專利名稱：淀粉酶變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及相對于親本酶而言具有改良的性質(如，改良的熱和/或氧化穩定性和/或降低的鈣離子依賴性)并由此改良了洗滌和/或餐具洗滌(和/或紡織品去漿)性能的α-淀粉酶變體。本發明也涉及編碼所說的變體的DNA構建體以及攜帶DNA構建體的載體和細胞。本發明還涉及產生淀粉酶變體的方法以及包含淀粉酶變體的去垢劑添加劑和去垢組合物。本發明還涉及淀粉酶變體在紡織品去漿上的用途。
背景技術：
α-淀粉酶在工業上使用了很多年，用途很廣，其中最重要的是淀粉液化、紡織品去漿、在造紙和紙漿工業方面淀粉改性以及用于釀酒和烘烤。另一個日益重要的α-淀粉酶的用途是在洗滌或餐具洗滌期間除去含淀粉的污垢。
近年來試圖構建具有對特異性用途(如淀粉液化和紡織品去漿)的改良的性質的α-淀粉酶變體。
例如，美國5,093,257公開了包含嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶N-末端一部分和地衣芽孢桿菌α-淀粉酶C-末端一部分的嵌合α-淀粉酶。據記載，嵌合α-淀粉酶具有獨特的性質，如與其親本α-淀粉酶相比不同的熱穩定性。然而，所有具體描述的嵌合α-淀粉酶與其親本α-淀粉酶相比表現出降低的酶促活性。
EP252 666描述了通式為Q-R-L的雜種淀粉酶，其中Q是從55至60的氨基酸殘基的N-末端多肽殘基，它與已說明的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的57N-末端氨基酸殘基至少75％是同源的，R是已說明的多肽，L是包含390至400氨基酸殘基的C-末端多肽，它與已說明的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的395C-末端氨基酸殘基至少75％是同源的。
Suzuki等(1989)公開了嵌合α-淀粉酶，其中液解化淀粉桿菌α-淀粉酶的指定區域已被地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的相應區域替代。為了鑒別對熱穩定性起作用的區域，構建了嵌合α-淀粉酶。發現這樣的區域包括液解化淀粉桿菌α-淀粉酶的氨基酸殘基第177-186和氨基酸殘基255-270。在嵌合α-淀粉酶中氨基酸殘基的改變似乎不影響酶的性質，而非其熱穩定性。
WO 91/00353公開了至少一種氨基酸殘基與其親本α-淀粉酶不同的α-淀粉酶突變體。在所說的專利申請中公開的α-淀粉酶突變體由于其氨基酸取代應用于淀粉降解和/或紡織品去漿表現出改良的性質。一些突變體表現出穩定性提高，但是沒有報道或指出酶促活性的改進。僅作為例子說明的突變體從親本地衣芽孢桿菌α-淀粉酶制備，它攜帶下列突變之一H133Y或H133Y+T1491。已證明的另一個突變是A111T。
FR 2,676,456公開了地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的突變體，其中在組氨酸133附近的一種氨基酸殘基和/或丙氨酸209附近的一種氨基酸殘基已被一種更疏水的氨基酸殘基取代。據記載，產生的α-淀粉酶突變體具有改良的熱穩定性，在紡織品、造紙、釀酒和淀粉液化工業中是有用的。
EP 285 123公開了進行核苷酸序列隨機誘變的方法。作為這樣的序列的一個例子提到了編碼嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的核苷酸序列。當突變時，獲得了在低pH值下具有改良的活性的α-淀粉酶變體。
在上述參考中沒有一個提到甚至暗示可以構建對去垢劑工業來說有改良的性質的α-淀粉酶突變體。
EP 525 610涉及具有對表面活化劑改良的穩定性的突變體酶。突變體酶通過親本酶的表面部分的一種氨基酸殘基已被另一種氨基酸殘基取代產生。在EP 525 610中具體描述的唯一突變體酶是蛋白酶。淀粉酶作為可獲得對表面活化劑改良的穩定性的酶的例子被提到，但是淀粉酶的類型、起源或特異性的突變都沒指明。
WO 94/02597公開了在氧化劑存在下表現出改良的穩定性和活性的α-淀粉酶突變體。在突變體α-淀粉酶中，一個或多個甲硫氨酸殘基已被不同于半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸殘基取代。據記載，α-淀粉酶突變體可用于去垢劑和/或餐具洗滌添加劑以及紡織品去漿。
WO 94 18314公開了對氧化穩定的α-淀粉酶突變體，包括在地衣芽孢桿菌α-淀粉酶M197位置的突變。
EP 368 341描述了與/不與用于洗滌和餐具洗滌的α-淀粉酶組合的支鏈淀粉酶和其它淀粉分解酶。
本發明的一個目的是提供α-淀粉酶變體，該變體相對于其親本α-淀粉酶具有重要的改良性質，特別是有關所說的變體的洗滌和/或餐具洗滌性能，例如，增加的熱穩定性、增加的氧化穩定性、降低的對Ca2+離子的依賴性和/或在適當的pH值區域中(例如，洗衣或餐具洗滌)改良的穩定性或活性。這樣的變體α-淀粉酶有優勢，其中，它們可以在比其親本α-淀粉酶更低的劑量下使用。而且，α-淀粉酶變體可以除去含淀粉的污垢，而此污垢不能(或有困難)用目前已知的α-淀粉酶去垢劑酶除去。
發明的簡要說明 作為本發明基礎的工作的目的在于改良(如果可能的話)α-淀粉酶(特別是，具體來說從芽孢桿菌菌株獲得的α-淀粉酶)的穩定性，這些α-淀粉酶以其在堿性介質(如在洗衣或餐具洗滌中典型使用的去垢劑溶液)中除去淀粉的性能為基礎相對于目前市售的α-淀粉酶選擇。在這方面，本發明的發明人令人驚奇地發現事實上可以通過親本α-淀粉酶的氨基酸序列的不同區域的一種或多種氨基酸殘基的合理修飾來改良這樣的親本α-淀粉酶的上述類型(見上)的性質。本發明以此發現為基礎。
因此，本發明的第一個方面涉及親本α-淀粉酶的變體，所說的親本α-淀粉酶是一種 i)具有分別在本文的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一；或 ii)與在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的一種或多種氨基酸序列表現出至少80％的同源性；和/或顯示出與由抗具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一的α-淀粉酶產生的抗體的免疫交叉反應性；和/或由與編碼具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.7中所示的氨基酸序列之一的α-淀粉酶之DNA序列相同的探針雜交的DNA序列編碼。
本發明的α-淀粉酶變體所符合的條件為該變體是不與在SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列有相同的氨基酸序列的變體。
編碼所述的前三個α-淀粉酶氨基酸序列的DNA序列在SEQ ID No.4(編碼在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列)、SEQ ID No.5(編碼在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列)和SEQ ID No.6(編碼在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列)中顯示。
在WO 95/26397中也公開了SEQ ID No.1和SEQ ID No.2親本α-淀粉酶的氨基酸序列和相應的DNA序列(分別為SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)(和本專利申請的SEQ ID NOs.相同)。
本發明的變體是這樣的變體，其中(a)至少一種所說的親本α-淀粉酶的氨基酸殘基已被缺失；和/或(b)至少一種所說的親本α-淀粉酶的氨基酸殘基已被一種不同的氨基酸殘基取代；和/或(c)相對親本α-淀粉酶而言至少有一種氨基酸殘基已被插入；所說的變體具有α-淀粉酶活性并且相對于親本α-淀粉酶表現出至少一種下列性質 增加的熱穩定性，即在比使用親本酶適合的溫度更高的溫度下令人滿意地保持酶促活性； 增加的氧化穩定性，即對氧化劑(如氧，氧化的漂白劑等等)變性的抗性提高； 降低的Ca2+依賴性，即在比親本α-淀粉酶更低濃度的Ca2+存在時令人滿意地起作用的能力。有這種降低的Ca2+依賴性的α-淀粉酶在用于去垢組合物中時是十分合乎需要的，因為這樣組合物典型地包含較大量的強烈結合鈣離子的物質(如磷酸鹽，EDTA等等)。
其它可用按照本發明的變體達到的合乎需要的性質改良(與所說的親本α-淀粉酶相比)的例子有 在中性或比較高的pH值(例如，pH值在7-10.5的范圍內(如8.5-10.5的范圍))下穩定性和/或α-淀粉酶分解活性提高； 在比較高的溫度下(例如，在40-70℃范圍內的溫度)α-淀粉分解活性提高； 提高或降低等電點(pI)以使所說的α-淀粉酶變體與變體在其中使用的介質(例如，洗衣介質、餐具洗滌介質或紡織品-去漿介質)(見下)的pI值更好地匹配； 改良的對特定類型的底物的結合，改良的對底物的特異性，和/或改良的對底物裂解(水解)的特異性。
如果通過進行已知算法(如Lipman和Pearson，科學，227(1985)，1435)分別得出的氨基酸序列比較揭示出X％的等同性，就可認為氨基酸序列和親本α-淀粉酶X％同源。使用缺省的GAP懲罰值，可適當地使用7.3版的GCG軟件包(1993，6)的GAP計算機程序[遺傳學計算機組(1991)，GCG軟件包程序手冊，第7版，575 Science Drive，Madison，威斯康辛州，美國53711]。
在本發明中，如上所述，和洗滌與餐具洗滌一起使用的“改良的性能”意思是分別在洗滌或餐具洗滌期間改良的含淀粉的污垢(即包含淀粉的污垢)的去除。可以在常規洗滌的和餐具洗滌實驗中確定性能，通過與所說的親本α-淀粉酶的比較來評價改良。在下面的實驗部分中描述了可用于餐具洗滌性能指示的一個小規模的“小型餐具洗滌試驗”的例子。
可以理解，α-淀粉酶變體的許多特征單獨或組合起來可以解釋其改良的性能，這些特征包括特異性活性、底物特異性、Km(所謂的在Michaelis-Menten方程中的“米氏常數”)、Vmax[給定底物在Michaelis-Menten方程基礎上測定的最大轉化轉化速率(最高值(plateau))、pI、最適pH值、最適溫度、熱激活、對氧化劑或表面活化劑(例如，在除垢劑中的)的穩定性，等等。技術人員清楚變體的性能不能在上述特征的基礎上單獨預測，而必須伴隨著洗滌和/或餐具洗滌性能試驗預測。
本發明的另一個方面涉及包含編碼本發明的α-淀粉酶變體的DNA序列的DNA構建體、攜帶該DNA構建體的重組表達載體、用此DNA構建體或載體轉化的細胞以及通過在有益于α-淀粉酶變體產生的條件下培養這樣的細胞然后從培養物中回收α-淀粉酶變體以產生α-淀粉酶變體的方法。
本發明的另一個方面涉及制備親本α-淀粉酶變體的方法，該變體由于如上所述的改良的性質和親本α-淀粉酶比較表現出改良洗滌和/或餐具洗滌性能。這種方法包括 a)構建包含編碼所說的親本α-淀粉酶變體的基因的細胞群， b)在模擬至少一種洗滌和/或餐具洗滌的條件下篩選該細胞群的α-淀粉酶活性， c)從包含編碼所說的親本α-淀粉酶變體基因的細胞群中分離出細胞，其中的變體在步驟b)選擇的條件下和親本α-淀粉酶相比具有改良的活性， d)在適合條件下的適當培養基上培養步驟c)中分離的細胞， e)從在步驟d)中獲得的培養物中回收α-淀粉酶變體。
本發明也涉及通過后面的一種方法制備的變體(該變體是按照本發明的變體)。
在本發明中，術語“模擬至少一種洗滌和/或餐具洗滌條件”意思是指這樣的模擬，例如，在洗滌或餐具洗滌期間最普通的溫度或pH值，或在洗滌或餐具洗滌處理中所用的去垢組合物中的化學組合物。術語“化學組合物”是指包括所說的去垢組合物的一種成分(或兩種或多種的成分的組合)。許多不同的去垢組合物的成分列于下面。
步驟a)所指的細胞群可通過克隆編碼親本α-淀粉酶的DNA序列并使DNA進行本文下述的定點或隨機誘變適當地構建。
在本發明中，術語“變體”與術語“突變體”可互換使用。術語“變體”意思是包括雜種α-淀粉酶，即包含至少兩個不同的淀粉分解酶的部分。這樣，這樣一種雜種可以從，例如，從以上定義的變體衍生的一部分或多部分；或從以上定義的變體衍生的一部分或多部分以及從一種未改良的親本α-淀粉酶衍生的一部分或多部分構建。在這方面，本發明也涉及一種產生這樣的雜種α-淀粉酶的方法，其中的α-淀粉酶于與它的成分酶任一相比(即與組成雜種的一部分的任何一種酶相比)具有改良的洗滌和/或餐具洗滌性能，該方法包括 a)在體內或體外重組α-淀粉酶基因的N-末端編碼區或具有α-淀粉酶基因的C-末端編碼區的組分α-淀粉酶之一的相應cDNA或另一個組分α-淀粉酶基因的相應cDNA以形成重組體， b)選擇產生與其組分α-淀粉酶相比具有改良的洗滌和/或餐具洗滌性能的雜種α-淀粉酶的重組體， c)在適合條件下的適當培養基上培養步驟b)中分離的細胞， d)從在步驟c)中獲得的培養物中回收雜種α-淀粉酶變體。
本發明的另一個方面涉及本發明的α-淀粉酶變體[包括通過上述方法之一制備的變體或雜種]作為去垢劑酶(具體來說是用于洗滌或餐具洗滌)的用途，本發明也涉及包含α-淀粉酶變體的去垢劑添加劑和去垢組合物以及本發明的α-淀粉酶變體在紡織品去漿上的用途。
按照本發明的變體可通過隨機誘變產生，本發明進一步涉及一種制備親本α-淀粉酶變體的方法，該方法包括 (a)隨機誘變編碼親本α-淀粉酶的DNA序列， (b)在宿主細胞中表達在步驟(a)中獲得突變的DNA序列， (c)篩選表達突變的淀粉分解酶的宿主細胞，該淀粉分解酶和親本α-淀粉酶相比具有如上所述的改良性質(例如，性質如降低的Ca2+依賴性、增加的氧化穩定性、增加的熱穩定性和/或在較高的pH值下改良的活性)。
發明詳述 表示法 在本發明的描述和權利要求中，使用了常規的核苷酸單字母碼和常規的氨基酸殘基的三字母碼。為易于參考，本發明的α-淀粉酶變體通過使用下列表示法描述 原來的氨基酸位置取代的氨基酸 按照該表示法的例子是，天冬酰胺在位置30取代丙氨酸可表示為 Ala 30 Asn 或A 30N 相同位置的丙氨酸缺失表示為 Ala 30* 或 A30* 一種附加的氨基酸殘基(如賴氨酸)的插入可表示為 Ala 30 AlaLys或A30AK 一段連續的氨基酸殘基的缺失，以氨基酸殘基30-33為例可表示為(30-33)*。
特異性α-淀粉酶包含與其它α-淀粉酶相比的“缺失”(即缺少一種氨基酸殘基)和在這一位置上產生插入，這可表示為 *36 Asp或*36D 表示在位置36中插入一個天冬氨酸 多突變通過加號區別，即 Ala30Asp+Glu34Ser 或A30N+E34S 代表在位置30和34的突變(其中丙氨酸和谷氨酸分別被天冬酰胺和絲氨酸取代)。
當一種或多種可替換的氨基酸殘基可以插入到給定的位置時，可以表示為 A30N、E或 A30N或A30E 而且，本文中當適于修飾的位置被指明，而沒有任何特定的修飾被指定時，可理解為任何其它的氨基酸殘基都可取代那個位置上存在的氨基酸殘基(即選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V的任何氨基酸殘基-而非在所說的位置正常存在的氨基酸殘基)。這樣，例如，當在位置202的甲硫氨酸的修飾(取代)被提到、但沒有指定時，可以理解為任何其它的氨基酸，即任何選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y和V中的其它氨基酸可用于取代甲硫氨酸。
親本α-淀粉酶 已經提到，本發明的α-淀粉酶變體非常適于在具有分別在SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一的親本α-淀粉酶的基礎上制備。
具有分別在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶可從親堿的(alkaliphilic)芽孢桿菌屬菌株(分別為菌株NCIB 12513和菌株NCIB 12512)獲得，它們在EP 0 277 216 B1中詳盡描述。這兩種親本α-淀粉酶制備、純化和測序在WO 95/26397中詳細描述[參見本文的實驗部分(見下)]。
