生物中分離出編碼親本a-淀粉酶的DNA序列。首先，應使用源自產生待研究之a-淀粉酶的生物的染色體DNA或信使RNA構建基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，如果a-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成同源的經標記的寡核芬酸探針，并使用該探針從制備自所述生物的基因組文庫中鑒定編碼a-淀粉酶的克隆。或者，可將含有與已知a-淀粉酶基因同源之序列的經標記的寡核苷酸探針用作探針，使用較低嚴謹性的雜交和洗滌條件鑒定編碼a-淀粉酶的克隆。另一種筌定編碼a-淀粉酶的克隆的方法包括將基因組DNA片段插入表達載體，例如質粒，用所得到的基因組DNA文庫轉化a-淀粉酶-陰性細菌，然后將經轉化的細菌鋪于含有a-淀粉酶底物的瓊脂上，由此使得表達a-淀粉酶的克隆得以鑒定。或者，可通過已建立的標準方法合成制備編碼酶的DNA序列，所述方法例如S丄.Beaucage和M.H.Camthers(1981)所述的膦酰胺(phosphoroamidite)法或Matthes等(1984)所述的方法。在膦酰胺法中，可在例如自動化的DNA合成儀中合成寡核香酸，對其進行純化、退火、連接并克隆至適當的載體中。最終，根據標準技術，DNA序列可以是通過連接合成的，基因組的或cDNA來源的片段(適當時是對應于完整DNA序列的多個部分的片段)而制備的混合的基因組和合成來源，混合的合成和cDNA來源或混合的基因組和cDNA來源的DNA序列。也可以使用特定的引物，例如US4，683，202或位點定向誘變一旦分離出編碼a-淀粉酶的DNA序列，并鑒定出期望的突變位點，可使用合成的寡核苷酸導入突變。這些寡核苷酸含有側接于期望的突變位點的核苷酸序列；在寡核苷酸合成期間插入突變的核苷酸。在一種特定的方法中，在攜有a-淀粉酶基因的載體中產生橋連a-淀粉酶-編碼序列的DNA單鏈缺口。然后，使含有期望的突變的合成核香酸與該單鏈DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)補平其余缺口，并使用T4連接酶連接構建體。該方法的一個特定的例子描述于Morinaga等(1984)。US4,760,025公開了通過對盒進行微小的改變而導入編碼多個突變的寡核普酸。但是，由于可導入不同長度的多個寡核苷酸，因此通過Morinaga法可在任何一次導入甚至更多個的突變。Nelson和Long(1989)描述了另一種將突變導入編碼a-淀粉酶的DNA序列的方法。所述方法包括以3個步驟產生含有期望的突變的PCR片段，所通過用限制性內切核酸酶裂解，可從PCR-產生的片段中分離出攜有突變的DNA片段，并將該片段重新插入表達質粒中。隨機請變可在翻譯為本文所示氨基酸序列的基因的至少3個部分中，或在整個基因內適當地進行隨機誘變，所述誘變可以是定域的(localised)或區域-特異性的隨機誘變。利用本領域已知的任何方法，可以方便地對編碼親本a-淀粉酶的DNA序列進行隨機誘變。相對于上文，本發明的另一方面涉及一種產生親本a-淀粉酶的變體的方法，例如，其中相對于親本，變體顯示改變的淀粉親和力，所述方法包括(a)對編碼親本a-淀粉酶的DNA序列進行隨機i秀變，(b)在宿主細胞中表達步驟(a)中獲得的突變的DNA序列，和(c)篩選表達相對于親本a-淀粉酶具有改變的淀粉親和力的a-淀粉酶變體的宿主細月包。適當的物理或化學誘變劑，通過使用適當的寡核苷酸，或通過對DNA序列進行PCR以產生誘變來進行隨機誘變。此外，可使用這些謙變劑的任何組合來進行隨機誘變。謙變劑可以是例如誘導轉換、顛換(transversion)、倒位、顛倒(scrambling)、缺失和/或插入的試劑。適用于本發明目的的物理或化學誘變劑的例子包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉(sodiumbisulphite)、曱酸和核苷酸類似物。當使用這樣的誘變劑時，一般通過在適于發生誘變的條件下，在選定誘變劑的存在下溫育要被誘變的編碼親本酶的DNA序列來進行誘變，然后篩選具有期望的特性的突變DNA。當利用寡核苷酸進行誘變時，在合成要被改變位置處的寡核苷酸的過程中，寡核苷酸可以摻雜或摻入有3種非親本核苷酸。摻雜或摻入的目的是避免不需要的氨基酸的密碼子。可通過任何公開的技術如使用PCR、LCR或在適當時使用任何DNA聚合酶和連接酶，將摻雜(doped)或摻入(spiked)的寡核苷酸摻入編碼a-淀粉酶的DNA。優選地，使用"不變的隨機摻雜"進行摻雜，其中在每個位置中的野生型和突變的百分比是預先確定的。此外，摻雜可以導致優先導入某些核苷酸，從而優先導入一個或多個特定的氨基酸殘基。例如，進行摻雜可使得在每個位置中導入90%野生型和10%突變。選擇摻雜方案的其它考慮是基于遺傳學以及蛋白質-結構的限制。可使用DOPE程序制訂摻雜方案，所述程序可特別地確保避免導入終止密碼子。當使用PCR-產生的誘變時，可在增加核苷酸錯誤摻入的條件下，對經化學處理或未經處理的編碼親本a-淀粉酶的基因進行PCR(Deshler1992;Leung等，Technique,VoU,1989,pp.11-15)。可使用大腸桿菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133,1974，pp.179-191),釀酒酵母或任何其它微生物的增變抹對編碼a-淀粉酶的DNA進行隨機誘變，誘變方法包括例如將含有親本糖基化酶的質粒轉化到增變抹中，培養含有質粒的增變林，從增變抹中分離突變的質粒。隨后，將突變的質粒轉化至表達生物中。要被誘變的DNA序列可方便地存在于基因組或cDNA文庫中，所述文庫制備自表達親本a-淀粉酶的生物。或者，DNA序列可以存在于適當的載體例如質粒或噬菌體上，可與誘變劑一起溫育或要不然暴露于誘變劑中。要被誘變的DNA也可存在于宿主細胞中，或者整合于所述細胞的基因組中，或者存在于細胞所攜帶的載體上。最后，要被誘變的DNA也可以是分離的形式。很清楚要接受隨機誘變的DNA序列優選是cDNA或基因組DNA序列。在某些情況下可在實施表達步驟b)或篩選步驟c)之前方便地擴增突變的DNA序列。可根據本領域已知的方法進行這樣的擴增，本發明優選的方法是使用根據親本酶的DNA或氨基酸序列制備的寡核苷酸引物進行PCR擴增。與誘變劑溫育或暴露于誘變劑之后，通過在允許發生表達的條件下培養攜有突變DNA序列的適當宿主細胞來表達突變的DNA。用于此目的的宿主細胞可以是已用突變的DNA序列(任選地存在于載體上)轉化的宿主細胞，或者是在誘變處理過程中攜有編碼親本酶的DNA序列的宿主細胞。適當宿主細胞的例子如下革蘭氏陽性細菌，例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(^^7/w/eWw力、短芽孢桿菌CBac///^Z)rev^)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌(5flc/〃wfl/A:<3/o//2//z^)、解淀4分芽孑包才于菌、)疑結芽孑包沖干菌CSac/〃MScoagw/am1)、環狀芽孢桿菌(5ac〃/wC7>cw/a"s)、火山爛芽孑包桿菌(i^zc/〃M/aw/M)、巨大芽孑包才干菌(5flc〃/"i1附eg"/en'M柳)、蘇云金芽孑包牙干菌(5"c〃/z^//2"n'"g/e"j/力、淺青紫鏈霉菌(jSW/,omyces//vz'd(my)或鼠灰鏈霉菌(5Vre/7/函ycesww/m);禾口革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌(Eco//)。突變的DNA序列可進一步包含能使突變的DNA序列表達的DNA序列。定域隨機誘變隨機誘變可有利地定域于所述親本a-淀粉酶的一部分。例如，當酶的某些區域已被鑒定為對酶的給定特性特別重要時，以及當預期修飾能導致具有改善特性的變體時，定域隨機誘變可能是有利的。當親本酶的三級結構已被闡明，且所述結構與酶的功能相關時，一般可鑒定出這樣的區域。通過使用上述的PCR產生的誘變技術或本領域已知的任何其它適當的插入適當的載體來分離編碼要被修飾的DNA序列部分的DNA序列，隨后可使用上述任何誘變方法對所述部分進行誘變。提供a-淀粉酶變體的備選方法提供a-淀粉酶變體的備選方法包括本領域已知的基因改組方法，所述方法包括例如WO95/22625(來自AffymaxTechnologiesN.V.)和WO96/00343(來自NovoNordiskA/S)中所述的方法。表達a-淀粉酶變體根據本發明，可使用表達載體，以酶的形式表達通過上述方法，或通過本領域已知的任何其它方法產生的編碼變體的DNA序列，所述表達載體通常包括編碼啟動子、操縱子、核糖體結合位點、翻譯起始信號的控制序列，并任選包括阻遏基因或多種激活基因。攜有編碼本發明a-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是能對其方便地進行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇常取決于其要被導入的宿主細胞。因此，載體可以是自主復制的載體，即作為染色體外實體存在的載體，所述載體的復制不依賴于染色體的復制，如質粒、噬菌體或染色體外元件、微型染色體或人工染色體。或者，載體可以是當導入宿主細胞時，被整合入宿主細胞基因組，并與整合了該載體的染色體一起復制的載體。在載體中，DNA序列應與適當的啟動子序列可操作地連接。啟動子可與宿主細胞同源或異源之蛋白質的基因。指導編碼本發明a-淀粉酶變體之DNA序列轉錄，尤其是在細菌宿主中的轉錄的適當啟動子的例子是大腸桿菌/ac操縱子的啟動子、天藍色鏈霉菌05^印"附>^^￡&0/^)瓊脂酶基因dagj啟動子、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(am;AL)啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽糖淀粉酶基因(amyM)啟動子，解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶Om;;0啟動子、枯草芽孢桿菌x少M和矽/B基因的啟動子等。對于在真菌宿主中轉錄，有用的啟動子的例子是來源于編碼下列酶的基因的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(7^'zo"wcor柳'e/^)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩定性a-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶或構巢曲霉(Am'^/ara)乙酰胺酵。本發明的表達載體還可含有適當的轉錄終止子，以及在真核生物中，還可含有與編碼本發明ot-淀粉酶變體的DNA序列可操作地連接的聚腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列可適當地來源于與啟動子相同的來源。載體可進一步包含能使載體在所述宿主細胞中復制的DNA序列。這樣的序列的例子是質粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和piJ702的復制起點。載體還可含有選4奪標記，例如其產物可以彌補宿主細胞缺陷的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的^/基因，或能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性例如氨千青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性。此外，載體可含有曲霉屬選擇標記，例如amdS、argB、niaD和sC,產生潮霉素抗性的標記，或者可通過如WO91/17243中所述的共轉化來完成的選擇。盡管細胞內表達在某些方面(如當使用某些細菌作為宿主細胞時)有利，但一般優選在細胞外表達。一般而言，本文所述的芽孢桿菌屬a-淀粉酶包含允許表達的蛋白酶分泌至培養基的前區。必要時，該前區可為不同的前區或信號序列所取代，通過取代編碼各個前區的DNA序列可以方便地實現此目的。用于分別連接編碼a-淀粉酶變體的本發明DNA構建體、啟動子、終止子和其它元件，并將它們插入含有復制所需信息的適當載體的方法是本領域兮支術人員眾所周知的(參見例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,1989)。在重組生產本發明的a-淀粉酶變體中，包含上文所定義的本發明DNA通過將編碼變體的本發明DNA構建體(以一個或多個拷貝)整合至宿主染色體中，用所述DNA構建體轉化細胞。一般認為整合是有利的，因為整合后DNA序列可以在細胞中更加穩定地維持。根據常規方法，例如通過同源或異源重組可以將DNA構建體整合至宿主染色體中。或者，可用與不同類型的宿主細胞有關的上述表達載體轉化細胞。本發明的細胞可以是高等生物的細胞，例如哺乳動物或昆蟲的細胞，但優選其為微生物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母)的細胞。適合的細菌為革蘭氏陽性菌，例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌。細菌的轉化可受例如原生質體轉化或以感受態細胞自身已知的方式使用該細胞而影響。酵母生物可優選糖酵母屬或裂殖酵母屬OSc/n'zcwacc/zaramycay)，例如釀酒酵母(Sacc/2ara"^yc^cereWw'ae)。絲狀真菌優選屬于曲霉屬，例如，米曲霉或黑曲霉。真菌細胞可通過一種方法轉化，該方法涉及原生質體形成、原生質體轉化、然后細胞壁以其自身已知的方式再生。適合用于曲霉屬宿主細胞轉化的方法如EP238023所述。在另一方面，本發明涉及一種生產本發明a-淀粉酶變體的方法，該方法包含在有利于變體生產的條件下培養如上所述的宿主細胞以及從細胞和/或培養基中回收變體。用于培養細胞的培養基可以是適于培養所述宿主細胞以及獲得本發明a-淀粉酶變體表達的任何常規培養基。適當的培養基可從供應商處購得，或者可根據公開的配方(例如美國典型培養物保藏中心目錄中所述的)制備。通過眾所周知的方法，包括通過離心或過濾分離培養基與細胞，利用諸如硫酸銨等鹽沉淀培養基中的蛋白質成分，接著通過利用層析法(chromatography),例如離子交換層析，親和層析等，可以從培養基中方便地回收宿主細胞分泌的a-淀粉酶變體。工業應用本發明的a-淀粉酶變體具有能進行多種工業應用的有價值的特點。具體來說，本發明酶變體適于作為洗衣、碗碟清洗、硬表面清洗的洗滌劑組合物的成分來應用。尤其是淀粉液化(參見例如US3,912,590,EP專利申請號252730和63909，WO99/19467,以及WO96/28567，所有文獻在此并入作為參考)。還涉及的是用于淀粉轉化目的的組合物，其除本發明變體之外，還可包含葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶和其他a-淀粉酶。此外，本發明的變體還特別用于由淀粉或整谷物/谷粒(wholegrain)生產增甜劑和乙醇(參見例如US專利號5,231,017,在此并入作為參考)，例如燃料、酒類和工業乙醇。本發明的變體還可用于紡織品(textile)、織物(fabric)或衣物的退漿(參見例如WO95/21247,US專利4,643,736,EP119,920，在此并入作為參考)、啤酒生產或釀造、紙漿和紙生產以及飼料和食品生產。淀粉轉化常規的淀粉轉化處理例如液化核糖化處理描述于如US專利號3,912,590和EP專利申請號252,730和63,909中,在此并入作為參考。在一個實施方案中，將淀粉降解為低分子量的碳水化合物成分例如糖或脂肪代用品的淀粉轉化處理包括脫支步驟。淀粉至糖的轉化在將淀粉轉化為糖的情況下，淀粉被解聚。這樣的解聚處理由預處理步驟和兩或三步的連續處理步驟(即液化處理、糖化處理和取決于所需最終產物任選的異構化處理)組成。天然淀粉的預處理天然淀粉由顯微鏡下可見的顆粒組成，所述顆粒在室溫下不溶于水。當加熱淀粉漿水溶液時，顆粒膨脹并最終爆裂，將淀粉分子分散在溶液中。在該"凝膠化，，處理過程中，粘度急劇增加了。由于在工業過程中一般固體含量為30-40%，因此淀粉必須變稀或"液化"，以使得其能易于處理。現今，降低粘度主要通過酶促降解進行。液化在液化步驟過程中，使用a-淀粉酶長鏈淀粉降解為支鏈和線性的短單元(麥芽糖糊精)。液化處理在105-110°C下進行5-10分鐘，然后在95。C下進行l-2小時。pH在5.5-6.2之間。為了在這些條件下確保最佳的酶穩定性，添加1mM4丐(40ppm游離4丐離子)。在該處理后，液化的淀粉應具有10-15的"糖化率，，(DE)。糖化在液化處理后，通過添加葡糖淀粉酶(如AMG)和諸如異淀粉酶(US專利號4,335,208)或支鏈淀粉酶(如Promozyme)(US專利號4,560,65l)的脫支酶將麥芽糖糊精轉化為葡萄糖。在該步驟之前，將pH降低到低于4.5,保持高溫(高于95。C)以失活液化的oi-淀粉酶，以減少稱為"潘糖前體，，的短寡糖形成，所述"潘糖前體"無法為脫支酶所完全水解。將溫度降低到60°C，并添加葡糖淀粉酶和脫支酶。糖化處理持續進行24-72小時。正常地，當在液化步驟后變性a-淀粉酶時，約0.2-0.5%的糖化產物是無法為支鏈淀粉酶所降解的支鏈三糖6、a-葡糖基麥芽糖(潘糖)。