具有SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶可從嗜熱脂肪芽孢桿菌獲得并在(特別是)細菌學雜志，166(1986)，635-643中描述。
具有SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶(它和在
圖1中的第4個序列相同)可從“芽孢桿菌屬一個種#707”中獲得并由Tsukamoto等在生物化學研究信息，151(1988)，25-31頁描述。
除了上述的具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的變體之外，按照本發明的其它興趣變體包括具有表現出和后面的四種氨基酸序列至少一種之高度同源性的氨基酸序列的親本α-淀粉酶，如至少70％同源，優選的(如上所述的)至少80％同源，最好至少85％同源，更優選的至少90％同源，例如，95％同源。
如上所述，鑒別適當的親本α-淀粉酶的標準是a)α-淀粉酶顯示出與抗具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一的α-淀粉酶產生的抗體的免疫交叉反應性，和/或b)α-淀粉酶由這樣的DNA序列編碼，該DNA與編碼具有分別在SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7所示的氨基酸序列之一的α-淀粉酶的DNA序列相同的探針雜交。
已經提到，對于多肽(如酶)同源程度的測定，可以使用已知算法進行(如Lipman和Pearson所描述的(1985))氨基酸序列比較。
可以使用抗體進行免疫交叉反應性測定，所述抗體是抗具有SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的、或具有在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的、或具有在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的、或具有在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的至少一種表位(或與之反應)所產生的。
抗體可是單克隆或多克隆的，可通過本領域已知的方法(例如，象由Hudson等所描述的(1989))產生。在本領域中熟知的適當測定技術的例子包括Western印跡法和徑向免疫擴散測定，例如，由Hudson等所描述的(1989)。
以探針雜交[上述標準b)]為基礎用于鑒別適當的親本α-淀粉酶的寡核苷酸探針可以，例如，適當地在這樣的α-淀粉酶的全部或部分氨基酸序列的基礎上制備(該α-淀粉酶具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.7中所示的序列之一)，或者在此α-淀粉酶相應的核苷酸序列的全部或部分的基礎上制備。
用以試驗雜交的適當條件包括在5×SSC中預浸漬，在～40℃的pH6.8的20％甲酰胺、5×Denhardt s溶液、50mM磷酸鈉的溶液以及50μg變性的超聲處理小牛胸腺DNA中預雜交1小時，接著在40℃下和補充了100μM ATP的相同溶液中雜交18小時，或者使用其它由，例如，Sambrook等(1989)描述的方法。
突變對特定性質的影響 從本發明發明人獲得的結果可以看出，相對于所說的親本α-淀粉酶的變體特定表現出的性質(例如，熱穩定性或氧化穩定性)的變化在相當大的程度上和變體突變(氨基酸的取代、缺失與插入)的類型和位置有關。然而，可以理解，特定的突變或突變方式導致給定性質的變化的觀察決不排除所說的突變也能影響其它性質的可能性。
氧化穩定性對于提高相對于親本α-淀粉酶的α-淀粉酶變體的氧化穩定性，看來特別需要至少一種(優選的是多種)親本的可氧化的氨基酸殘基被缺失或被一種比原來的可氧化的氨基酸殘基對氧化敏感性低的不同的氨基酸殘基取代。
具體來說，在這一點上有關的可氧化的氨基酸殘基是半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸。這樣，例如，在包含半胱氨酸的親本α-淀粉酶的情況下，可預期半胱氨酸殘基的缺失或被可氧化性低的氨基酸殘基的取代在獲得相對于親本α-淀粉酶具有改良的氧化穩定性的變體中是重要的。
在上述具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的情況下(所有這些親本α-淀粉酶不包含半胱氨酸殘基但具有較多的甲硫氨酸含量)，甲硫氨酸殘基的缺失或取代對于達到產生的變體的改良的氧化穩定性是尤其有關的。這樣，在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的M9、M10、M105、M202、M208、M261、M309、M382、M430和M440位置和/或在SEQ IDNo.2中所示的氨基酸序列的M323位置的一種或多種甲硫氨酸殘基的缺失或取代[例如，已被蘇氨酸(T)或已被以上所列其它氨基酸之一取代](或符合上述親本α-淀粉酶的其它標準之一的另一種α-淀粉酶序列的相當的(equivalent)位置的甲硫氨酸殘基的缺失或取代)對于提高氧化穩定性看來是尤其有效的。
在具有在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的情況下，對于以氧化穩定性為目的而缺失或取代的有關氨基酸殘基包括單一的半胱氨酸殘基(C363)以及-通過和在SEQ ID No.1和SEQ ID No.3中所示的序列類比-定位在位置M8、M9、M96、M200、M206、M284、M307、M311、M316和M438的甲硫氨酸殘基。
在這方面，術語“相當的位置”指的是這樣的位置，在以所說的親本α-淀粉酶氨基酸序列和所說的“參比”α-淀粉酶的氨基酸序列(如在SEQ IDNo.1中所示的序列)的序列對比為基礎使二者共同的氨基酸殘基/區域對合時，該位置最接近地對應于所說參比序列中的特定位置(例如，已被相同的氨基酸殘基占據)。
與具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的氧化穩定性的改良(提高)有關的特定的興趣突變是一種或多種下列的甲硫氨酸取代(或其在符合本發明的親本α-淀粉酶要求的其它α-淀粉酶的氨基酸序列中的相當的取代)M202、A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V。
在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中的其它有關甲硫氨酸取代是M323A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V。
與具有在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的氧化穩定性的改良(提高)有關的特定的興趣突變是一種或多種下列的甲硫氨酸取代M200A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V；M311A、R、N、D、Q、E、G、F1、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V；以及M316A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V。
熱穩定性就相對于其親本α-淀粉酶增加的熱穩定性而言，缺失在SEQID No.1中所示的氨基酸序列(或其相當的缺失)中的至少一種，優選的是兩種或甚至三種下列氨基酸殘基顯得特別合乎需要F180、R181、G182、T183、G184和K185。相應地，分別在SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.7中所示的氨基酸序列中的相應的特別相關的(和相當的)氨基酸殘基是F180、R181、G182、D183、G184和K185(SEQ ID No.2)；F178、R179、G180、I181、G182和K183(SEQ ID No.3)；以及F180、R181、G182、H183、G184和K185(SEQ ID No.7)。
特定的興趣成對(pairwise)缺失如下 R181*+G182*；以及T183*+G184*(SEQ ID No.1)； R181*+G182*；以及D183*+G184*(SEQ ID No.2)； R179*+G180*；以及I181*+G182*(SEQ ID No.3)；和 R181*+G182*；以及H183*+G184″(SEQ ID No.7)。
(或在另一種符合本發明的親本α-淀粉酶的要求的α-淀粉酶中這些成對缺失的相當的缺失)。
其它顯得重要的與熱穩定性有關的突變是在SEQ ID No.2中所示的序列中的P260至I275的氨基酸殘基中的一種或多種取代(或其在本發明的另一個親本α-淀粉酶中的相當的取代)，如在位置269賴氨酸殘基的取代。
與相對于所說的親本α-淀粉酶的α-淀粉酶變體的熱穩定性有關的顯得重要的特異性突變的例子是在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的一種或多種下列取代(或其在本發明的另一個親本α-淀粉酶中的相當的取代)K269R；P260E；R124P；M105F、I、L、V；M208F、W、Y；L2171；V2061、L、F。
對于具有SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶，重要的進一步(相當的)突變是相應的一種或多種下列取代M105F、I、L、V；M208F、W、Y；L2171；V2061、L、F；K269R。
對于具有SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶，重要的進一步(相當的)突變是相應的一種或兩種下列取代M206F、W、Y；L2151。
對于具有SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶，重要的進一步(相當的)突變是相應的一種或多種下列取代M105F、I、L、V；M208F、W、Y；L2171；K269R。
顯得重要的(特別是與所說的親本α-淀粉酶相比達到增加的熱穩定性α-淀粉酶變體)突變的另一個例子是在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQID No.7中所示的氨基酸序列中的一種或多種下列取代(或其在本發明的另一個親本α-淀粉酶中的相當的取代)A354C+V479C；L351C+M430C；N457D，E+K385R；L355D，E+M430R，K；L355D，E+I411R，K；N457D，E。
Ca2+依賴性就達到α-淀粉酶變體相對于其親本α-淀粉酶降低的Ca2+依賴性[即就獲得一種變體而言，該變體在低濃度的鈣離子存在下在體外的而非對親本酶必須的介質中表現出令人滿意的淀粉分解活性，因此，該變體，例如，比親本對排除鈣離子的條件(如在包含鈣絡合劑(如某些增強去垢劑去污能力的物質)的介質中獲得的條件)的敏感性低]而言，在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中摻合一種或多種下列取代顯得尤其合乎需要(或在本發明的另一個親本α-淀粉酶中的相當的取代)Y243F、K108R、K179R、K239R、K242R、K269R、D163N、D188N、D192N、D199N、D205N、D207N、D209N、E190Q、E194Q和N106D。
在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的情況下，合乎需要的取代相應地(相當地)表現為下列的一種或多種K107R、K177R、K237R、K240R、D162N、D186N、D190N、D197N、D203N、D205N、D207N、E188Q和E192Q。
另外，上述的N殘基用D殘基以及Q殘基用E殘基取代，其它在降低的Ca2+依賴性中的有關的取代是所說的D和/或E殘基用任何其它的氨基酸殘基取代。
在達到降低的Ca2+依賴性中顯得重要的其它取代是存在于下列位置的氨基酸殘基的成對取代在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的位置151和113以及位置430和351；以及在SEQ IDNo.3中所示的氨基酸序列的位置150和112以及位置428和349(或在本發明中另一個親本α-淀粉酶中的相當的成對取代)，即下列氨基酸殘基的成對取代 G113+N151(涉及SEQ IDNo.1)；A113+T151(涉及SEQ ID No.2和SEQ IDNo.7)；G112+T150(涉及SEQ ID No.3)；L351+M430(涉及SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.7)；L349+I428(涉及SEQ ID No.3)。
關于達到降低的Ca2+依賴性，這類特定的興趣成對取代如下 G113T+N151I(涉及SEQ ID No.1)；A113T+T1511(涉及SEQ ID No.2和SEQ ID No.7)；G112T+T1501(涉及SEQ ID No.3)；以及 L351C+M430C(涉及SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.7)；L349C+1428C(涉及SEQ ID No.3)。
就Ca2+依賴性的適當取代而言，一些其它取代(這些取代在穩定酶構造中是重要的，而且可以考慮通過，例如，提高鈣離子在淀粉分解酶之內的鈣結合位點之上或之內鈣離子結合或保持的能力，達到這種結果)是在SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中的一種或多種取代(或在本發明中另一個親本α-淀粉酶中的相當的取代)G304W、F、Y、R、I、L、V、Q、N、G305A、S、N、D、Q、E、R、K；H408Q、E。
在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列中的相應的(相當的)取代是G302W、F、Y、R、I、L、V、Q、N；G303A、S、N、D、Q、E、.R、K。
在達到降低的Ca2+依賴性中顯得重要的其它突變是選自下列位置的氨基酸的成對缺失(即兩種氨基酸的缺失)在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中的R181、G182、T183和G184(或在本發明中符合親本α-淀粉酶要求的另一種α-淀粉酶的氨基酸序列中的相當位置)。這樣的成對缺失如下 R181*+G182*；T183*+G184*；R181*+T183；G182*+T183； G182*+G184*；R181*+G184*(SEQ ID No.1)； R181*+G182*；D183*+G184*；R181*+D183*；G182*+D183*； G182*+G184*；R181*+G184*(SEQID No.2)； R179*+G180*；I181*+G182*；R179*+I181*；G180*+I181*； G180*+G182*；R179*+G182*(SEQ ID No.3)； R181*+G182*；H183*+G184*；R181*+H183*；G182*+H183*； G182*+G184*；R181*+G184*(SEQ ID No.7)； (或這些成對缺失在另一種符合本發明的親本α-淀粉酶要求的另一種α-淀粉酶中相當的缺失)。
等電點(pI)初步結果表明α-淀粉酶的洗滌性能，例如，洗衣洗滌性能在洗滌液(洗滌介質)的pH值接近所說的α-淀粉酶的pI值時是最優的。這樣，適合產生具有和介質(如洗滌介質)(在其中使用所說的酶)的pH值更好匹配(與所說的親本α-淀粉酶的等電點相比)的等電點(pI值)的α-淀粉酶變體時是合乎需要的。