如果在糖化過程中，來自液化步驟的活性淀粉酶存在(即不變性)，則該水平可高達1-2%，其是極其不期望的，因為其明顯降低了糖化率。異構化當期望的最終糖產物是例如高果糖糖漿時，可將葡萄糖糖漿轉化為果糖。在糖化處理后，將pH增加到6-8，優選pH7.5,并通過離子交換除去鈣。然后使用例如固定化的葡糖異構酶(例如SweetzymeTMlT)將葡萄糖糖漿轉化為高果糖糖漿。乙醇生產一般而言，由整谷物/谷粒生產乙醇(酒精)可分成4個主要的步驟-研磨-液化-糖化-發酵研磨研磨谷粒以便打開其結構并供進一步處理。所用到的兩種處理是濕磨或干磨。在干磨中，完整的谷粒(kernel)被研磨并用于處理的剩余步驟中。濕磨提供了十分良好的胚和粗粉(meai)(淀粉粒和蛋白質)的分離，有些例外的是可用于糖漿的并行生產。液化在液化處理中，通過水解為麥芽糖糊精使淀粉粒溶解，大部分的DP高于4。可通過酸處理或a-淀粉酶酶催化進行水解。酸水解在受限的基礎上使用。原料可以是磨碎的整谷物/谷粒后來自淀粉處理的側線餾分(sidestream)。酶促液化通常以三步熱淤漿(hotslmry)法來進行。將淤漿加熱至60-95。C，優選80-85。C,并添加酶。然后在95-140。C噴射(jet-cooked)加熱淤漿，優選105-125。C,冷卻至60-95。C，并添加更多的酶以獲得最終的水解。液化處理在pH4.5-6.5下進行，通常在pH5-6下進行。磨碎的和液化的谷粒也稱為醪液(mash)。糖化為產生酵母能代謝的低分子量糖類DPw,來自液化的麥芽糖糊精應進一步水解。一般通過葡糖淀粉酶酶催化進行水解，或者可以使用a-葡糖苷酶或酸性a-淀粉酶。完全的糖化步驟可延續72小時，但是，所共有的預糖化通常只進行40-90分鐘，然后在發酵過程(SSF)中完成糖化。糖化一般在30-65。C的溫度和pH4.5下進行，通常在60。C左右進行。發酵將通常來自糖酵母屬菌種的酵母添加到醪液中，并發酵24-96小時，例如通常發酵35-60小時，溫度在26-34。C，通常在約32。C，以及pH為pH3-6，優選pH4-5左右。注意到廣泛使用的處理是同時進行糖化和發酵(SSF)處理，其中對于糖化來說沒有保溫(holding)階段，意味著酵母和酶要同時添加。當在高于50。C的溫度下引入預糖化步驟是進行SSF所共有的之時，只要在發酵之前同時添加酵母和酶即可。蒸餾發酵后蒸餾醪液以提取乙醇。根據本發明的方法獲得的乙醇可用作為例如燃料乙醇；飲料乙醇即飲料酒精；或工業乙醇。副產品發酵中留下的是谷物/谷粒，其通常以液體形式或干燥形式用作為動物飼料。本領域技術人員眾所周知關于如何進行液化、糖化、發酵、蒸餾和乙醇回收的更多細節。根據本發明的方法，糖化和發酵可同時或獨立進行。紙漿和紙生產本發明的堿性a-淀粉酶還可用于由淀粉加固(starchreinforced)的廢紙和紙板生產木質纖維(lignocellulosic)材料，例如紙漿、紙和紙板，特別是其中在高于7的pH下進行再制漿，并且淀粉酶通過降解加固淀粉而促進廢料的分解。本發明的a-淀粉酶能特別用于由涂有漿糊的印刷紙生產造紙紙漿的處理。該處理可如WO95/14807中所述的進行，包括以下步驟a)分解(disintegrating)紙以產生紙漿，b)在步驟a)之前、過程中或之后，用淀粉降解酶處理，和c)在步驟a)和b)之后，將油墨(ink)顆粒與紙漿分離。本發明的-a-淀粉酶還可特別用于改性淀粉，其中酶促改性的淀粉與諸如碳酸釣、高嶺土(kaolin)和粘土的堿性填料一起用于造紙。使用本發明的堿性ct-淀粉酶，有可能在填料存在下改性淀粉，從而可供更簡單的綜合工藝使用。紡織品、織物或衣物的退漿在紡織品、織物或衣物退漿中，本發明的a-淀粉酶還可以是十分有用的。在紡織加工工業中，在退漿處理中oc-淀粉酶通常用作為助劑以促進在確保要在隨后織物被洗煉(scoured)、漂白和染色的處理中獲得最好的結果，重要的是在織布后要完全除去膠料涂層。優選的是酶促淀粉分解，因為其對纖維材料不產生任何有害影響。為了降低加工成本并增加工廠生產量，退漿處理往往與洗煉和漂白步驟結合進行。在這樣的情況下，非酶助劑例如堿化劑或氧化劑通常用于分解淀粉，因為傳統的a-淀粉酶與高pH水平及漂白劑并不非常相容。由于使用了具有相當侵蝕性的化學品，淀粉膠料的非酶分解導致了一些纖維損傷。因此，期望使用本發明的a-淀粉酶，因為它們在堿性溶液中具有改善的特性。當退漿含有纖維素的織物或紡織品時，a-淀粉酶可單獨或與纖維素酶結合使用。退漿和漂白處理是本領域眾所周知的。例如，這樣的處理描述于WO95/21247、US專利4,643,736、EP119,920中，在此并入作為參考。用于退漿的市售產品包括來自NovozymesA/S的AQUAZYME⑧和AQUAZYMEULTRA。啤酒生產在啤酒生產過程中，本發明的a-淀粉酶還是十分有用的；a-淀粉酶一般在淀粉糖化過程中添加。洗滌劑組合物可添加本發明的a-淀粉酶，并因此成為洗滌劑組合物的成分。本發明的洗滌劑組合物可例如配制為手洗或機洗衣服的洗滌劑組合物，包括適于染色織物預處理的洗衣添加劑組合物和漂洗添加的織物柔順劑組合物，或可配制為用于一般家庭硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或可配制用于手洗或機洗碗碟操作。在一個特定的方面，本發明提供了包含本發明的酶的洗滌添加劑。所述洗滌添加劑以及洗滌劑組合物可包含一種或多種其他的酶，例如蛋白酶，脂肪酶，過氧化物酶，不同的(another)淀粉分解酶，如不同的(another)a-淀粉酶、葡糖淀粉酶、產麥芽糖淀粉酶、CGT酶(CGTase)和/或纖維素酶、甘露聚糖酶(例如來自Novozymes，Denmark的MANNAWAYTM)、果膠酶、果膠裂解酶、角質酶(cutinase)和/或漆酶。一般而言，所選擇的酶的特性應與所選擇的洗滌劑相容(即在最適pH下與其他酶或非酶成分相容等)，并且所述酶應以有效量存在。蛋白酶適合的蛋白酶包括那些動物、植物或微生物來源的蛋白酶。微生物來源的蛋白酶是優選的。包括化學改性或蛋白質工程化的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，特別是那些來源于芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(如豬或牛來源的)以及WO89/06270和WO94/25583中描述的鐮孢屬(Fwan'wm)蛋白酶。有用的蛋白酶的例子是WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的變體，特別是在一個或多個以下位置具有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優選的市售蛋白酶包括ALCALASE、SAVINASE、PRIMASE、DURALASE、ESPERASE和KANNASE(來自NovozymesA/S)，MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、PROPERASE、PURAFECT、PURAFECTOXP、FN2、FN3、FN4(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶適合的脂肪酶包括那些細菌或真菌來源的脂肪酶。包括化學改性或蛋白質工程化的突變體。有用的脂肪酶的例子包括來自腐質霉(//mw/co/g)(同義詞77ze;^ow少cey)的脂肪酶，如來自EP258068和EP305216中所述的//,/畫g/卿a(7:/fl聽g/"osM)的脂肪酶，或來自WO96/13580中所述的//./rao/era的脂肪酶，假單胞菌屬(尸"^fomo，力脂肪酶，如來自產堿假單胞菌CP/^//^"&)或類產石成假單胞菌(戶/wewcfoa/ca/Zge"")(EP218272)、洋蔥假單胞菌CPce;ac/a)(EP331376)、施氏假單胞菌(PWwteen;j(GB1,372,034)、熒光假單胞菌CRyZMore"ms)、假單胞菌菌抹SD705(WO95/06720和WO96/27002)、Pw^cora/werak(WO96/12012)的月旨肪酶，芽孢桿菌屬脂肪酶，如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等(1993),BiochemicaetBiophysicaActa,1131,253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(B.pw脂7w》(WO91/16422)的脂肪酶。其他的例子是脂肪酶變體，例如那些描述于WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中的。