關于降低等電點，在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中的優選的突變包括下列取代中的一種或多種Q86E、R124P、S154D、T183D、V222E、P260E、R310A、Q346E、Q391E、N437E、K444Q和R452H。這些降低等電點的取代的適當組合包括Q391E+K444Q；Q391E+K444Q+S154D。
相應地，有關降低等電點的在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的優選的突變包括下列取代中的一種或多種L85E、S153D、I181D、K220E、P258E、R308A、P344E、Q358E和S435E。
就提高等電點而言，在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中的優選的突變包括下列取代中的一種或多種E86Q、L；D154S；D183T、I；E222V、K；E260P；A310R、E346Q、P；E437N、S；和H452R。
在下面的實驗部分中描述了按照本發明的許多變體的構建。
本發明的α-淀粉酶變體，除了具有一種或多種上述的改良的性質之外，優選地是這樣的變體，該變體在低的底物濃度下具有比親本α-淀粉酶更高的淀粉水解速度。另外，本發明的α-淀粉酶變體優選地是這樣的變體，該變體在相同條件下試驗時比親本α-淀粉酶具有更高的Vmax和/或更低的Km。在雜種α-淀粉酶的情況下，用于進行比較的“親本α-淀粉酶”應該是具有最好性能的組份酶。
Vmax和Km(Michaelis-Menten方程的參數)可通過眾所周知的方法測定。
制備α-淀粉酶變體的方法 在本領域中已知幾種用于把突變導入基因的方法。在簡要地討論編碼α-淀粉酶的DNA序列克隆之后，將討論在編碼α-淀粉酶的序列之內的特異性位點產生突變的方法。
克隆編碼α-淀粉酶的DNA序列 使用本領域各種熟知的方法可從產生所說的α-淀粉酶的細胞或微生物中分離編碼α-淀粉酶的DNA序列。第一，使用得自產生所研究的α-淀粉酶的有機體的染色體DNA或信使RNA構建基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，如果α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，就可以合成并使用同源、標記的寡核苷酸探針從所說的有機體制備的基因組文庫中鑒別編碼α-淀粉酶的克隆。另外，包含和已知α-淀粉酶基因同源的序列的標記寡核苷酸探針可用作在較不嚴格的雜交和洗滌條件下鑒別編碼α-淀粉酶的探針。
另一個用于鑒別編碼α-淀粉酶的克隆的方法包括把基因組DNA片段插入到表達載體(如質粒)中以產生的基因組DNA文庫轉化α-淀粉酶陰性細菌，然后把轉化的細菌平板接種到包含α-淀粉酶底物的瓊脂上，由此使得可以鑒別表達α-淀粉酶的克隆。
另外，編碼酶的DNA序列可以通過已知的標準方法合成制備，例如，由Beaucage和M.H.Caruthers(1981)描述的phosphoamidite方法或Mats等(1984)描述的方法。在phosphoamidite方法中，寡核苷酸，例如，在一臺機用DNA合成儀上在適當的載體中合成、純化、退火、連接和克隆。
最后，DNA序列可以是混合的基因組和合成的起源，混合的合成和cDNA起源或混合的基因組和cDNA起源，可按照標準技術通過連接合成的、基因組的或cDNA起源制備(作為適當的，對應于整個DNA序列不同部分的片段)。DNA序列也可以使用特異性的引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)制備，例如在美國4,683,202中或R.K.Saiki等(1988)描述的方法。
定點誘變 一旦分離到編碼α-淀粉酶的DNA序列以及鑒別到所需的突變位點后，就可以使用合成的寡核苷酸導入突變。這些寡核苷酸包含在所需的突變位點側翼的核苷酸序列；在寡核苷酸合成期間插入突變體核苷酸。在特異性的方法中，在攜帶α-淀粉酶基因的載體中產生橋連接編碼α-淀粉酶的序列的DNA單鏈間隙。然后，使攜帶所需突變的合成核苷酸退火形成單鏈DNA的同源部分。以DNA聚合酶I(Klenow片段)填充剩余的間隙，然后使用T4連接酶連接構建體。由Morinaga等(1984)在美國4,760,025描述的特異性方法公開了通過進行盒的微小改變而導入編碼多突變的的寡核苷酸。然而，通過Morinaga的方法在任何一次都可以導入很多的突變，因為可以導入很多各種長度的寡核苷酸。
Nelson和Long(1989)描述了另一種把突變導入編碼α-淀粉酶的DNA序列的方法。它包括包含所需的突變(通過使用化學合成的DNA鏈作為PCR反應中的引物之一導入)的PCR片段的3步生成。可以通過用限制性核酸內切酶裂解從PCR生成的片段中分離攜帶突變的DNA片段，然后再插入到表達質粒中。
隨機誘變 隨機誘變適合在翻譯成所說的氨基酸序列的基因中的至少三個部分或在整個基因之內以定位或區域特異性隨機誘變進行。
對于以提高熱穩定性為目的的區域特異性隨機誘變，具體來說，下列的密碼子位置可適當地作為目標(使用單字母氨基酸縮寫，數字指在所說的序列中氨基酸殘基的編號) 在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中 120-140＝VEVNRSNRNQETSGEYAI EAW 178-187＝YKFRGTGKAW 264-277＝VAEFWKNDLGAIEN 在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中 120-140＝VEVNPNNRNQEISGDYTIEAW 178-187＝YKFRGDGKAW 264-277＝VAEFVVKNDLGALEN 在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列中 119-139＝VEVNPSDRNQEISGTYQIQAW 176-185＝YKFRGIGKAW 262-275＝VGEMVSYDINKLHN 在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中 120-140＝VEVNPNNRNQEVTTGEYTIEAW 178-187＝YKFRGHGKAW 264-277＝VAEFWKNDLGAIEN 以達到降低的Ca2+依賴性為目的時，具體來說，下列密碼子位置可適當地作為目標 在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中 178-209＝YKFRGTGKAWDWEVDIENGNYDYLMYADVDMD 237-246＝AVKHIKYSFT 在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中 178-209＝YKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYA DVDMD 237-246＝AVKHIKYSFT 在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中 178-209＝YKFRGHGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADI DMD 237-246＝AVKHIKYSFT 以達到α＝淀粉酶變體增加的底物結合力(即增加的碳水化物類-如直鏈淀粉或支鏈淀粉這些α-淀粉分解酶的底物的結合力)、改良的(例如，更高的)底物特異性和/或改良的(例如，更高的)對底物裂解(水解)的特異性為目的時，在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的下列密碼子位置(或在本發明中另一個親本α-淀粉酶的相當的密碼子位置)顯得尤其適合作為目標 在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中 15-20＝WYLPND 52-58＝SQNDVGY 72-78＝KGTVRTK 104-111＝VMNHKGGA 165-174＝TDWDQSRQLQ 194-204＝ENGNYDYLMYA 234-240＝RIDAVKH 332-340＝HDSQPGEAL 編碼親本α-淀粉酶的DNA序列的隨機誘變可按照下列步驟進行a)本發明的上述方法可以使用本領域任何已知的方法方便地進行。例如，可以通過使用適當的物理或化學誘變劑、使用適當的寡核苷酸或使DNA序列經受PCR產生的誘變進行隨機誘變。而且，可以通過使用這些誘變劑的任何組合進行隨機誘變。
誘變劑可以是一種，例如，誘導轉換、顛換、倒位、混雜(scrambling)、缺失和/或插入的誘變劑。
適于目前使用的物理或化學誘變劑的例子包括紫外(UV)照射、羥胺、N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、磺基乙基甲烷、雙亞硫酸鈉、甲酸以及核苷酸類似物。
當使用這樣的試劑時，誘變典型地通過在選擇的誘變劑存在時，于適合誘變產生的條件下，培養需誘變的編碼親本酶的DNA序列并選擇具有所需性質的突變DNA進行。
當誘變通過使用寡核苷酸進行時，在寡核苷酸合成期間，在要改變的位置寡核苷酸可以以三非親本的核苷酸摻入或摻加。進行摻入或摻加以避免不合需要的氨基酸的密碼子。摻入或摻加的寡核苷酸可以通過已發表的技術使用，例如，PCR、LCR或任何DNA聚合酶和連接酶摻入到編碼淀粉分解酶的DNA中。
使用PCR產生的誘變時，在增加核苷酸的錯摻的條件下使化學處理的或非處理的編碼親本α-淀粉酶的基因經受PCR(Deshler，1992；Leung等，技術，第1卷，1989，11-15)。
大腸桿菌(Foeler等，分子基因遺傳學，133，1974，179-191)、釀酒酵母或任何其它微生物的增變菌株(可通過，例如，把包含親本酶的質粒轉化進增變菌株，培養增變菌株和質粒并從增變菌株中分離突變的質粒)用于編碼淀粉分解酶的DNA的隨機誘變。其后，突變的質粒可以轉化進表達有機體。
要誘變的DNA序列可以方便地存在于從表達親本淀粉分解酶的有機體中制備的基因組或cDNA文庫中。另外，DNA序列可以存在于合適的載體如質粒或噬菌體中，這些載體可以和誘變劑培養或接觸誘變劑。需誘變的DNA也可以通過整合進所說的細胞的基因組或存在于含有載體的細胞中而存在于宿主細胞中。最后，需誘變的DNA可以以隔離形式存在。可以理解，要經受隨機誘變的DNA序列優選地是cDNA或基因組DNA序列。
在某些情況下，在要進行的表達步驟(b)或篩選步驟(c)之前可以方便地擴增突變的DNA序列。這種擴增可以按照本領域已知的方法進行，目前優選的方法是使用在親本酶的DNA或氨基酸序列的基礎上制備的寡核苷酸引物進行PCR產生的擴增。
在和誘變劑培養或接觸誘變劑之后，突變的DNA通過使得可以產生表達的條件下培養攜帶DNA序列的適當宿主細胞表達。用于這個目的的宿主細胞可以是用在或不在載體中的突變的DNA序列轉化的細胞，或在誘變處理期間攜帶編碼親本酶的DNA序列的細胞。適合的宿主細胞的例子如下革蘭氏陽性細菌如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、液解化淀粉桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；以及革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌。
突變的DNA序列還包括編碼允許突變DNA序列表達的功能的DNA序列。
定位隨機誘變隨機誘變較好地是定位在所說的親本α-淀粉酶的一部分。這在，例如，當鑒別出酶的某些區域對于酶的給定性質特別重要以及當期望改良可產生具有改良性質的變體時可能是有用的。當對親本酶的三級結構闡明并與酶的功能有關時，通常可以鑒別這樣的區域。
通過使用上述的PCR產生的誘變技術或任何其它在本領域中已知的合適技術可以方便地進行定位隨機誘變。
另外，可以通過，例如，插入到合適的載體中以分離編碼要改良的DNA序列部分的DNA序列，其后，所說的部分通過使用上述的任何誘變方法經受誘變。
關于在本發明的上述的方法中的篩選步驟，可以使用通過基于下列原理的濾膜測定方便地進行 能表達突變的興趣淀粉分解酶的微生物在適于酶分泌的條件下在適當的培養基上培養，培養基具有包括第一層結合蛋白質的濾膜和其上表現出低的蛋白質結合能力的第二層濾膜的雙層濾膜。微生物位于第二層濾膜上。爾后進行培養時，把包含微生物分泌的酶的第一層濾膜從包含微生物的第二層濾膜上分離下來。第一層濾膜進行所需的淀粉分解活性篩選，同時鑒別存在于第二層濾膜上的相應微生物菌落。
用于結合酶促活性的濾膜可以是任何結合蛋白質的濾膜，例如，尼龍或硝化纖維膜。攜帶表達有機體的菌落的上層濾膜可以是對結合蛋白質沒有親和性或親和性低的任何濾膜，例如，乙酸纖維素或Durapore。濾膜可用用于篩選的任何條件預處理或在酶促活性檢測期間處理。
酶促活性可以通過染色、熒光、沉淀、pH指示劑、IR-吸收率或任何其它已知的用于檢測酶促活性的技術。
檢測化合物可以通過任何固定劑固定，例如，瓊脂糖、瓊脂、明膠、聚丙烯酰胺、淀粉、濾紙、布；或固定劑的任何組合。
α-淀粉酶活性可通過在瓊脂糖上固定的Cibacron Red標記的支鏈淀粉檢測。為了篩選具有增加的熱和高pH值穩定性的變體，結合有α-淀粉酶變體的濾膜在pH為10.5以及60℃或65℃下的緩沖液中培養指定的時間，在去離子水中簡短漂洗并置于支鏈淀粉-瓊脂糖基質上進行活性檢測。剩余的活性通過支鏈淀粉降解的Cibacron Red的裂解可以看出來。選擇這樣的條件是因為具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的活性幾乎不能檢測出來。由于Cibacron Red的釋放增加，穩定變體在相同的條件下表現出較高的顏色強度。
為了篩選在更低的溫度下和/或更寬的溫度范圍內活性最優的變體，把結合有變體的濾膜直接放置在支鏈淀粉-Cibacron Red的底物平板上并在所需的溫度下(例如，4℃，10℃或30℃)溫育指定的時間。在這個時間之后由于具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的活性幾乎不能檢測出來，而在更低的溫度下有最優活性的變體顯示出提高了支鏈淀粉的裂解。為了篩選所說的變體對添加劑改變的依賴性或反應性，在支鏈淀粉基質上培養之前可以在各種所需的培養基-例如，包含Ca2+、除垢劑、EDTA或其它有關添加劑的溶液-中培養。
制備雜種α-淀粉酶的方法 作為點特異性誘變的替代性方法，可以通過結合所說的各個的基因的有關部分制備是至少兩種成分α-淀粉酶的雜種的α-淀粉酶變體。
天然產生的酶可通過上述的隨機或定點誘變遺傳改良。另外，一種酶的一部分可以已被另一種的一部分取代以獲得嵌合酶。這種取代可以通過常規的離體基因剪接技術或體內重組或兩種技術的組合達到。使用常規的離體基因剪接技術時，編碼序列的α-淀粉酶基因的所需部分使用適當的位點特異性限制酶缺失；然后編碼序列缺失的部分可以通過編碼序列的不同α-淀粉酶的所需部分的插入取代，這樣就產生了編碼新的α-淀粉酶的嵌合核苷酸序列。另外，可以通過，例如，使用由Higuchi等(1988)描述的PCR重疊延伸方法融合α-淀粉酶基因。
體內重組技術取決于下列事實具有高度同源區(DNA序列相同)的不同DNA片斷可以重組，即切斷和交換DNA，然后在同源區建立新鍵。因此，當兩種不同但同源的淀粉酶的編碼序列用于轉化宿主細胞時，在體內同源序列的重組就導致嵌合基因序列的產生。這些編碼序列通過宿主細胞的翻譯將導致嵌合淀粉酶基因產物的產生。特異性體內重組技術在美國5,093,257和EP 252 666中描述。
另外，可以通過本領域已知的標準化學方法合成雜種酶。例如，參見Hunkapiller等(1984)。因此，具有適當的氨基酸序列的肽可全部或部分合成并連接以形成本發明的雜種酶(變體)。
α-淀粉酶變體的表達 按照本發明，通過上述方法或本領域已知的替代方法產生的編碼突變的α-淀粉酶的DNA序列可以使用表達載體以酶的形式表達，該表達載體典型地包括編碼啟動子、操縱子、核蛋白體結合位點、翻譯起始信號的控制序列以及可有可無的阻遏物基因或各種激活基因。