優選的市售脂肪酶包括LIPOLASE和LIPOLASEULTRATM(NovozymesA/S)。淀粉酶適合的淀粉酶(a和/或p)包括那些細菌或真菌來源的淀粉酶。包括化學改性或蛋白質工程化的突變體。淀粉酶包括，例如獲得自芽孢桿菌，如詳述于GB1,296,839中的地衣芽孢桿菌的特定菌抹的a-淀粉酶。有用的a-淀粉酶的例子是WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的變體，特別是在一個或多個以下位置具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。市售a-淀粉酶是DURAMYLTM、LIQUEZYMETM、TERMAMYLTM、NATALASE'm、SUPRAMYL'M、STAINZYME、FUNGAMYLiM和BANTM(NovozymesA/S),RAPIDASE、PURASTAR和PURASTAROXAMTm(來自Ge腿corInternationalInc.)。纖維素酶適合的纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些纖維素酶。包括化學改性或蛋白質工程化的突變體。適合的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質霉屬(Z/wmZco/a)、鐮孢屬(Fi^an^m)、梭孢殼屬(77z/e/aWa)、枝頂孢屬04cremom'ww)的纖維素酶，例如US4,435,307、US5,648，263、US5,691,178、US5，776，757和WO89/09259中所披露的//m,'co/"/rao/ews、p者熱皇殳絲霉(_/V^ce//op/^/2or<a^zermop/z〃a)禾口尖孑包鐮孑包(Fwan,Mmox，/orz/w)產生的真菌纖維素酶。特別適合的纖維素酶是具有顏色護理效果的堿性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的例子是描述于EP0495257、EP0531372、W096/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纖維素酶。其他例子是諸如WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些的纖維素酶變體。市售纖維素酶包4舌CELLUZYME⑧和CAREZYME(NovozymesA/S)，CLAZINASE和PURADAXHA(GenencorInternationalInc.)以及KAC-500(B)(KaoCorporation)。過氧化物酶/氧化酶適合的過氧化物酶/氧化酶包括那些植物、細菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶。包括化學改性或蛋白質工程化的突變體。有用的過氧化物酶的例子包括如WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所迷的來自鬼傘(Coprinus),如來自灰蓋鬼傘(C.c/"erew力的過氧化物酶及其變體。市售過氧化物酶包括GUARDZYME(NovozymesA/S)。通過添加含有一種或多種酶的分離的添加劑或通過添加包含所有這些酶的組合的添加劑，可將洗滌劑酶包括在洗滌劑組合物中。本發明的洗滌添加劑即分離的添加劑或組合的添加劑可配制成例如顆粒、液體、淤漿等。優選的洗滌添加劑配方是顆粒狀的，特別是無粉塵(non-dusting)顆粒，液體的，特別是穩定液體或淤漿的。可例如US4,106,991和4,661,452中所披露的生產無粉塵顆粒，并可任選地通過本領域已知的方法進行包被。蠟涂層材料的例子是具有1000-20000平均分子量的聚(環氧乙烷)(ethyleneoxide)制品(聚乙二醇，PEG);既有16-50個環氧乙烷單元的乙氧基化壬酚；其中醇含有12-20個碳原子以及存在15-80個環氧乙烷單元的乙氧基化脂肪族醇；脂肪族醇；脂肪酸和脂肪酸甘油單酯、二酯和三酯。在GB1483591中給出了適用于流化床技術的成膜涂層材料的例子。#4居所確定的方法，液體酶制劑可以例如通過添加諸如丙二醇的多元醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩定。可根據EP238,216中所4皮露的方法制備保護的酶。本發明的洗滌劑組合物可以任何方便的形式存在，如條、片、粉末、顆粒、糊或液體。液體洗滌劑可以是含水的，一般包含高達70%水和0-30%有機溶劑，或是不含水的。洗滌劑組合物包含可以是非離子型表面活性劑的一種或多種表面活性劑，包括半極性和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子型表面活性劑。按重量計算表面活性劑通常以0.1%-60%的水平存在。當包括在其中時，洗滌劑應通常含有約1%至約40%的陰離子型表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸鹽/酯(alkylbenzenesulfonate)、a-烯屬磺酸鹽/酯、烷基硫酸鹽/S旨(alkylsulfate)(脂肪醇硫酸鹽/酯(fattyalcoholsulfate))、脂肪醇乙氧基石克酸鹽/酯(alcoholethoxysulfate)、仲烷基石黃酸鹽/酯(secondaryalkanesulfonate)、a-磺基脂肪酸曱酯(sulfofattyacidmethylester)、烷基或烯基琥珀酸或脂肪酸鹽(soap)。當包括在其中時，洗滌劑(detergent)應通常約0.2%至約40%的非離子型表面活性劑，例如脂肪醇乙氧基化物、壬酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二曱胺化氧化物(alkyldimethylamine-oxide)、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanol-amide)、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡萄糖胺("葡糖胺")的N-酰基N-烷基衍生物。洗滌劑可含有0-65。/。的洗滌增效助劑(builder)或絡合劑，例如沸石、二磷酸鹽/酯、三磷酸鹽/S旨、膦酸鹽/酯(phosphonate)、碳酸鹽/酯、檸檬酸鹽/酯、次氮基三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五醋酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽/西旨或分層(layered)硅酸鹽/S旨(如來自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。例子是羧曱基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、諸如的聚丙烯酸酯的聚羧化物(polycarboxylates)、馬來酸/丙烯酸共聚物以及甲基丙烯酸月桂酯/丙晞酸共聚物。洗滌劑可含有漂白體系，所述漂白體系可包含諸如過硼酸鹽/酯或過碳酸鹽/酯的&02源，所述氏02源可與諸如四乙酰基乙二胺或壬酰基羥笨磺酸鹽/酯(nonanoyloxyben-zenesul-fonate)的過酸形成的漂白活化劑結合。或者，漂白體系可包含例如酰胺、二酰亞胺或石風型過氧酸。可使用常規穩定劑穩定本發明洗滌劑組合物的酶，所述常規穩定劑例如諸如丙二醇或甘油的多元醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物例如4-曱酰苯基硼酸以及可配制的組合物，如WO92/19709和WO92/19708中所述的。洗滌劑還可含有其他常見的洗滌劑成分，例如包括粘土的織物調節劑、發泡劑(foamboosters)、抑泡劑、防腐劑、污垢懸浮劑、防污垢再沉積劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑、水溶助長劑、晦暗抑制劑或香料。預計任何酶都能存在于洗滌劑組合物中，特別是本發明的酶，可以相應于每升洗滌液0.001-100mg酶類蛋白質的量添加，優選以每升洗滌液0.005-5mg酶類蛋白質，更優選以每升洗滌液0.01-1mg酶類蛋白質，以及特別是以每升洗滌液0.1-1mg酶類蛋白質的量添加。本發明的酶可額外地摻入到WO97/07202中披露的洗滌劑配方中，其在此并入作為參考。