攜帶編碼本發明的α-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是任何可方便地經受重組DNA過程的載體，載體的選擇常取決于它要導入的宿主細胞。這樣，載體可以是自主復制載體(即作為染色體外實體存在的載體，它的復制獨立于染色體的復制)，例如，質粒、噬菌體或染色體外成分、微型染色體或人工染色體。另外，載體可以是當導入宿主細胞整合進宿主細胞基因組并與它所整合的染色體一道復制的載體。
在載體中，DNA序列應可操作地連接到合適的啟動子序列上。啟動子可以是任何在選擇的宿主細胞中所示出轉錄活性并衍生自編碼對宿主細胞來說是同源的或異源的蛋白質的基因的DNA序列。指導編碼本發明的α-淀粉酶變體的DNA序列的轉錄的適合的啟動子的例子(具體來說是在細菌宿主中)是大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子、天藍色鏈霉菌瓊脂酶基因的dagA啟動子、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動子(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽淀粉酶基因的啟動子(amyM)、液解化淀粉桿菌的α-淀粉酶的啟動子(amyQ)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子等。對于真菌宿主中的轉錄，有用的啟動子的例子是那些衍生自編碼下列酶的基因的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定的α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構酶或構巢曲霉乙酰胺酶。
本發明的表達載體也可以包含適當的轉錄終止子，在真核生物中還包含可操作地連接到編碼本發明的α-淀粉酶變體的DNA序列上的聚腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列可以適當地從與啟動子相同的來源衍生。
載體還可以包括使載體在所說的宿主細胞中復制的DNA序列。這樣的序列的例子是質粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和p1J702的復制起點。
載體也可以包含可選擇的標記，例如，其產物補充了宿主細胞中的缺陷的基因，如來從枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的da1基因或攜帶抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性的基因。進而，載體可包括曲霉屬的選擇性標記如amdS、argB、niaD和引起潮霉素抗性的標記sC，選擇也可以通過，例如，在WO 91/17243中描述的共轉化完成。
在某些方面胞內表達有優勢，例如，當使用某些細菌作為宿主細胞時，通常優選的表達是胞外表達。
適于構建本發明的編碼α-淀粉酶變體并分別包含啟動子、終止子以及其它成分的載體的方法是本領域技術人員熟知的[參見，例如，Sambrook等(1989)]。
包含上述本發明的DNA構建體或的表達載體的本發明的細胞在本發明α-淀粉酶變體的重組產生中用作宿主細胞是有優勢的。細胞可以方便地通過把DNA構建體(一個或多個拷貝)整合進宿主染色體中以用本發明的編碼變體的DNA構建體轉化。通常由于DNA序列在細胞中更可能穩定保持，這種整合已被認為是一個優點。DNA構建體整合進宿主染色體可按照常規方法(例如，通過同源或異源重組)進行。另外，細胞在可以用上述與不同類型的宿主細胞聯系的表達載體轉化。
本發明的細胞可以是高等有機體的細胞，如哺乳動物或昆蟲的細胞，但是優選的是微生物細胞，例如，細菌或真菌(包括酵母)細胞。
合適的細菌的例子如下革蘭氏陽性細菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、液解化淀粉桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；以及革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌。細菌的轉化可以通過，例如，原生質體的轉化或本以本來已知的方式使用感受態細胞完成。
酵母有機體優選的選自酵母屬或裂殖酵母屬的物種，例如，釀酒酵母。絲狀真菌優選地屬于曲霉屬的物種，例如，米曲霉或黑曲霉。真菌細胞轉化方法包括按本來已知的方式形成原生質體以及細胞壁再生后轉化原生質體。用于曲霉屬宿主細胞轉化的適當方法在EP 238 023中描述。
在另一個方面，本發明涉及產生本發明的α-淀粉酶變體的方法，該方法包括如上所述的在有利于變體產生的條件下培養宿主細胞以及從細胞和/或培養基中回收變體。
用于培養細胞的培養基可以是任何適于培養所說的宿主細胞并獲得本發明的α-淀粉酶變體表達的常規培養基。合適培養基可從商業供應者得到，或按照已發表的處方制備(例如，在美國典型培養物收集中心的目錄中所描述的)。
分泌自宿主細胞的α-淀粉酶變體可通過眾所周知的方法方便地從培養基中回收，該方法包括通過離心或過濾從培養基中分離細胞，通過鹽(如硫酸銨)的方式然后再使用色譜法(如離子交換色譜、親和色譜法等等)沉淀培養基中的蛋白質組分。
工業應用 由于在堿性pH值下本發明的α-淀粉酶變體的活性，它們特別適合在各種工業加工中使用。具體來說，在洗滌、餐具洗滌和硬表面清潔去垢組合物(見下)中它們都有潛在的應用，但是在從淀粉中產生增甜劑和乙醇也是有用的。常規淀粉轉化加工和液化和/或糖化加工的條件在，例如，美國3,912,590、EP 252,730和EP 63,909中描述。
本發明的α-淀粉酶變體的應用的某些領域概述如下。
有關紙的應用本發明的α-淀粉酶變體具有從淀粉加固(starch-reinforced)的廢紙和廢紙板產生木素纖維素材料(如紙漿、紙和紙板)的有價值的性質，尤其是重新紙漿化發生在pH值高于7的地方以及淀粉酶通過加固淀粉的降解有利于廢材料分解的地方。本發明的α-淀粉酶變體特別適于從淀粉包衣的或包含淀粉的廢印刷紙造紙的脫墨/再利用加工。為了產生高亮度的新紙，除去印刷墨通常是合乎需要的；本發明的變體如何以這種方法使用的例子在PCT/DK94/00437中描述。
本發明的α-淀粉酶變體在改良淀粉中也是十分有用的，酶促改良的淀粉用于和堿性填料(如碳酸鈣、高嶺土和粘土)一起造紙。對于本發明的堿性α-淀粉酶變體，在填料存在下改良淀粉是切實可行的，這樣就使得可以進行更簡單、更完整的加工。
紡織品去漿(desizing)本發明的變體也特別適于紡織品去漿。在紡織品加工工業中，在去漿加工中傳統地使用α-淀粉酶作為助劑來促進除去包含淀粉的漿糊(size)，這種漿糊在紡織期間作為對織物紗的保護性包衣。
在紡織后完全除去漿糊對于確保在隨后加工中的最優效果是重要的，其中對所說的織物進行洗滌、漂白和染色。酶促淀粉降解是優選的，因為它不損害紡織品或織物的纖維。
為了減少加工成本并增加制造廠的生產量，去漿處理有時與洗滌和漂白步驟結合使用。在這種情況下，非酶促助劑(如堿或氧化劑)典型地用于分解淀粉，因為傳統的α-淀粉酶不是十分與高pH水平和漂白劑相容。淀粉漿糊的非酶促分解由于所使用的相當攻擊性的(aggressive)化學藥品確實導致了一些纖維的破壞。
本發明的在較高的pH水平并有氧化(漂白)劑存在下顯示出增加的淀粉降解性能的α-淀粉酶變體特別適合用于上述的去漿加工，尤其是適于代替當前使用的非酶促去漿劑。α-淀粉酶變體可單獨使用或在去漿包含纖維素的織物或紡織品時與纖維素酶結合使用。
啤酒生產本發明的α-淀粉酶變體在啤酒釀造過程中也已被認為是非常有用的；在這個過程中，典型地是在搗碎處理時添加變體。
在用于洗滌或餐具洗滌的去垢劑添加劑和去垢組合物中的應用由于改良的洗滌和/或餐具洗滌性能常是上述性質改良的結果，本發明的許多α-淀粉酶變體(包括雜種)尤其適于摻入去垢組合物，例如，有意在pH值7-13的范圍中，具體來說是pH值8-11的范圍內使用的去垢組合物。按照本發明，α-淀粉酶變體可作為去垢組合物的組分添加。這樣，它可以以去垢劑添加劑的形式包括在去垢組合物中。
這樣，本發明的另一個方面涉及包含按照本發明的α-淀粉酶變體的去垢劑添加劑。酶可以通過添加包含一種或多種酶的分離添加劑或添加包含所有這些酶的組合添加劑包括在去垢組合物中。本發明的去垢劑添加劑(即一種分離的添加劑或組合的添加劑)可以制成例如，粒狀、液體、結晶等。去垢劑添加劑的優選的酶制劑是粒劑(具體來說是非粉狀粒劑)、液體(具體來說是穩定的液體)結晶或保護酶(見下)。
去垢組合物以及去垢劑添加劑還可以包含一種或多種通常在除垢劑中使用的其它酶，如蛋白酶、脂酶、淀粉分解酶、氧化酶(包括過氧物酶)或纖維素酶。
已經發現當α-淀粉酶與另一種淀粉分解酶(如支鏈淀粉酶、異構淀粉酶、β淀粉酶、淀粉糖甙酶以及CTG酶)結合時可以在洗滌和/或餐具洗滌性能中獲得實質上的改進。適于給定目的的市售淀粉分解酶的例子是AMG、Novamyl和Promozyme，它們都可從Novo Nordisk A/S、Bagsvaerd、Demark得到。因此，本發明的一個特定實施方案涉及包含本發明的α-淀粉酶變體與至少一種其它的淀粉分解酶(例如，在上述的那些酶中選擇)結合的去垢劑添加劑。
非粉狀粒劑可以如，例如在美國4,106,991和美國4,661,452中公開的方法產生，可有可無地通過本領域已知的方法包衣；有關包衣的細節如下所述。當不同的去垢劑酶的組合使用時，酶可以在成為粒狀之前或之后混合。
液態酶制劑可按照已知的技術通過，例如，添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸使其穩定。其它酶穩定劑在本領域中是已知的。保護酶可按照EP 238 216中公開的方法制備。
如上所述，本發明的另一個方面涉及去垢組合物(例如，用于洗衣洗滌、餐具洗滌或硬表面清潔)，該組合物包含本發明的α-淀粉酶變體(包括雜種)以及表面活化劑。
本發明的去垢組合物可以是任何方便的劑型，例如，粉劑，粒劑或液體。液態的去垢劑可以是含水的(典型地包含多達90％的水或0-20％的有機溶劑)或是不含水的(如在EP 120,659中所描述的去垢劑)。
去垢組合物 當本發明的α-淀粉酶變體用作去垢組合物(例如，洗衣洗滌去垢組合物或餐具洗滌去垢組合物)的組分時，它可以，例如，以非粉狀粒劑、穩定液體或受保護酶的形式包括在去垢組合物中。如上所述，非粉狀粒劑可如，例如，美國4,661,452和4,106,991(兩者都屬于Novo Industri A/S)公開的方法產生，并可有可無地用本領域已知的方法包衣。蠟已被材料的例子是多個(乙烯氧化物)的產物(聚乙二醇，PEG)，平均分子量為1000至20000；具有16至50個乙烯氧化物單位的乙氧基化的nonylphenols；乙氧基化的脂醇(其中醇包含12至20碳原子)，其中具有15至80個乙烯氧化物單位；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的和甘油單、雙、三酯。適于通過液化床技術應用的膜形成包衣材料在GB 1483591中給出。
以液態酶制劑形式添加的酶可以如上所述，按照已知的技術通過，例如，添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸穩定。其它酶穩定劑在本領域中是眾所周知的。
用于本發明的去垢組合物中的內含物的受保護酶可以如上所述按照在EP 238,216中公開的方法制備。
本發明的去垢組合物可以是任何方便的劑型，例如，粉劑、粒劑、糊劑或液體。液態的去垢劑可以是含水的(典型地包含多達70％的水或0-30％的有機溶劑)或是不含水的。
去垢組合物包含一種或多種表面活化劑，每種可以是陰離子的、非離子的、陽離子的或兩性的(兩性離子的)。去垢劑通常包含0-50％的陰離子表面活化劑如線性烷基苯磺酸鹽(LAS)、α-烯烴磺酸鹽(AOS)、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、醇乙氧基硫酸鹽(AEOS)或次生烷烴磺酸鹽(SAS)、α-硫代脂肪酸甲基酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。它也可以包含0-40％的非離子表面活化劑如乙氧基化醇(AEO或AE)、丙氧基化醇、羧基化乙氧基化醇，乙氧基化壬基酚、烷基聚糖甙、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺或聚羥基烷基脂肪酰胺(例如，在WO 92/06154中所描述的)。
去垢組合物還包含一種或多種其它酶，如支鏈淀粉酶、酯酶、脂酶、角質酶、蛋白酶、纖維素酶、過氧物酶或氧化酶，例如，漆酶。
通常去垢劑包含1-65％增強去垢劑去垢作用的物質(雖然某些餐具洗滌去垢劑可包含多達90％的增強去垢劑去垢作用的物質)或絡合物劑如沸石、二磷酸、鳥苷三磷酸、膦酸酯、檸檬酸、次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或層硅酸鹽(例如，得自Hoechst的SKS-6)。
增強去垢劑去垢作用的物質可細分為含磷或不含磷類型。含磷的無機堿性增強去垢劑去垢作用的物質例子包括水溶性鹽，具體來說是堿金屬焦磷酸鹽、無機正磷酸鹽、多磷酸和膦酸。不含磷的無機的增強去垢劑去垢作用的物質的例子包括水溶性堿金屬碳酸鹽、硼酸鹽和硅酸鹽，以及層重硅酸鹽和各種類型的水不溶性結晶或無定形的氧化鋁硅酸鹽，其中沸石是最熟知的代表。
合適的有機的增強去垢劑去垢作用的物質的例子包括琥珀酸、丙二酸、脂肪酸的丙二酸、脂肪酸磺酸鹽、羧基甲氧基琥珀酸、聚醋酸鹽、羧酸鹽、聚羧酸鹽、氨基聚羧酸鹽和聚乙酰基羧酸鹽的堿金屬、銨或取代的銨鹽。
去垢劑也可以根本無增強去垢劑去垢作用的物質。
去垢劑可以包括種一種或多種聚合物。例子是羧甲基纖維素(CSC；典型地以鈉鹽形式)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸鹽如聚丙烯酸酯、聚馬來酸鹽、馬來酸/丙烯酸的共聚物以及月桂基異丁烯酸丙烯酸共聚物。
去垢組合物也可以包含氯/溴型或氧型的漂白劑。漂白劑可以是包衣的或膠囊化的。無機氯/溴型的漂白劑的例子是鋰、鈉或鈣的次氯酸鹽或次溴酸鹽以及氯化三鈉磷酸鹽。漂白系統也可以包含H2O2源如過硼酸鹽或過碳酸鹽，它們可以與過酸形式的漂白激活劑如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰羥苯磺酸鹽(NOBS)。
有機氯/溴型漂白劑的例子是N-溴化和N-氯化亞胺如三氯雷尿酸、三溴雷尿酸、二溴雷尿酸、二氯雷尿酸及其與水溶性陽離子如鉀和鈉的鹽。乙內酰脲化合物也是合適的。漂白系統也可以包含，例如，酰胺、亞胺或砜型過酸酸(peroxyacids)。
在餐具洗滌去垢劑中，氧漂白劑是優選的，例如無機過鹽形式，優選地是帶有漂白劑或作為過酸酸化合物。適合的過氧漂白劑化合物的典型例子是堿金屬過硼酸鹽、四氫鹽和單氫鹽、堿金屬過碳酸鹽、過硅酸鹽和過磷酸鹽。優選的激活劑材料是TAED或NOBS。
本發明的去垢組合物的酶可以使用常規的穩定劑穩定，例如，多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如，例如，芳族硼酸酯以及如在WO 92/19709和WO 92/19708中所述的方法配制成的組合物。本發明的酶也通過添加可逆的酶抑制因子穩定，例如，蛋白質型(如在EP 0544 777 B1中所描述的)或硼酸型酶抑制因子。
去垢劑也可以包含其它的常規去垢劑成分如，例如，織物調節物(fabricconditioners)包括粘土、抗絮凝劑物質、泡沫激發劑/泡沫壓制劑(在餐具洗滌去垢劑泡沫壓制劑中)、起泡肥皂水的泡沫壓制劑、抗腐蝕劑、污物懸浮劑、抗污物再沉積劑、染色、脫水劑、殺菌劑、光學增白劑、或香料。
pH值(在水溶液中以使用時的濃度測量)通常是中性或堿性，例如，在7-11之間。
本發明的范圍之內的洗衣去垢組合物的特定的形式包括 1)配制成具有至少600g/l的大密度的粒劑的去垢組合物，其包含線性烷基苯基磺酸鹽(以酸計算)7-12％乙氧基硫酸醇(例如，C12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸鹽(例如C14-15醇，7EO)1-4％乙氧基化醇(例如，C14-15醇，7EO)5-9％碳酸鈉(作為Na2CO3)14-20％可溶性硅酸鹽(作為Na2O，2SiO4)2-6％沸石(作為NaAlSiO4)15-22％硫酸鈉(作為Na2SO4)0-6％檸檬酸鈉/檸檬酸(作為的(C6H5Na3O7/C6H8O7)0-15％過硼酸鈉(作為NaBO3.H2O)11-18％TAED2-6％羧甲基纖維素0-2％聚合物(例如，馬來酸/丙烯酸共聚物，0-3％PVP，PEG) 酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％ 次要的組成部分(例如，起泡肥皂水的泡沫抑 制劑、香料、光學增白劑、光漂白劑)0-5％ 2)配制成具有至少600g/l的大密度的粒劑的去垢組合物，其包含線性烷基苯基磺酸鹽(以酸計算)6-11％乙氧基硫酸醇(例如，C12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸鹽(例如C16-18)1-3％乙氧基化醇(例如，C14-15醇，7EO)5-9％碳酸鈉(作為Na2CO3)15-21％可溶性硅酸鹽(作為Na2O，2SiO4)1-4％沸石(作為NaAlSiO4)24-34％硫酸鈉(作為Na2SO4)4-10％檸檬酸鈉/檸檬酸(作為的(C6H5Na3O7/C6H8O7)0-15％羧甲基纖維素0-2％聚合物(例如，馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)1-6％酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％次要的組成部分(例如，起泡肥皂水的泡沫抑制劑、香料、光學增白劑、光漂白劑)0-5％ 3)配制成具有至少600g/l的大密度的粒劑的去垢組合物，其包含線性烷基苯基磺酸鹽(以酸計算)5-9％乙氧基硫酸醇(例如，C12-15醇，7EO)7-14％脂肪酸肥皂(例如，C12-15醇，7EO)1-3％碳酸鈉(作為Na2CO3)10-17％可溶性硅酸鹽(作為Na2O，2SiO4)3-9％沸石(作為NaAlSiO4)23-33％硫酸鈉(作為Na2SO4)0-4％ 過硼酸鈉(作為NaBO3.H2O)8-16％ TAED2-8％ 膦酸酯(例如，EDTMPA)0-1％ 羧甲基纖維素0-2％ 聚合物(例如，馬來酸/丙烯酸共聚物， PVP，PEG)0-3％ 酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％ 次要的組成部分(例如，起泡肥皂水的泡沫抑 制劑、香料、光學增白劑、光漂白劑)0-5％ 4)制配制成具有至少600g/l的大密度的粒劑的去垢組合物，其包含 線性烷基苯基磺酸鹽(以酸計算)8-12％ 乙氧基硫酸醇(例如，C12-15醇，7EO)10-25％ 碳酸鈉(作為Na2CO3)14-22％ 可溶性硅酸鹽(作為Na2O，2SiO4)1-5％ 沸石(作為NaAlSiO4)25-35％ 硫酸鈉(作為Na2SO4)0-10％ 羧甲基纖維素0-2％ 聚合物(例如，馬來酸/丙烯酸共聚物， PVP，PEG)1-3％ 酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％ 次要的組成部分(例如，起泡肥皂水的泡沫抑 制劑、香料、光學增白劑、光漂白劑)0-5％ 5)含水的液態去垢組合物，其包含線性烷基苯基磺酸鹽(以酸計算)15-21％乙氧基硫酸醇(例如，C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)12-18％脂肪酸肥皂(例如，油酸)3-13％ 烯基琥珀酸(C12-14)0-13％ 氨基乙醇8-18％ 檸檬酸2-8％ 膦酸酯0-3％ 聚合物(例如，PVP，PEG)0-3％ 硼酸鹽(作為B4O72-)0-2％ 乙醇0-3％ 丙二醇8-14％ 酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％ 次要的組成部分(例如，分散劑、起泡肥皂水 的泡沫抑制劑、香料、光學增白劑)0-5％ 6)含水的有結構的(structured)液態去垢組合物，其包含線性烷基苯基磺酸鹽(以酸計算)15-21％乙氧基硫酸醇(例如，C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)3-9％脂肪酸肥皂(例如，油酸)3-10％沸石(作為NaAlSiO4)14-22％檸檬酸鉀9-18％硼酸鹽(作為B4O72-)0-2％羧甲基纖維素0-2％聚合物(例如，PVP，PEG)0-3％錨定聚合物如，例如月桂基異丁烯酸/丙烯酸共聚物；分子比率25∶1；分子量38000-3％甘油0-5％酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％次要的組成部分(例如，分散劑、起泡肥皂水的泡沫抑制劑、香料、光學增白劑)0-5％ 7)配制成具有至少600g/l的大密度的粒劑的去垢組合物，其包含脂肪醇硫酸鹽5-10％乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺3-9％脂肪酸肥皂0-3％碳酸鈉(作為Na2CO3)5-10％可溶性硅酸鹽(作為Na2O，2SiO4)1-4％沸石(作為NaAlSiO4)20-40％硫酸鈉(作為Na2SO4)2-8％過硼酸鈉(作為NaBO3.H2O)12-18％TAED2-7％聚合物(例如，馬來酸/丙烯酸共聚物，PEG)1-5％酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％次要的組成部分(例如，光學增白劑、起泡肥皂水的泡沫抑制劑、香料)0-5％ 8)配制成粒劑的去垢組合物，其包含線性烷基苯基磺酸鹽(以酸計算)8-14％乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺5-11％脂肪酸肥皂0-3％碳酸鈉(作為Na2CO3)4-10％可溶性硅酸鹽(作為Na2O，2SiO4)1-4％沸石(作為NaAlSiO4)30-50％硫酸鈉(作為Na2SO4)3-11％檸檬酸鈉(作為C6H5Na3O7)5-12％聚合物(例如，PVP，馬來酸/丙烯酸共聚物，PEG)1-5％酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％次要的組成部分(例如，起泡肥皂水的泡沫抑0-5％ 制劑、香料) 9)配制成粒劑的去垢組合物，其包含線性烷基苯基磺酸鹽(以酸計算)6-12％非離子表面活化劑1-4％脂肪酸肥皂2-6％碳酸鈉(作為Na2CO3)14-22％沸石(作為NaAlSiO4)18-32％硫酸鈉(作為Na2SO4)5-20％檸檬酸鈉(作為C6H5Na3O7)3-8％過硼酸鈉(作為NABO3.H2O)4-9％漂白活化劑(如NOBS或TAED)1-5％羧甲基纖維素0-2％聚合物(例如，聚羧酸鹽或PEG)1-5％酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％次要的組成部分(例如，光學增白劑、香料)0-5％ 10)含水的液態去垢組合物，其包含 線性烷基苯基磺酸鹽(以酸計算)15-23％ 乙氧基硫酸醇(例如，C12-15醇，2-3EO)8-15％ 乙氧基化醇(例如，C12-15醇，7EO或C12-15醇， 5EO)3-9％ 脂肪酸肥皂(例如，月桂酸)0-3％ 氫基乙醇1-5％ 檸檬酸鈉5-10％ 水溶助劑(例如，亞芐基磺酸鈉)2-6％ 硼酸鹽(作為B4O72-)0-2％ 羧甲基纖維素0-1％ 乙醇1-3％丙二醇2-5％酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％次要的組成部分(例如，聚合物、分散劑、香料、光學增白劑)0-5％ 11)含水的液態去垢組合物，其包含線性烷基苯基磺酸鹽(以酸計算)20-32％乙氧基化醇(例如，C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)6-12％氨基乙醇2-6％檸檬酸8-14％硼酸鹽(作為B4O72-)1-3％聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物，錨定聚合物如，例如月桂基異丁烯酸/丙烯酸共聚物)0-3％甘油1-3％酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％次要的組成部分(例如，水溶助劑、分散劑、香料、光學增白劑)0-5％ 12)配制成具有至少600g/l的大密度的粒劑的去垢組合物，其包含陰離子表面活化劑(線性的烷基苯基磺酸鹽、烷基硫酸鹽、α-烯烴磺酸鹽、α-硫代脂肪酸甲基酯、鏈烷磺酸鹽、肥皂)25-40％非離子表面活化劑(例如，乙氧基化醇)1-10％碳酸鈉(作為Na2CO3)8-25％可溶性硅酸鹽(作為Na2O，2SiO4)5-15％硫酸鈉(作為Na2SO4)0-5％沸石(作為NaAlSiO4)15-28％ 過硼酸鈉(作為NaBO3.H2O)0-20％漂白劑活化劑(作為TAED或NOBS)0-5％酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％次要的組成部分(例如，香料、光學增白劑)0-5％ 13)如1)-12)中所描述的去垢劑制劑，其中線性烷基苯基磺酸鹽的所有或部分以(C12-C18)烷基硫酸鹽替代。
14)配制成具有至少600g/l的大密度的粒劑的去垢組合物，其包含(C12-C18)烷基硫酸鹽9-15％乙氧基化醇3-6％聚氫氧基烷基脂肪酸酰胺1-5％沸石(作為NaAlSiO4)10-20％層重硅酸鹽(得自Hoechst的SK56)10-20％碳酸鈉(作為Na2CO3)3-12％可溶性硅酸鹽(作為Na2O，2SiO4)0-6％檸檬酸鈉4-8％過硼酸鈉(作為NaBO3.H2O)13-22％TAED3-8％酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％次要的組成部分(例如，香料、光學增白劑)0-5％ 15)配制成具有至少600g/l的大密度的粒劑的去垢組合物，其包含(C12-C18)烷基硫酸鹽4-8％乙氧基化醇11-15％肥皂1-4％沸石MAP或沸石A35-45％碳酸鈉(作為Na2CO3)2-8％可溶性硅酸鹽(作為Na2O，2SiO4)0-4％ 過硼酸鈉13-22％TAED1-8％羧甲基纖維素0-3％聚合物(如聚羧酸鹽和PVP)0-3％酶(以純化的酶蛋白質計算)0.0001-0.1％次要的組成部分(例如，光學增白劑、膦酸酯、香料)0-3％ 16)如1)-15)所述的去垢劑制劑，該制劑包含作為添加的組分或作為已指定的漂白系統的替代物的穩定的或膠囊化的過酸。
17)如1)、3)、7)、9)和12)所述的去垢組合物，其中過硼酸鹽由過碳酸鹽替代。
18)如1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的去垢組合物，該組合物還包含錳催化劑。錳催化劑可以是，例如，在“低溫漂白的有效錳催化劑”，自然，369，1994，637-639中描述的化合物之一。
19)配制成不含水的去垢劑液體的去垢組合物，該組合物包含液態非離子表面活化劑如，例如，線性的烷氧基化的伯醇、增強去垢劑去垢作用的系統(例如，磷酸鹽)、酶和堿。去垢劑也可以包括陰離子表面活化劑和/或漂白系統。
在本發明的范圍之內的餐具洗滌組合物的具體形式包括 1)粉劑機用(automatic)餐具洗滌組合物非離子表面活化劑0.4-2.5％正硅酸鈉0-20％重硅酸鈉3-20％三磷酸鈉20-40％碳酸鈉0-20％過硼酸鈉2-9％四乙酰乙二胺(TAED)1-4％硫酸鈉5-33％ 酶0.0001-0.1％ 2)粉劑機用餐具洗滌組合物非離子表面活化劑(例如，乙氧基化醇)1-2％重硅酸鈉2-30％碳酸鈉10-50％膦酸鈉0-5％二氫檸檬酸三鈉9-30％次氨基三乙酸鈉(NTA)0-20％單氫過硼酸鈉5-10％四乙酰乙二胺(TAED)1-2％聚丙烯酸酯聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物)6-25％酶0.0001-0.1％香料0.1-0.5％水5-10 3)粉劑機用餐具洗滌組合物非離子表面活化劑0.5-2.0％重硅酸鈉25-40％檸檬酸鈉30-55％碳酸鈉0-29％重碳酸鈉0-20％單氫過硼酸鈉0-15％四乙酰乙二胺(TAED)0-6％馬來酸/丙烯酸共聚物0-5％粘土1-3％聚(氨基酸)0-20％ 聚丙烯酸鈉 0-8％酶 0.0001-0.1％ 4)粉劑機用餐具洗滌組合物非離子表面活化劑1-2％沸石MAP15-42％重硅酸鈉30-34％檸檬酸鈉0-12％碳酸鈉0-20％單氫過硼酸鈉7-15％四乙酰乙二胺(TAED)0-3％聚合物0-4％馬來酸/丙烯酸共聚物0-5％有機膦酸酯0-4％粘土1-2％酶0.0001-0.1％硫酸鈉平衡 5)粉劑機用餐具洗滌組合物非離子表面活化劑1-7％重硅酸鈉18-30％檸檬酸三鈉10-24％碳酸鈉12-20％單過硫酸鹽(2KHSO5.KHSO4.K2SO4)15-21％漂白劑的穩定劑0.1-2％馬來酸/丙烯酸共聚物0-6％二亞乙基三胺五醋酸鹽，五鈉鹽0-2.5％酶0.0001-0.1％ 硫酸鈉，水平衡 6)具有清潔表面活化劑系統的粉劑和液態餐具洗滌組合物非離子表面活化劑0-1.5％二氫十八烷基二甲胺N-氧化物0-5％二氫十八烷基二甲胺N-氧化物和二氫六癸基二甲胺N-氧化物的(80∶20重量C18/C16)混合物0-4％無水十八烷基雙(羥乙基)胺N-氧化物和無水十六烷基雙(羥乙基)胺N-氧化物的(70∶30重量C18/C16)混合物0-5％平均乙氧基化程度為3的C13-C15烷基乙氧基硫酸鹽0-10％平均乙氧基化程度為3的C12-C15烷基乙氧基硫酸鹽0-5％平均乙氧基化程度為12的C13-C15乙氧基化醇0-5％平均乙氧基化程度為9的C12-C15乙氧基化醇的混合物0-6.5％平均乙氧基化程度為30的C13-C15乙氧基化醇的混合物0-4％重硅酸鈉0-33％三聚磷酸酯0-46％檸檬酸鈉0-28％檸檬酸0-29％碳酸鈉0-20％單氫過硼酸鈉0-11.5％四乙酰乙二胺(TAED)0-4％馬來酸/丙烯酸共聚物0-7.5％硫酸鈉，水0-12.5％ 酶0.0001-0.1％ 7)不含水的液態機用餐具洗滌組合物液態非離子表面活化劑(如乙氧基醇)2.0-10.0％堿金屬硅酸鹽3.0-15.0％堿金屬磷酸鹽20.0-40.0％選自高級乙二醇、聚乙二醇、聚氧化物、乙二醇醚的液體載體25.0-45.0％穩定劑(例如，一部分磷酸和C16-C18烷醇的酯)0.5-7.0％泡沫抑制劑(如硅氧烷)0-1.5％酶0.0001-0.1％ 8)不含水的液態餐具洗滌組合物液態非離子表面活化劑(如乙氧基醇)2.0-10.0％硅酸鈉3.0-15.0％堿金屬碳酸鹽7.0-20.0％檸檬酸鈉0.0-1.5％穩定系統(例如，細分的硅氧烷和低的分子量二烷基聚乙二醇醚的混合物)0.5-7.0％低分子重量聚丙烯酸酯聚合物5.0-15.0％粘土凝膠增稠劑(例如，膨潤土)0.0-10.0％羥丙基纖維素聚合物0.0-0.6％酶0.0001-0.1％選自高級乙二醇、聚乙二醇、聚氧化物、乙二醇醚的液體載體平衡 9)搖溶的液態機用餐具洗滌組合物C12-C14脂肪酸0-0.5％ 嵌段共聚物表面活化劑1.5-15.0％檸檬酸鈉0-12％三聚磷酸鈉0-15％碳酸鈉0-8％三硬脂酸鋁0-0.1％異丙基苯磺酸鈉0-1.7％聚丙烯酸酯增稠劑1.32-2.5％聚丙烯酸酯鈉2.4-6.0％硼酸0-4.0％甲酸鈉0-0.45％甲酸鈣0-0.2％N-癸聯苯氧化物二磺酸鹽0-4.0％一乙醇胺(MEA)0-1.86％氫氧化鈉(50％)1.9-9.3％1，2-丙二醇0-9.4％酶0.0001-0.1％起泡肥皂水的泡沫抑制劑、染料、香料、水平衡 10)液態機用餐具洗滌組合物乙氧基醇1-20％脂肪酸酯磺酸鹽0-30％月桂基硫酸鈉0-20％烷基聚糖甙0-21％油酸0-10％單氫重硅酸鈉18-33％二氫檸檬酸鈉18-33％硬脂酸鈉0-2.5％單氫過硼酸鈉0-13％ 四乙酰乙二胺(TAED)0-8％馬來酸/丙烯酸共聚物4-8％酶0.0001-0.1％ 11)包含保護的漂白顆粒的液體機用餐具洗滌組合物硅酸鈉5-10％四鉀焦磷酸15-25％三磷酸鈉0-2％碳酸鉀4-8％受保護的漂白劑粒子，如氯5-10％聚合增稠劑0.7-1.5％氫氧化鉀0-2％酶0.0001-0.1％水平衡 11)如1)、2)、3)、4)、6)和10)描述的機用餐具洗滌組合物，其中過硼酸鹽由過碳酸鹽替代。