碗碟清洗洗滌劑組合物本發明的酶還可用于碗碟清洗洗滌劑組合物中，包括以下1)粉末自動碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>2)粉末自動碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>3)粉末自動碗》萊清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>4)粉末自動碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>6)帶有清潔表面活性劑體系的粉末和液體碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>8)非水液體碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>)9)觸變性液體自動碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>11)含有保護的漂白粒子的液體自動碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>12)如1)、2)、3)、4)、6)和IO)中所述的自動碗碟清洗組合物，其中過硼酸鹽/酯為過碳酸鹽/酯所取代。13)如l)-6)中所述的自動碗碟清洗組合物，其還含有錳催化劑。錳催4匕劑可例^口是"Efficientmanganesecatalystsforlow-temperaturebleaching",Nature369，1994，pp.637-639.中描述的化合物的一種。原料和方法酶LE174:雜合a-淀粉酶LE174是一種雜合Termamyl-樣a-淀粉酶，除N-末端35個氨基酸殘基(成熟蛋白的)已為BAN(成熟蛋白)(即SEQIDNO:6所示的解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶)的N-末端33個殘基所取代之外，其與Termamyl序列(即SEQIDNO:4所示的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶)一致，其進一步具有以下突變H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S(SEQIDNO:4).LE429雜合a-淀4分酶變體LE429是一種雜合Termamyl-樣a-淀粉酶，除N-末端35個氨基酸殘基(成熟蛋白的)已為BAN(成熟蛋白)(即SEQIDNO:6所示的解淀粉芽孢桿菌oc-淀粉酶)的N-末端33個殘基所取代之外，其與Termamyl序列(即SEQIDNO:4所示的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶)一致，其進一步具有以下突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(SEQIDNO:4)。LE429示于SEQIDNO:2,并通過SOE-PCR(Higuchi等1988,NucleicAcidsResearch16:7351)構建。來源于黑曲霉的葡糖淀粉酶具有示于WOOO/04136中的氨基酸序列，如SEQIDNo:2或所披露的變體之一。來源于黑曲霉的酸性真菌a-淀粉酶。底物獲得自Sigma-Aldrich的小麥淀粉(S-5127)。發酵和a-淀粉酶變體的純化在來自-80°C儲存的具有10嗎/ml卡那霉素的LB-瓊脂平板上劃線接種攜有相關的表達質粒的枯草芽孢桿菌菌抹，并在37°C下培養過夜。將克隆轉移入在500ml搖瓶中的補充有10fig/ml卡那霉素的100mlBPX培養基中。BPX培養基成分馬鈴薯淀粉100g/1大麥粉50g/1BAN5000SKB0.1g/1酪蛋白酸鈉10g/1大豆粉20g/1Na2HP04，12H209g/1Pluronic0.1g/1培養物在37。C下以270rpm振蕩培養5天。通過以4500rpm離心20-25分鐘，從發酵培養液中除去細胞和細胞碎片。之后過濾上清液以獲得完全清澈的溶液。在UF-過濾器(10000截留分子量膜)上濃縮并洗滌濾液，并將緩沖液改變為20mM醋酸，pH5.5。將UF-濾液加在S-sepharoseF.F.上，通過使用在相同緩沖液中的0.2MNaCl—步洗脫來進行洗脫。對10mMTris,pH9.0透析洗脫物并加在Q-sepharoseRF.上,用超過6倍柱體積的0-0.3MNaCl的線性梯度進行洗脫。匯集含有活性(通過Phadebas測定法測定的)的級分，調節pH至pH7.5并在5分鐘內通過用0.5%W/V活性炭處理除去殘留的顏色。活性測定(KNU)可使用馬鈴薯淀粉作為底物測定淀粉分解活性。該方法是基于用酶分解改性馬鈴薯淀粉，并接著通過將淀粉/酶溶液的樣品與碘溶液混合進行反應。最初，與有色玻璃標準相比，出現稍黑的藍色，但在淀粉分解過程中，藍色變淺并逐漸地變為紅棕色。1000個Novoa淀粉酶單位(KNU)規定為在標準條件(即在37。C+/-0.05;0.0003MCa2+;和pH5.6)下，糊精化5.26g淀粉干物質——Merck可溶性淀4分(Amylumsolubile)的S^的"f:。文件夾AF9/6更詳細地描述了該分析方法，函索NovozymesA/S，Denmark即可獲得，該文件夾在此并入作為參考。葡糖淀粉酶活性(AGU)l個Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)規定為在37。C和pH4.3下，每分鐘水解l微摩爾麥芽糖的酶的量。通過在使用來自BoehringerMannheim,124036的葡萄糖GOD-Perid試劑盒之后改良的方法(AEL-SM-0131,函索Novozymes即可獲得)將該活性確定為AGU/ml。標準AMG-標準，批號7-1195,，195AGU/ml。375pL底物(在50mM醋酸鈉，pH4.3中的l。/。麥芽糖)在37。C下溫育5分鐘。添加在醋酸鈉中稀釋的25j^L酶。在10分鐘后通過添加100(iL0.25MNaOH停止反應。將20^L轉移到96孔微量滴定板中，并添加200(iLGOD-Perid溶液(124036，BoehringerMannheim)。在室溫下30分鐘后，在650nm處測定吸光度，并根據AMG-標準以AGU/ml計算活性。更詳細地描述該分析方法的文件夾(AEL-SM-0131)函索NovozymesA/S,Denmark即可獲得，該文件夾在此并入作為參考。酸性a-淀粉酶活性(AFAU)酸性a-淀粉酶活性可以以AFAU(酸性真菌a-淀粉酶單位)測定，其中是相對于酶標準進行測定的。所使用的標準是AMG300L(來自NovozymesA/S，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉Gl,也披露于Boel等(1984),EMBOJ.3(5)，p.1097-1102和WO92/00381中)。在該AMG中的中性a-淀粉酶在室溫下貯藏3周后從大約1FAU/mL降低到低于0.05FAU/mL。才艮據以下描述測定該AMG標準中的酸性a-淀粉酶活性。在該方法中，1AFAU規定為在標準條件下，每小時降解5.26mg淀粉干物質固形物(drysolids)的酶的量。碘與淀粉形成藍色絡合物，但不與其降解產物形成藍色絡合物。因此，顏色強度與淀粉濃度成正比。使用在指定分析條件下作為淀粉濃度減少的逆比色法測定淀粉酶活性。a-淀粉酶淀粉+碘糊精+寡糖40。C,pH2.5藍色/紫色t-23秒.脫色標準條件/反應條件(每分鐘)底物淀粉，大約0.17g/L緩沖液檸檬酸鹽，大約0.03M碘(12):0.03g/LCaC12:1.85mM2.50-0.05X=590nm酶濃度:0.025AFAU/mL酶工作范圍0.01-0.04AFAU/mL更多細節優選這些能見于函索NovozymesA/S即可獲得的EB-SM-0259.02/01中的，在此并入作為參考。糖分布和溶解的干固形物的測定通過HPLC測定淀粉水解產物的糖成分，隨后計算葡萄糖產率為DX.。BRIX，并通過折光率(refractiveindex)測定法測定淀粉水解產物的溶解(可溶)干固形物。a-淀粉酶活性的測定通過使用Phadebas⑧藥片作為底物的方法測定a-淀粉酶活性。Phadebas藥片(Phadebas⑧淀粉酶檢驗標準，提供自PharmaciaDiagnostic)含有交聯的不溶性藍色淀粉聚合物，其已與牛血清白蛋白和緩沖物質混合并壓片。對于每一次測定，將一片懸浮于含有5ml50mMBritton-Robinson緩沖液(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mMCaCl2,用NaOH調節pH至所需值)的試管中。于所需溫度下在水浴中進行該測試。在xml的50mMBritton-Robinson緩沖液中稀釋要被測試的a-淀粉酶。