12)如1)-6)所述的機用餐具洗滌組合物，該組合物還包含錳催化劑。錳催化劑可以是，例如，在“低溫漂白的有效錳催化劑”，自然，369，1994，637-639中描述的化合物之一。
本發明的α-淀粉酶變體可以以通常用于去垢劑的濃度摻入。在本發明的去垢組合物中，α-淀粉酶變體可以以相當于每升洗滌/餐具洗滌液體0.00001-1mg(以純化的酶蛋白質計算)的量添加。
另外，本發明還可進一步通過參考附圖描述，其中 圖1是本發明的四種親本α-淀粉酶的氨基酸序列的序列對比。最左邊的數字分別指代的氨基酸序列如下 1在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列； 2在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列； 3在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列； 4在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列。
在圖最右邊的數字給出了所說的每種序列的連續的氨基酸總數。應該注意的是編號為3的序列(對應于在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列)，在序列對比中，其在分別編號為1(SEQ ID No.1)、2(SEQ ID No.)、4(SEQ IDNo.7)的序列中的相應的第1氨基酸和第175氨基酸的位置上產生“間隙”。
圖2是質粒pTVB106的限制性圖。
圖3是質粒pPM103的限制性圖。
圖4是質粒pTVB112的限制性圖。
圖5是質粒pTVB114的限制性圖。
實驗部分 具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列(分別得自芽孢桿菌菌株NCIB 12512和NCIB 12513)的親本α-淀粉酶的制備、純化和測序在WO 95/26397中描述。這兩種親本α-淀粉酶的pI值和分子量(在WO95/26397中給出)如下 SEQ ID No.1pI大約為8.8-9.0(在LKB Ampholine PAG平板上通過等電點聚焦測定)；分子量大約為55kD(通過SDS-PAGE測定)。
SEQ ID No.2pI大約為5.8(在LKB Ampholine PAG平板上通過等電點聚焦測定)；分子量大約為55kD(通過SDS-PAGE測定)。
本發明的α-淀粉酶變體的純化 按照本發明的變體的構建和表達在下面的實施例2中描述。本發明的變體的純化在本文中參考分別在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的變體說明 SEQ ID No.1變體(pI大約為9.0)的純化過濾包含表達的α-淀粉酶變體的發酵液，加入硫酸銨至其濃度達到飽和度的15％。然后把液體加進疏水柱(Toyopearl butyl/TOSOH)中。用pH7.0的20mM二甲基戊二酸緩沖液洗滌柱。α-淀粉酶結合得非常牢固，然后用在pH7.0的20mM二甲基戊二酸緩沖液中的25％w/w 2-丙醇洗脫。在洗脫之后，2-丙醇通過蒸發除去，濃縮物施用到用pH6.0的20mM二甲基戊二酸緩沖液平衡的陽離子交換柱(S-Sepharose FF，Pharmacia，瑞典)中。
在相同的緩沖液中使用0-250mM NaCl的線性梯度洗脫淀粉酶。在對pH8.0的10mM硼酸鹽/KCl緩沖液透析之后，把樣品的pH值調整到9.6，然后施用到用pH9.6的10mM硼酸鹽/KCl緩沖液平衡的陰離子交換柱(Q-Sepharose FF，Pharmacia)中。用0-250mM NaCl的線性梯度洗脫淀粉酶。把pH調整到7.5。α-淀粉酶通過rSDS-PAGE判斷是純的。為了穩定淀粉酶，所有緩沖液均包含2mM CaCl2。
SEQ ID No.2變體(pI大約為5.8)的純化過濾包含表達的α-淀粉酶變體的發酵液，加入硫酸銨至其濃度達到飽和度的15％。然后把液體加進疏水柱(Toyopearl butyl/TOSOH)中。用在pH8.0的10mM Tris緩沖液中的15％-0％w/w的硫酸銨洗脫結合的α-淀粉酶。在洗脫物對pH8.0的10mM硼酸鹽/KCl緩沖液透析之后，把液體的pH值調整到9.6，然后施用到用相同緩沖液平衡的陰離子交換柱(Q-Sepharose FF，Pharmacia)中。用150mM NaCl分步洗脫淀粉酶。
在洗脫之后，為了除去NaCl，淀粉酶樣品對pH8.0的相同緩沖液透析。透析之后，把pH調整到9.6，淀粉酶再次結合到陰離子交換柱上。用0-250mMNaCl的線性梯度洗脫淀粉酶。把pH調整到7.5。α-淀粉酶通過rSDS-PAGE判斷是純的。為了穩定淀粉酶，所有緩沖液均包含2mM CaCl2。
α-淀粉酶活性測定 α-淀粉酶活性通過使用Phadebas片劑作為底物的方法測定。Phadebas片劑(Phadebas淀粉酶試驗，由Pharmacia Diagnostic供應)包含交聯的不溶性藍色淀粉聚合物，這種聚合物與牛血清蛋白和緩沖物質混合并制成片劑。
對于每一次測量的測定，把一片藥劑懸浮在包含5ml 50mM Britton-Robinson緩沖液(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl2，pH用NaOH調整到興趣值)的試管中。試驗在目的溫度的水浴中進行。試驗的α-淀粉酶在×ml的50mM Britton-Robinson緩沖液中稀釋。1ml的這種α-淀粉酶溶液加到5ml 50mM的Britton-Robinson緩沖液中。淀粉通過α-淀粉酶水解給出可溶性的藍色片段。產生的藍色溶液的吸光度在620nm處用 分光光度法測量，它是α-淀粉酶活性的函數。
重要的是在15分鐘的溫育(試驗時間)之后測得的620nm處的吸光度在620nm處在0.2至2.0個吸光度單位之間。在這個吸光度范圍內在活性和吸光度之間有線性關系(朗伯-比爾定律)。因此對酶的稀釋必須加以調整以適合這個標準。
在指定的條件下(溫度、pH值、反應時間、緩沖液條件)，1mg給定的α-淀粉酶水解一定量的底物，產生藍色。顏色強度在620nm處測量。測量吸光度直接和在給定條件下所說的α-淀粉酶的特定活性成比例(活性/mg純化的α-淀粉酶)。這樣，在相同條件下試驗了不同的目的α-淀粉酶(包括參比α-淀粉酶，在所說的親本α-淀粉酶的情況下)之后，在給定溫度和給定的pH下每種α-淀粉酶的活性就可以直接比較，可以測定每種興趣α-淀粉酶的特異性活性相對于參比α-淀粉酶的特異性活性的比率。
小型餐具洗滌測定 使用了下列的小型餐具洗滌測定煮沸含淀粉材料的懸浮液，然后冷卻到20℃。冷卻的淀粉懸浮液使用到相同的單個小玻璃平板(大約2×2cm)上，然后在干燥櫥中以ca.140℃的溫度干燥。然后對單個平板稱重。為了測定，制備了具有55℃溫度的標準歐洲型機用餐具洗滌去垢劑(5g/l)。使去垢劑溶解1分鐘，其后向去垢劑溶液(包含裝備有磁性攪拌的燒杯中)中加入所說的α-淀粉酶以使酶濃度達到0.5mg/l。同時，把置于小支持架的稱重的玻璃平板以實質上的垂直位置浸沒在α-淀粉酶/去垢劑溶液中，然后在55℃下攪拌15分鐘。然后把玻璃平板從α-淀粉酶/去垢劑溶液在取出，以蒸餾水漂洗，于60℃下在干燥櫥中干燥并再次稱重。然后所說的α-淀粉酶的性能[以相對于選擇的參比α-淀粉酶(指數為100)-在下面(實施例1)的實施例中具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶-的指數表達]從處理前后的玻璃平板的重量差別中測定，結果如下
下列的實施例進一步說明本發明。它們無意于以任何方式限制本發明所要求的范圍。
實施例1 具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的變體的小型餐具洗滌試驗 上述的小型餐具洗滌試驗在pH10.5下用具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶及其下列變體進行(它們的構建與純化描述如下)T183*+G184*；Y243F；K269R。試驗結果如下 親本(SEQ ID No.1) 指數100 T183*+G184* 指數120 Y243F 指數120 K269R 指數131 很明顯，試驗的變體T183*+G184*(它比親本α-淀粉酶表現出特別高的熱穩定性)、Y243F(它比親本α-淀粉酶表現出更低的Ca2+離子依賴性)和K269R(它比親本α-淀粉酶表現出更低的Ca2+離子依賴性以及在高pH下更高的穩定性)的每一種相對于親本α-淀粉酶表現出明顯改良的餐具洗滌性能。
實施例2 具有分別在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的變體的構建 引物下述的變體構建中使用的DNA引物包括下列引物[所有的DNA引物以從5到3的方向(從左到右)給出；P指代5-磷酸鹽] #7113 GCT GCG GTG ACC TCT TTA AAA AAT AAC GGC Y296 CC ACC GCT ATT AGA TGC ATT GTA C #6779 CTT ACG TAT GCA GAr GTC GAT ATG GAT CAC CC #6778 G ATC CAT ATC GAC GTC TGC ATA CGT AAG ATA GTC #3811 TTA(C/G)G GGC AAG GCC TGG GAC TGG #744 9 C CCA GGC CTT GCC C(C/G)T AAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG #3810 G GTT TCG GTT CGA AGG ATT CAC TTC TAC CGC #7450 GCG GTA GAA GTG AAT CCT TCG AAC CGA AAC CAG B1 GGT ACT ATC GTA ACA ATG GCC GAT TGC TGA CGC TGT TAT TTG C #6616 P CTG IGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C #8573 CTA CTT CCC AAT CCC AAG CTT TAC CTC GGA ATT TG #8569 CAA ATT CCG AGG TAA AGC TTG GGA TTG GGA AGT AG #8570 TTG AAC F-AC CGT TCC ATT AAG AAG A具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶變體的構建 質粒DTVB106的描述具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶及其變體從在圖2中所示的質粒攜帶的基因SF16表達。質粒pTVB106包含從質粒pUB110獲得的復制起點(Gryczan等，1978)以及具有氯霉素抗性的cat基因。淀粉酶分泌得到Termamyl信號序列的幫助，該信號序列準確地融合到(即成熟蛋白質的第一密碼子)編碼具有分別在SEQID No.4和SEQ ID No.1中所示的核苷酸和氨基酸序列(成熟蛋白質)的親本α-淀粉酶基因中。Termamyl啟動子啟動基因的轉錄。
質粒pTVB106類似于pDN1528(參見丹麥公開專利申請1155/94)。在圖2的質粒圖譜上指出了一些單一限制位點，包括BstBI、BamHI、BstEII、EcoNI、DrdI、AflIII、DraIII、XmaI、SalI和BglII。
變體M202T的構建使用了PCR重疊延伸誘變(overlap extensionmutagenesis)構建這個變體(Higuchi等，1988)。使用引物#7113和誘變引物#6778在PCR反應A中擴增pTVB106的大約350bp的DNA片段。在一個類似的PCR反應B中，使用引物Y296和#6779擴增大約300bp的DNA片段。使用這些引物和在反應A和B中純化的DNA片段，在PCR反應C中擴增了跨從引物#7113到引物Y296的突變位點(M202)的全DNA片段。
以限制性核酸內切酶BstEII和AflIII消化PCR C DNA，使用用相同的酶消化的質粒pTVB106連接480bp片段并轉化進低蛋白酶和低淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株中(例如，在WO 92/11357中提到的SHA273菌株)。
其它M202變體以類似的方式構建。
變體T183*+G184*和R181*+G182*的構建使用了PCR重疊延伸誘變構建這些變體(Higuchi等，1988)。使用在一個位置的C和G(相等部分)的混合物合成了誘變的寡核苷酸，因此通過這種方法可以構建兩種不同的突變體。使用引物#7113和誘變引物#7449在PCR反應中擴增pTVB106的大約300bp的DNA片段。在類似的PCR反應B中，使用引物Y296和#3811擴增了大約400bp的DNA片段。使用這些引物和在反應A和B中純化的DNA片段，在PCR反應C中擴增了跨從引物#7113到引物Y296的突變位點(氨基酸181-184)的全DNA片段。
以限制性核酸內切酶BstEII和Af1III消化PCR C DNA，使用用相同的酶消化的質粒pTVB106連接480bp片段并轉化進低蛋白酶和低淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株中(例如，在WO 92/11357中提到的SHA273菌株)。得自這些轉化體的質粒DNA的測序鑒別出兩個正確的突變體即R181*+G182*和T183*+G184*。
變體R124P的構建使用了PCR重疊延伸誘變方法以類似于變體M202T構建(見上)的方式構建這種變體。PCR反應A(用引物#3810和B1)產生大約500bp的片段，PCR反應B(用引物7450和Y296產生大約550bp的片段)。PCR反應C基于PCR反應A和B的產物、用限制性核酸內切酶BstEII和AflIII消化的引物B1和Y296以及產生的跨氨基酸位置124的480bp的片段亞克隆進以相同的酶消化的pTVB106中，并轉化進以上的枯草芽孢桿菌中。
變體R124P+T183*+G184*的構建為了構建結合R124P和T183*+G184*突變的變體，使用了兩個EcoNI限制位點(一個定位在位置1.774kb，即在R124P突變和T183*+G184*突變之間，一個定位在位置0.146kb)。把包含T183*+G184*的類似于pTVB106質粒的大約1630bp的EcoNI片段亞克隆進另一種包含以相同的酶消化的R124P突變的類似于pTVB106的質粒的載體部分(包含復制起點的大約3810bp的DNA片段)。如上所述轉化進枯草芽孢桿菌。
變體G182*+G184*；L81*+T183*；Y243F；K269R和L351C+M430C的構建這些變體構建如下 制備了包含在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列編碼區的主要部分的特異性誘變載體。這個載體的重要特征(定名為pPM103)包括衍生自pUC質粒的復制起點、攜帶氯霉素抗性的cat基因、包含移碼突變的bla基因以及通常具有對氨芐青霉素抗性的野生型(ampR表型)。突變的bla基因導致了ampS表型。質粒pPM103如圖3所示，在質粒上指出了大腸桿菌復制起點、5-截短的SF16淀粉酶基因、ori、bla、cat以及選擇的限制位點。
除了具有摻入的“選擇性引物”(#6616)基于具有攜帶修復的bla基因的轉化大腸桿菌細胞的ampR表型選擇代替使用Deng和Nickoloff概述的通過限制酶消化選擇之外，按照Deng和Nickoloff所述的方法[生物化學年評，200(1992)，81-88]把突變導入興趣基因。用于誘變的化學藥品和酶從Stratagene的Chameleon誘變試劑盒獲得(目錄號200509)。