將1ml該a-淀粉酶溶液添力卩到5ml50mMBritton-Robinson緩沖液中。通過a-淀粉酶釋放出可溶的藍色片段水解淀粉。在620nm處用分光光度計測定所得到的藍色溶液的吸光度，其是a-淀粉酶活性的函數。重要的是在10-15分鐘的溫育(測試時間)后測定的620nm吸光度要在0.2-2.0的620nm處吸光度單位范圍內。在該吸光度范圍內，在活性和吸光度之間存在線性(朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律)。因此應調節酶的稀釋以適合該標準。在給定的一組條件(溫度、pH、反應時間、緩沖液條件)下，lmg給定的a-淀粉酶應水解一定量的底物并會產生藍色。在620nm處測定顏色強度。在給定組的條件下，所測定的吸光度與所述a-淀粉酶的比活性(純的a-淀粉酶蛋白的每毫克活性)成正比。測定比活性使用Phadebas測定法(Pharmacia)測定比活性為活性/毫克酶。測定。H活性分布(pH穩定性)將變體貝i藏在20mMTRISpH7.5，0.1mM,CaCl2中,并在30°C下，50mMBritton-Robinson,0.1mMCaCl2中測試。使用上述Phadebas測定法，在pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0(9.5)、9.5、10和10.5下測定pH活性。實施例實施例1構建Termamyl變體LE429在枯草芽孢桿菌中由稱為pDN1528的質粒表達Termamyl(地衣芽孢桿菌a-淀粉酶SEQIDN0:4)。該質粒含有編碼Termamyl的完整基因，其表達受其自己的啟動子所指導。此外，該質粒含有來自于質粒pUB110的復制起點on',和賦予對氯霉素抗性的來自于質粒pC194的caf基因。pDN1528示于WO96/23874的圖9中。制備一種含有SEQIDNO:3編碼區主要部分的特定的誘變載體。稱為pJeENl的該載體的主要特征包括來自于pUC質粒的復制起點，賦予對氯霉素抗性的基因以及Wfl基因的含有移碼的變型，其野生型通常賦予對氨千青霉素的抗性(ampR表型)。該突變型產生ampS表型。質粒pJeENl示于WO96/23874的圖10中，大腸桿菌復制起點。".、亂ca、Termamyl淀粉酶基因的5'-截短變型以及所選擇的限制酶切位點指示在質粒上。除具有摻入的"選擇引物"(引物#6616，參見以下)的質粒是基于含有具有修復的Wa基因的質粒轉化的大腸桿菌細胞ampK表型進行選擇，而不使用Deng和Nickoloff所一既述的限制性內切酶消化選4奪之外，通過Deng和Nickoloff(1992,Anal.Biochem.200,pp.81-88)所述的方法將突變導入amy丄。用于該誘變的化學品和酶獲得自Stratagene的Chameleon(!)誘變試劑盒(目錄號200509)。在檢驗變體質粒中的DNA序列之后，將含有期望的改變的截短的基因作為尸Wl-五coRI片段亞克隆入pDN1528，并轉化入蛋白酶-和淀粉酶-缺失的枯草芽孢桿菌菌抹SHA273(描述于W092/11357和WO95/10603)中，以便表達變體酶。通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體V54W:通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體A52W+V54W:NO:10)引物#6616(5'到3'從左到右書寫；P表示5'磷酸)通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體V54E:PGGTCGTAGGCACCGTAGCCCTCATCCGCTTG(SEQIDNO:12)通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體V54M:通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體V54I:通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體Y290E和Y290K:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>Y表示C和T的等量混合。通過DNA測序驗證編碼第290位的谷氨酸或賴氨酸的密碼子的存在。通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體N190F:通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體N188P+N190F:PCATAGTTGCCGAATTCAGGGGAAACTTCCCAATC(SEQIDNO:17)通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體H1概+H142D:(SEQIDNO:18)通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體I-I156Y:PCAAAATGGTACCAA丁ACCACTTAAAATCGCTG(SEQIDNO:19)通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體A181T:通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體A209V:PCTTAATTTCTGCTACGACGTCAGGATGGTCATAATC(SEQIDNO:21)通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體Q264S:PCGCCCAAGTCATTCGACCAGTACTCAGCTACCGTAAAC(SEQIDNO:22)通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體S187D:通過使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體DELTA(K370-G371-D372)(即缺失氨基酸殘基370、371和372):PGGAATTTCGCGCTGACTAGTCCCGTACATATCCCC(SEQIDNO:24)通過4吏用以下誘變引物(5'到3'從左到右書寫)構建Termamyl變體DELTA(D372-S373陽Q374):PGGCAGGAATTTCGCGACCTTTCGTCCCGTACATATC(SEQIDNO:25)通過用切割pDN1528-樣質粒兩次產生1116bp片段和3850bp載體部分(即含有質粒復制起點)的限制性內切酶C/gI消化含有A1WT的pDNl528-樣質粒(即在flmy丄中含有引起A181T改變的突變的pDN1528)和含有A209V的pDN1528-樣質粒(即在awy丄中含有引起A209V改變的突變的pDN1528),將Termamyl變體A181T和A209V結合為A181T+A209V。在瓊脂糖凝膠上分離后，通過QIAquick凝膠抽提試劑盒(購自QIAGEN)純化含有A209V突變的片段和含有A181T突變的載體部分。連接片段和載體并轉化入上述提及的蛋白酶和淀粉酶缺失的枯草芽孢桿菌菌抹。對來自aw少+(在含有淀粉的瓊脂平板上亮區)和氯霉素抗性的轉化體的質粒分析質粒上兩種突變的存在。以類似于上述的方法，使用限制性內切酶Acc651和EcoRI結合HI56Y和A209V，給出H156Y+A209V。通過使用限制性內切酶Acc651和HindIII將H156Y+A209V和A181T+A209V結合為H156Y+A181T+A209V。利用SOE-PCR方法(Higuchi等1988，NucleicAcidsResearch16:7351),Termamyl變體H156Y+A181T+A209V成熟部分的35個N-末端殘基被解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶(SEQIDNO:4)(在本發明上下文中稱為BAN)的33個N-末端殘基所取代，如下引物19364(序歹'〗5,-3,):CCTCATTCTGCAGCAGCAGCCGTAAATGGCACGCTG(SEQIDNO:26)引物19362:CCAGACGGCAGTAATACCGATATCCGATAAATGTTCCG(SEQIDNO:27)引物19363:CGGATATCGGTATTACTGCCGTCTGGATTC(SEQIDNO:28)引物1C:CTCGTCCCAATCGGTTCCGTC(SEQIDNO:29)根據廠商的說明書，使用來自BoehringerMannheim的Pwo耐熱聚合酶進行標準PCR(聚合酶鏈反應)，溫度循環94。C5分鐘，25個循環(94。C30秒、50。C45秒、72。C1分鐘)，72。C10分鐘。在稱為PCR1的第一次PCR中，使用引物19364和19362，對含有編碼解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶的基因的DNA片段擴增出大約130bp片段。在稱為PCR2的另一次PCR中，使用引物19363和1C，對模板pDN1528擴增出大約400bp片段。PCR1和PCR2純化自瓊脂糖凝膠并在使用引物19364和1C的PCR3中被用作為模板，得到大約520bp的片段。因此，該片段含有融合至編碼從第35個氨基酸起的Termamy的DNA的一部分的編碼來自BAN的N-末端的DNA的一部分。通過用限制性內切酶Pstl和SacII消化、連接并如先前所述的轉化枯草芽孢桿菌菌抹，將520bp片段亞克隆入pDN1528-樣質粒(含有編碼Termamyl變體H156Y十A181T+A209V的基因)中。通過在提取的來自a77^+和氯霉素抗性轉化體的質粒中進行DNA測序驗證在限制酶切位點尸WI和SacII之間的DNA序列。最終的構建體含有來自BAN的正確N-末端和H156Y+A181T+A209V，稱為BAN(1-35)+H156Y+A181T+A209V。除pJeENl中的am;;丄序列為編碼Termamyl變體BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V的DNA序列所取代之外，通過如上所述進行誘變，將N190F與BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V結合，給出BAN(l-35)+H156Y+A181T+N1卯F+A209V。除pJeEN中的amyL序列為編碼Termamyl變體BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V的DNA序列所取代之外，通過如上所述進行誘變，將Q264S與BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V結合，給出BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V+G264S。利用限制性內切酶i^aHI(在A209V突變附近導入份aHI位點)和PWl，將BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V+Q264S和BAN(l-35)+H156Y+A181T+N190F+A209V結合入BAN(l-35)+H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S。通過如上所述進行誘變，將I201F與BAN(l-35)+H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S結合，給出BAN(l-35)+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(SEQIDNO:2)。使用誘變引物AM100,導入I201F取代并同時除去Clal限制酶切位點，其利于容易鑒別突變。引物AM100:5,GATGTATGCCGACTTCGATTATGACC3，(SEQIDNO:30)實施例2構建具有改變的淀粉親和力的Termamyl-樣a-淀粉酶變體構建LEI153(LE429+R437W):通過PCR，使用結合淀粉酶基因下游的載體引物CAAX37和誘變引物CAAX447擴增來自pDN1528-樣質粒(在編碼來自SEQIDNO:4的淀粉酶的的大約450bpDNA片l爻。450bp片段純化自瓊脂糖凝膠并用作為大(mega)引物與引物IB—起對相同的模板進行在第二PCR。用限制性內切酶PstI和AvrII消化所得到的大約1800bp片段，純化所得到的大約1600bpDNA片段并與用相同的酶消化的pDN1528-樣質粒連接。用連接和氯霉素抗性的轉化體轉化感受態枯草芽孢桿菌SHA273(低淀粉酶和蛋白酶)細胞，并通過DNA測序檢查以驗證質粒上正確突變的存在。引物CAAX37:5，CTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGC3,(SEQIDNO:31)引物IB:5，CCGATTGCTGACGCTGTTATTTGC3，(SEQIDNO:32)引物CAAX447:5，CCCGGTGGGGCAAAGTGGATGTATGTCGGCCGG3，(SEQIDNO:33)構建LEI154:除使用兩種誘變引物CAAX447和CAAX448之外，以類似的方法構建BAN/Termamyl雜合+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+[R437W+E469N]。引物CAAX448:5'CGGAAGGCTGGGGAAATTTTCACGTAAACGGC3'(SEQIDNO:34)實施例3構建具有改變的淀粉親和力的BAN-樣a-淀粉酶變體(R176*+G177*)BAN(解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶SEQIDNO:6)由類似于描述于實施例1中的pDN1528的質粒在枯草芽孢桿菌中表達。該稱為pCA330-BAN的BAN質粒含有取代限定為SEQIDNO:4中的氨基酸1-483的編碼地衣芽孢桿菌a-淀粉酶成熟部分的基因的限定為SEQIDNO:6中的氨基酸1-483的編碼BAN成熟部分的基因。解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶的變體示于SEQIDNO:2,包含兩個氨基酸缺失R176和G177以及N190F取代(使用SEQIDNO:6中的編號)，與野生型解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶相比，具有改善的穩定性。該變體在下文中稱為BAN-var003。為改善所述a-淀粉酶變體的淀粉親和力和水解能力，使用Sarkar和Sommer,19卯(BioTechniques8:404-407)所述的大引物方法進行位點定向誘變.構建BE1001:BAN-var003+R437W:通過PCR,使用結合淀粉酶基因下游的載體引物CAAX37和誘變引物CABX437擴增來自pCA330-BAN質粒(在編碼來自SEQIDNO:6的淀粉酶的基因中含有BAN-var003突變)的大約450bpDNA片段。450bp片段純化自瓊脂糖凝膠并用作為大引物與引物IB—起對相同的模板進行第二PCR。用限制性內切酶PstI和AvrII消化所得到的大約1800bp片段，純化所得到的大約1600bpDNA片段并與用相同的酶消化的pCA330-樣質粒連接。用連接和氯霉素抗性的轉化體轉化感受態枯草芽孢桿菌SHA273(低淀粉酶和蛋白酶)細胞，并通過DNA測序^r查以^r證質粒上正確突變的存在。引物CABX437:5，GGTGGGGCAAAGTGGATGTATGTCGGC3，(SEQIDNO:35)構建BE1004:除使用兩種誘變引物CABX437和CABX438之外，以類似方法構建BAN-var003淀粉酶+[R437W+E469N]。CABX438:5'GGAAGGCTGGGGAAACTTTCACGTAAACG3，(SEQIDNO:36)實施例4TermamylLC對LE1153和LE1154該實施例說明了與TermamylLC相比，使用根據本發明的細菌a-淀粉酶(LE1153和LE1154)將粒狀小麥淀粉轉化為葡萄糖。通過在攪拌下將247.5g小麥淀粉添加到502.5ml水中，制備具有33%干固形物(DS)粒狀淀粉的淤漿。用HCl將pH調節到4.5。將粒狀淀粉漿分配在100ml錐形燒瓶中，每瓶75g。在60。C水浴中溫育燒瓶，帶有磁力攪拌。在0小時處，將表1中所給出的酶活性劑量給予燒瓶。在24、48和73以及94小時后提取樣品。表1.使用的酶活性水平<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>使用以下方法測定總的干固形物淀粉。通過添加過量的a-淀粉酶(300KNU/kg干固形物)并將樣品置于95。C油浴中45分鐘完全水解淀粉。隨后將樣品冷卻至60。C，并添加過量的葡糖淀粉酶(600AGU/kgDS),接著在60°C下溫育2小時。在通過0.22微米過濾器過濾后，通過折光率測定法對樣品測定淀粉水解產物中的可溶性千固形物。通過HPLC測定糖分布。葡萄糖的量計算為DX。結果示于表2和3中。表2.