在對變體質粒中的DNA序列校驗之后，包含所要求的變化的截短的基因作為大約1440bp的BstBI-SalI片段從類似pPM103的質粒亞克隆進pTVB106，并轉化進枯草芽孢桿菌以表達變體酶。
構建體成對缺失變體G182*+G184*使用了下列誘變引物 P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT TGT CCT GAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG AAG 構建體成對缺失變體R181*+T183*使用了下列誘變引物 P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT GCC TCC GAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG AAG 構建取代變體Y243F使用了下列誘變引物 P ATG TGT AAG CCA ATC GCG AGT AAA GCTAAA TTT TAT ATG TTT CAC TGC ATC 構建取代變體K269R使用了下列誘變引物 P GC ACC AAG GTC ATT TCG CCA GAA TTC AGC CAC TG 構建成對取代變體L351C+M430C，同時使用了下列誘變引物 1)P TGT CAG AAC CAA CGC GTA TGC ACA TGG TTT AAA CCA TTG 2)P ACC ACC TGG ACC ATC GCT GCA GAT GGT GGC AAG GCC TGA ATT 變體L351C+M430C+T183*+G184*的構建這個變體通過把L351C+M430C成對取代突變和T183*+G184*成對缺失突變結合構建，二者的結合通過把包含L351C+M430C的大約1430bp的HindIII-AflIII片段亞克隆進用相同的酶消化的類似于pTVB106的質粒(帶有T183*+G184*突變)完成。
變體Y243F+T183*+G184*的構建這個變體通過把Y243F突變和T183*+G184*突變結合構建，二者的結合通過把包含T183*+G184*的大約1148bp的DrdI片段亞克隆進用相同的酶消化的類似于pTVB106的質粒(帶有Y243突變)完成。
在含淀粉的瓊脂平板篩選具有α-淀粉酶活性的枯草芽孢桿菌轉化體，通過DNA測序檢查正確突變的存在。
變體Y243F+T183*+G184*+L351C+M430C的構建把L351C+M430C成對取代突變作為大約470bp的Xmal-SalI片段亞克隆進用相同的酶消化的類似于pTVB106的載體(包含Y243+T183*+G184*)。
變體Y243F+T183*+G184*+L351C+M430C+Q391E+K444Q的構建通過用包含所說的五種突變的類似于pTVB106載體的BstB1-SalI片段取代截短的SF16構建了包含突變Y243F+T183*+G184*+L351C+M430C的類似于pPM103的載體。通過使用下列兩種誘變引物以類似于上述的對pPM103誘變的方式同時把Q391E和K444Q突變導入類似于pPM103的載體中(包含Y243F+T183*+G184*+L351C+M430C) P GGC AAA AGT TTG ACG TGC CTC GAG AAG AGG GTC TAT P TTG TCC CGC TTT ATT CTG GCC AAC ATA CAT CCA TTT B具有在SEQ ID No.2中所示氨基酸序列的親本α-淀粉酶變體的構建 質粒pTVB112的描述構建了用于具有在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列α-淀粉酶在枯草芽孢桿菌中表達的定名為pTVB112的載體。該載體除了編碼SEQ ID No.2中的成熟α-淀粉酶的基因插入到pTVB106的Pstl和HindIII位點之間外和pTVB106十分類似。這樣，這種α-淀粉酶(SEQ ID No.2)的表達也受amyL啟動子與信號序列指導。質粒p1VB112在圖4中所示。
變體D183*+G184*的構建這個變體的構建通 過參考較早的文獻使用PCR重疊延伸誘變方法(見上)完成。引物#8573和B1用于PCR反應A，引物#8569和#8570用于PCR反應B。從反應A和反應B純化的片段和引物1B和#8570用于PCR反應C，產生了大約1020bp的DNA片段。該這片段用限制性內切核酸酶Pstl和MluI消化，亞克隆進表達載體并轉化進枯草芽孢桿菌。
其它變體的構建通過和用于SEQ ID No.1的氨基酸序列的突變體產生的質粒pPM103構建類似的方法(見上)，構建了一種對變體D183*+G184*(SEQID No.2)繼續誘變的質粒(定名為pTVB114；在圖5中所示)。以類似于pPM103(SEQ ID No.1)的方式把突變導入pTVB114中(SEQ ID No.2；D183*+G184*)。
構建成對缺失變體R181*+D183*和R181*+G182*，選擇的是改變變體D183*+G184*中的側翼氨基酸，而不是缺失SEQ ID No.2的野生型基因中的特異性氨基酸。下列誘變引物和作為模板的pTVB114一起用于誘變PCC CAA TCC CAA GCTTTA CCA(T/C)CG AAC TTG TAG ATA CG兩種堿基的混合物(T/C)在一個位置的存在使得基于一種誘變引物的兩種不同的缺失側翼氨基酸可以存在。形成的質粒的DNA測序證明一種或另一種突變的存在。突變的興趣基因作為Pstl-DraIII片段亞克隆進以相同的酶消化的pTVB112中，然后轉化進枯草芽孢桿菌。
構建G182*+G184*和R181*+G184*使用了下列誘變引物和作為模板的pTVB114 PCC CAA TCC CAA GCT TTA TCT C(C/G)G AAC TTG TAG ATA CG 如上所述，兩種堿基的混合物(C/G)在一個位置的存在使得基于一種誘變引物的兩種不同的缺失側翼氨基酸可以存在。形成的質粒的DNA測序證明一種或另一種突變的存在。突變的興趣基因作為Pstl-DraIII片段亞克隆進以相同的酶消化的pTVB112中，然后轉化進枯草芽孢桿菌。
構建D183*+G184*+M202L使用了下列誘變引物 PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAC AGT AAA TAA TC 構建D183*+G184*+M2021使用了下列誘變引物 PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAA ATT AAA TAA TC 實施例3 具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的M202取代變體的氧化穩定性測定 ASEQ ID No.1中的序列的變體的氧化穩定性 測定使用各自的變體在pH9.0的50mM Britton-Robinson緩沖液(50mM醋酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0.1mM CaCl2、以NaOH把pH調整到興趣值)中的溶液進行，并向溶液中加入過氧化氫(在時間t＝0時)使其最終濃度達到200mM H2O2。然后溶液在40℃的水浴中溫育。
加入過氧化氫后溫育5、10、15和20分鐘后，樣品中剩余的α-淀粉酶活性使用上述的Phadebas測定法測定。樣品中剩余活性使用pH7.3的50mM Britton-Robinson緩沖液在37℃下測定(參見Novo分析出版物AF207-1/1，可從Novo Nordisk A/S得到)。測定了相對于沒有和過氧化氫溫育的相應的同樣的酶的參比溶液在0分鐘時(100％活性)的活性下降。
初始活性的百分比作為時間的函數在下面所說的親本酶(SEQ ID No.1)和變體的表中所示。
變體 溫育(分鐘)后的活性％ 0 510 1520 M202L 100 90 72 5827 M202F 100 100 87 7143 M202A 100 99 82 6430 M2021 100 91 75 5928 M202T 100 87 65 4920 M202V 100 100 87 7443 M202S 100 100 85 6834 親本100 51 26 132 所有試驗的M202取代變體相對于親本α-淀粉酶(SEQ ID No.1)清楚地表現出明顯改良的氧化穩定性。
BSEQ ID No.2中的序列的變體的氧化穩定性 使用所說的親本α-淀粉酶(SEQ ID No.2)、變體M202L+D183*+G184*(在下表中稱為L)、變體M2021+D183*+G184*(在下表稱為I)如上所述分別進行測量。在這種情況下，使用了5、10、15和30分鐘的溫育時間(在添加過氧化氫之后)。如上表，初始活性的百分比作為時間的函數在下面所說的親本酶和變體的表中所示。
變體 溫育(分鐘)后的活性％ 0 510 15 30 L 100 91 85 71 43 I 100 81 61 44 18 親本100 56 26 14 4 試驗的兩個“取代+成對缺失”變體(它們都包含M202取代)相對于親本α-淀粉酶(SEQ ID No.1)清楚地表現出明顯改良的氧化穩定性。
實施例4 具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶變體的熱穩定性測定 A在SEQ ID No.1序列中的成對缺失變體的熱穩定性 測定使用各自的變體在pH9.0的50mM Britton-Robinson緩沖液(見上)中的溶液進行。溶液在65℃的水浴中溫育，溫育之后樣品取出，保持指定的時間。各取出樣品的剩余α-淀粉酶活性使用以上所述的Phadebas測定方法進行測量。測定了相對于沒有溫育的相應的同樣的酶的參比溶液在0分鐘時(100％活性)的活性下降。
初始活性的百分比作為時間的函數在下面所說的親本酶(SEQ ID No.1)和下列的成對缺失變體的表中所示。
變體1R181*+G182* 變體2R181*+T183* 變體3G182*+G184* 變體4T183*+G184* 變體5T183*+G184*+R124P 變體 溫育(分鐘)后的活性％ 0 5 10153045 60 1 100 8166492414 8 2 100 805339178 3 3 100 644028104 2 4 100 644334208 5 5 100 7873665747 38 親本100 132 0 0 0 0 很明顯，所有試驗的成對缺失變體相對于親本α-淀粉酶(SEQ ID No.1)清楚地表現出明顯改良的熱穩定性，變體5(除了變體4的成對缺失突變之外還包括取代R124P)的熱穩定性比其它的變體顯著地高。因為取代變體R124P(僅包含取代R124P)的測熱結果表明其相對于親本α-淀粉酶大約7℃的熱穩定性，看起來突變R124P和成對缺失的熱穩定性效果分別相互加強。
B在SEQ ID No.2中的序列的成對缺失變體的熱穩定性 對親本酶(SEQ ID No.2)和下列成對缺失變體進行了相應的測定 變體AD183*+G184* 變體BR181*+G182* 變體CG182*+G184* 變體 溫育(分鐘)后的活性％ 0 510 15 30 A 100 87 71 63 30 B 100 113 85 76 58 C 100 99 76 62 34 親本100 72 55 44 18 還是很明顯，所有所說的成對缺失變體相對于親本α-淀粉酶(SEQ IDNo.2)表現出明顯改良的熱穩定性。
CSEQ ID No.1中序列的多組合變體的熱穩定性 對在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的下列變體進行了相應的比較測量。
變體4T183*+G184* 變體6L351C+M430C 變體7Y243F 變體8Q391E+K444Q 變體9T183*+G184*+L351C+M430C+Y243F+Q391E+K444Q 變體溫育(分鐘)后的活性％ 0 510 15 30 4 100 66 41 22 7 6 100 87 73 65 43 7 100 14 210 8 100 69 46 31 14 9 100 92 93 89 82 再一次明顯說明，多突變的熱穩定性效果(每一種都有熱穩定性效果)是-至少是定性地-累積性的。
實施例5 本發明的α-淀粉酶變體的Ca2+結合親和性 淀粉酶接觸熱或變性劑如鹽酸胍的解折疊伴隨著熒光的減弱。失去鈣離子導致解折疊，一系列α-淀粉酶對鈣的親和性可通過每種α-淀粉酶(如以10μg/ml的濃度)在緩沖液中(如pH7的50mM HEPES)和不同濃度的鈣(如在1μM至100mM的范圍內)或EGTA(如在1-1000μM的范圍內)[EGTA＝1，2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷-N，N，N，N-四乙酸]溫育足夠長的時間(如在55℃下22小時)之前和之后的熒光測量來測量。
所測得的熒光F是由折疊和解折疊形式的酶的貢獻形式組成。可以產生下列的方程式以描述F對鈣濃度([Ca])的依賴 F＝[Ca]/(Kdiss+[Ca])(αN-βNlog([Ca]))+(Kdiss/(Kdiss+[Ca])(αU-βUlog([Ca])) 其中αN是天然的(折疊的)形式的酶的熒光，βN是αN對鈣濃度對數(試驗觀察得到)的線性依賴性，αU是解折疊形式的熒光，βU是αU對鈣濃度對數的線性依賴性。Kdiss是平衡過程的袁觀鈣結合常數，表示如下 事實上，解折疊過程極慢而且不可逆。解折疊速率依賴于鈣濃度，對給定的α-淀粉酶的依賴性提供了酶的Ca-結合親和性測量方法。通過定義一組標準的反應條件(例如，55℃下22小時)，可以進行不同α-淀粉酶的Kdiss的有意義的比較。通常α-淀粉酶的鈣離解和上述的方程式相符合，使得可以進行相應的Kdiss值的測定。
下列的Kdiss值是具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶和按照本發明的指出的α-淀粉酶變體的值(親本α-淀粉酶在括弧中指出) 變體 Kdiss(mol/l) D183*+G184*(SEQ ID No.2) 1.2(±0.5)×10-4 L351C+M430C+T183*+G184*(SEQ ID No.1) 1.7(±O.5)×10-3 T183*+G184*(SEQ ID No.1) 4.3(±O.7)×10-3 SEQ ID No.2(親本) 4.2(±1.2)×10-2 SEQ ID No.1(親本) 3.5(±1.1)×1O-1 從上述可明顯看到后者的淀粉分解酶的鈣結合親和性在上述表中以降低的方向減少，即成對缺失變體D183*+G184*(SEQ ID No.2)結合鈣能力最強(即有最低的Ca2+依賴性)，而SEQ ID No.1的親本α-淀粉酶結合鈣能力最弱(即有最高的Ca2+依賴性)。
說明書中引用的參考文獻
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序列表
(1)一般信息
(i)申請人
(a)姓名NOVO NORDISK A/S
(b)街道NOVO Alle
(c)城市DK-2880 Bagsvaerd
(e)國家丹麥
(f)郵區代碼(ZIP)DK-2880
(g)電話+45 44 44 88 88
(h)電傳+45 44 49 32 56
(ii)發明題目淀粉酶變體
(iii)序列數7
(iv)計算機可讀形式
(A)介質類型軟盤
(B)計算機IBM PC兼容機
(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS
(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)
(2)SEQ ID No.1的信息
(i)序列特征
(A)長度485個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型肽
(xi)序列描述SEQ ID No.1