在100KNU/kgDSa-淀粉酶用量下，可溶性千固形物占總的<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>該實施例說明了與BANWT相比，使用根據本發明的BANR437W變體的細菌(X-淀粉酶將粒狀小麥淀粉轉化為葡萄糖。通過在攪拌下將247.5g小麥淀粉添加到502.5ml水中，制備具有33%干固形物(DS)粒狀淀粉的淤漿。用HCl將pH調節到4.5。將粒狀淀粉漿分配在100ml錐形燒瓶中，每瓶75g。在60。C水浴中溫育燒瓶，帶有磁力攪拌。在0小時處，將表1中所給出的酶活性給予燒瓶。在24、48和73以及94小時后提取樣品。表1.使用的酶活性水平a<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>使用以下方法測定總的干固形物淀粉。通過添加過量的a-淀粉酶(300KNU/kg干固形物)并將樣品置于95。C油浴中45分鐘完全水解淀粉。隨后將樣品冷卻至60°C,并添加過量的葡糖淀4分酶(600AGU/kgDS)，接著在60。C下溫育2小時。在通過0.22微米過濾器過濾后，通過折光率測定法對樣品測定淀粉水解產物中的可溶性干固形物。通過HPLC測定糖分布。葡萄糖的量計算為DX。結果示于表4和5中。表4.在100KNU/kgDSa-淀粉酶用量下，可溶性干固形物占總的干物質的百分數<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>參考文獻Klein,C.，等，所oc/zem/Wo;31,8740-8746，Miz腳，H.，等，JMo/.扁.(1993)234,1282-1283，Chang,C.,etal,/Mo/.扁.(1993)229,235-238,Larson,S.B.,J^fo/.歷o/.(1994)235，1560-1584，Lawson，C丄.，/7kfo/.J5/o/.(1994)236，590-600，Qian,M"等，/M/.腸/.(1993)231,785-799,Brady，R丄.，等，D^to〃o^:5，47，527-535,Swift,H丄，等，爿ctoCV^to〃ogr.B,47，535-544A.Kadziola,博士論文"Analpha-amylasefromBarleyanditsComplexwithaSubstrateAnalogueInhibitorStudiedbyX-rayCrystallography",DepartmentofChemistryUniversityofCopenhagen1993MacGregor，E.A.，FoodHydrocolloids,1987,Vol.1,No.5-6,p.B.Diderichsen和L.Christiansen,CloningofamaltogenicamylasefromBac/〃w5Weoro^2enMo//n'/ws,FEMSMicrobiol,letters:56:pp.53-60(1988)Hudson等,PracticalImmunology,Thirdedition(1989》BlackwellScientificPublications,Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,1989S丄.Beaucage和M.H.Caruthers,TetrahedronLetters22,1981,pp.1859-1869Matthes等，TheEMBOJ.3,1984,pp,801-805.R.K.Saiki等，Science239,1988,pp.487-491.Morinaga等，(984,Biotechnology2:646-639)Nelson和Long,AnalyticalBiochemistry180，1989,pp.147-151Hunkapiller等，1984,Nature310:105-111R.Higuchi,B.Krummel和R,K.Saiki(1988).Ageneralmethodofz'"v"rapreparationandspecificmutagenesisofDNAfragments:studyofproteinandDNAinteractions.jVmc/.爿"Ai饑16:7351-7367.Dubnau等，1971,J.Mol.Biol.56,pp.209-221.Gryczan等,1978,J,Bacteriol.134，pp.318-329.S.D.Erlich，1977,Proc.Natl.Acad.Sd.74,pp.1680-1682.Boel等，1990,Biochemistry22，pp.6244-6249.Sarkar和Sommer,1990,BioTechniques8，pp.404-407.權利要求1.具有α-淀粉酶活性并包含取代R437W的親本Termamyl-樣α-淀粉酶的變體，其中所述位置相應于具有SEQIDNO4之氨基酸序列的親本Termamyl-樣α-淀粉酶的氨基酸序列的位置。2.權利要求1的變體，其中親本a-淀粉酶是SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的雜合a-淀粉酶。3.權利要求l-2任一項的變體，其中親本雜合a-淀粉酶是包含如SEQIDNO:4所示的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的445個C-末端氨基酸殘基和如SEQIDNO:6所示的來源于解淀粉芽孢桿菌的a-淀粉酶的37個N-末端氨基酸殘基的雜合a-淀粉酶。4.權利要求1-3任一項的變體，其中親本雜合Termamyl-樣a-淀粉酶進一步具有以下突變H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S(使用SEQIDNO:4中的編號)或LE174。5.權利要求1-3任一項的變體，其中親本雜合Termamyl-樣a-淀4分酶進IDNO:4的編號)或LE429。6.權利要求l-5任一項的變體，其中變體包含一個或多個以下額外的突變R176*、G177*、E469N(使用SEQIDNO:6中的編號)。7.權利要求l-6任一項的變體，其中變體包含額外的突變E469N(使用SEQIDNO:6中的編號)。8.權利要求1-6任一項的變體，其中變體包含額外的突變R176*+G177*+E469N(使用SEQIDNO:6中的編號)。9.權利要求1的變體，其中親本a-淀粉酶是SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的a-淀4分酶。10.權利要求9的變體，其中變體包含一個或多個以下額外的突變R176*、G177*、N190F、E469N(使用SEQIDNO:6中的編號)。11.權利要求10的變體，其中變體包含額外的突變R176承+G177氺+N190F(使用SEQIDNO:6中的編號)。12.權利要求11的變體，其中變體包含額外的突變E469N(使用SEQIDNO:6中的編號)。13.權利要求1-12任一項的變體，其中親本Termamyl-樣a-淀粉酶具有與SEQIDNO:4具有至少60%、優選70°/。、更優選至少80%、甚至更優選至少約90%、甚至更優選至少95%、甚至更優選至少97%以及甚至更優選至少約99%同一性水平的氨基酸序列。14.一種包含編碼根據權利要求1-13任一項的a-淀粉酶變體的DNA序列的DNA構建體。15.—種攜有根據權利要求14的DNA構建體的重組表達載體。16.—種用根據權利要求14的DNA構建體或根據權利要求15的載體轉化的細胞。17.權利要求16的細胞，其是微生物，特別是細菌或真菌，例如革蘭氏陽性細菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、杣爛芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌。18.—種包含權利要求1-13的a-淀粉酶變體的組合物。19.一種生產根據權利要求l-13任一項的變體的方法，其中在有利于產生變體的條件下培養根據權利要求16-17任一項的細胞，并隨后從培養物中回收變體。20.權利要求1-13任一項的a-淀粉酶變體或權利要求18的組合物在淀粉液化；在洗滌劑組合物，例如洗衣、碗碟清洗和硬表面清潔組合物；乙醇生產，例如燃料、^L用和工業乙醇生產；紡織品、織物或衣物的退漿中的應用。全文摘要本發明涉及親本Termamyl-樣α-淀粉酶的變體，該變體具有改變的特性，具體來說是相對于親本α-淀粉酶增加的淀粉親和力。文檔編號C12P19/14GK101128579SQ200580048604公開日2008年2月20日申請日期2005年12月22日優先權日2004年12月23日發明者卡斯滕·安德森,安德斯·維克索-尼爾森申請人:諾維信公司