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Gly Thr Glu Ile Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Thr Ser Gly Glu Tyr Ala Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Asn His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Ile His Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr
245 250 255
Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Tyr Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gln Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Val Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Phe Ala Tyr Gly Thr
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Val Trp Val Lys Gln
485
(2)SEQ ID No.2的信息
(i)序列特征
(A)長度485個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型肽
(xi)序列描述SEQ ID No.2
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr
385 390 395 400
Gln His Aso Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Lys Arg
485
(2)SEQ ID No.3的信息
(i)序列特征
(A)長度514個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型肽
(xi)序列描述SEQ ID No.3
Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met
85 90 95
Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly
100 105 110
Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln
115 120 125
Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His
145 150 155 160
Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn
210 215 220
Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys
260 265 270
Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr
290 295 300
Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln
325 330 335
Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
405 410 415
Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val
435 440 445
Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
465 470 475 480
Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr
485 490 495
Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val
500 505 510
Ala Trp
(2)SEQ ID No.4的信息
(i)序列特征
(A)長度1455個堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID No.4
CATCATAATG GAACAAATGG TACTATGATG CAATATTTCG AATGGTATTT GCCAAATGAC 60
GGGAATCATT GGAACAGGTT GAGGGATGAC GCAGCTAACT TAAAGAGTAA AGGGATAACA 120
GCTGTATGGA TCCCACCTGC ATGGAAGGGG ACTTCCCAGA ATGATGTAGG TTATGGAGCC 180
TATGATTTAT ATGATCTTGG AGAGTTTAAC CAGAAGGGGA CGGTTCGTAC AAAATATGGA 240
ACACGCAACC AGCTACAGGC TGCGGTGACC TCTTTAAAAA ATAACGGCAT TCAGGTATAT 300
GGTGATGTCG TCATGAATCA TAAAGGTGGA GCAGATGGTA CGGAAATTGT AAATGCGGTA 360
GAAGTGAATC GGAGCAACCG AAACCAGGAA ACCTCAGGAG AGTATGCAAT AGAAGCGTGG 420
ACAAAGTTTG ATTTTCCTGG AAGAGGAAAT AACCATTCCA GCTTTAAGTG GCGCTGGTAT 480
CATTTTGATG GGACAGATTG GGATCAGTCA CGCCAGCTTC AAAACAAAAT ATATAAATTC 540
AGGGGAACAG GCAAGGCCTG GGACTGGGAA GTCGATACAG AGAATGGCAA CTATGACTAT 600
CTTATGTATG CAGACGTGGA TATGGATCAC CCAGAAGTAA TACATGAACT TACAAACTGG 660
GCAGTGTGGT ATACGAATAC ACTGAACCTT GATGGATTTA GAATAGATGC AGTGAAACAT 720
ATAAAATATA GCTTTACGAG AGATTGGCTT ACACATGTGC GTAACACCAC AGGTAAACCA 780
ATGTTTGCAG TGGCTGAGTT TTGGAAAAAT GACCTTGGTG CAATTGAAAA CTATTTGAAT 840
AAAACAAGTT GGAATCACTC GGTGTTTGAT GTTCCTCTCC ACTATAATTT GTACAATGCA 900
TCTAATAGCG GTGGTTATTA TGATATGAGA AATATTTTAA ATGGTTCTGT GGTGCAAAAA 960
CATCCAACAC ATGCCGTTAC TTTTGTTGAT AACCATGATT CTCAGCCCGG GGAAGCATTG 1020
GAATCCTTTG TTCAACAATG GTTTAAACCA CTTGCATATG CATTGGTTCT GACAAGGCAA 1080
CAAGGTTATC CTTCCGTATT TTATGGGGAT TACTACGGTA TCCCAACCCA TGGTGTTCCG 1140
GCTATGAAAT CTAAAATAGA CCCTCTTCTG CAGGCACGTC AAACTTTTGC CTATGGTACG 1200
CAGCATGATT ACTTTGATCA TCATGATATT ATCGGTTGGA CAAGAGAGGG AAATAGCTCC 1260
CATCCAAATT CAGGCCTTGC CACCATTATG TCAGATGGTC CAGGTGGTAA CAAATGGATG 1320
TATGTGGGGA AAAATAAAGC GGGACAAGTT TGGAGAGATA TTACCGGAAA TAGGACAGGC 1380
ACCGTCACAA TTAATGCAGA CGGATGGGGT AATTTCTCTG TTAATGGAGG GTCCGTTTCG 1440
GTTTGGGTGA AGCAA 1455
(2)SEQ ID No.5的信息
(i)序列特征
(A)長度1455個堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID No.5
CATCATAATG GGACAAATGG GACGATGATG CAATACTTTG AATGGCACTT GCCTAATGAT 60
GGGAATCACT GGAATAGATT AAGAGATGAT GCTAGTAATC TAAGAAATAG AGGTATAACC120
GCTATTTGGA TTCCGCCTGC CTGGAAAGGG ACTTCGCAAA ATGATGTGGG GTATGGAGCC180
TATGATCTTT ATGATTTAGG GGAATTTAAT GAAAAGGGGA CGGTTCGTAC TAAGTATGGG240
ACACGTAGTC AATTGGAGTC TGCCATCCAT GCTTTAAAGA ATAATGGCGT TCAAGTTTAT300
GGGGATGTAG TGATGAACCA TAAAGGAGGA GCTGATGCTA CAGAAAACGT TCTTGCTGTC360
GAGGTGAATC CAAATAACCG GAATCAAGAA ATATCTGGGG ACTACACAAT TGAGGCTTGG420
ACTAAGTTTG ATTTTCCAGG GAGGGGTAAT ACATACTCAG ACTTTAAATG GCGTTGGTAT480
CATTTCGATG GTGTAGATTG GGATCAATCA CGACAATTCC AAAATCGTAT CTACAAATTC540
CGAGGTGATG GTAAGGCATG GGATTGGGAA GTAGATTCGG AAAATGGAAA TTATGATTAT600
TTAATGTATG CAGATGTAGA TATGGATCAT CCGGAGGTAG TAAATGAGCT TAGAAGATGG660
GGAGAATGGT ATACAAATAC ATTAAATCTT GATGGATTTA GGATCGATGC GGTGAAGCAT720
ATTAAATATA GCTTTACACG TGATTGGTTG ACCCATGTAA GAAACGCAAC GGGAAAAGAA780
ATGTTTGCTG TTGCTGAATT TTGGAAAAAT GATTTAGGTG CCTTGGAGAA CTATTTAAAT840
AAAACAAACT GGAATCATTC TGTCTTTGAT GTCCCCCTTC ATTATAATCT TTATAACGCG900
TCAAATAGTG GAGGCAACTA TGACATGGCA AAACTTCTTA ATGGAACGGT TGTTCAAAAG960
CATCCAATGC ATGCCGTAAC TTTTGTGGAT AATCACGATT CTCAACCTGG GGAATCATTA 1020
GAATCATTTG TACAAGAATG GTTTAAGCCA CTTGCTTATG CGCTTATTTT AACAAGAGAA 1080
CAAGGCTATC CCTCTGTCTT CTATGGTGAC TACTATGGAA TTCCAACACA TAGTGTCCCA 1140
GCAATGAAAG CCAAGATTGA TCCAATCTTA GAGGCGCGTC AAAATTTTGC ATATGGAACA 1200
CAACATGATT ATTTTGACCA TCATAATATA ATCGGATGGA CACGTCAAGG AAATACCACG 1260
CATCCCAATT CAGGACTTGC GACTATCATG TCGGATGGGC CAGGGGGAGA GAAATGGATG 1320
TACGTAGGGC AAAATAAAGC AGGTCAAGTT TGGCATGACA TAACTGGAAA TAAACCAGGA 1380
ACAGTTACGA TCAATGCAGA TGGATGGGCT AATTTTTCAG TAAATGGAGG ATCTGTTTCC 1440
ATTTGGGTGA AACGA1455
(2)SEQ ID No.6的信息
(i)序列特征
(A)長度1548個堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID No.6
GCCGCACCGT TTAACGGCAC CATGATGCAG TATTTTGAAT GGTACTTGCC GGATGATGGC 60
ACGTTATGGA CCAAAGTGGC CAATGAAGCC AACAACTTAT CCAGCCTTGG CATCACCGCT120
CTTTGGCTGC CGCCCGCTTA CAAAGGAACA AGCCGCAGCG ACGTAGGGTA CGGAGTATAC180
CACTTGTATG ACCTCGGCGA ATTCAATCAA AAAGGGACCG TCCGCACAAA ATACGGAACA240
AAAGCTCAAT ATCTTCAAGC CATTCAAGCC GCCCACGCCG CTGGAATGCA AGTGTACGCC300
GATGTCGTGT TCGACCATAA AGGCGGCGCT GACGGCACGG AATGGGTGGA CGCCGTCGAA360
GTCAATCCGT CCGACCGCAA CCAAGAAATC TCGGGCACCT ATCAAATCCA AGCATGGACG420
AAATTTGATT TTCCCGGGCG GGGCAACACC TACTCCAGCT TTAAGTGGCG CTGGTACCAT480
TTTGACGGCG TTGATTGGGA CGAAAGCCCA AAATTGAGCC GCATTTACAA ATTCCGCGGC540
ATCGGCAAAG CGTGGGATTG GGAAGTAGAC ACGGAAAACG CAAACTATGA CTACTTAATG600
TATGCCGACC TTGATATGGA TCATCCCGAA GTCGTGACCG AGCTGAAAAA CTGGGGGAAA660
TGGTATGTCA ACACAACGAA CATTGATGGG TTCCGGCTTG ATGCCGTCAA GCATATTAAG720
TTCAGTTTTT TTCCTGATTG GTTGTCGTAT GTGCGTTCTC AGACTGGCAA GCCGCTATTT780
ACCGTCGGGG AATATTGGAG CTATGACATC AACAAGTTGC ACAATTACAT TACGAAAACA840
GACGGAACGA TGTCTTTGTT TGATGCCCCG TTACACAACA AATTTTATAC CGCTTCCAAA900
TCAGGGGGCG CATTTGATAT GCGCACGTTA ATGACCAATA CTCTCATGAA AGATCAACCG960
ACATTGGCCG TCACCTTCGT TGATAATCAT GACACCGAAC CCGGCCAAGC GCTGCAGTCA 1020
TGGGTCGACC CATGGTTCAA ACCGTTGGCT TACGCCTTTA TTCTAACTCG GCAGGAAGGA 1080
TACCCGTGCG TCTTTTATGG TGACTATTAT GGCATTCCAC AATATAACAT TCCTTCGCTG 1140
AAAAGCAAAA TCGATCCGCT CCTCATCGCG CGCAGGGATT ATGCTTACGG AACGCAACAT 1200
GATTATCTTG ATCACTCCCA CATCATCGGG TGGACAAGGG AAGGGGGCAC TGAAAAACCA 1260
GGATCCGGAC TGGCCGCACT GATCACCGAT GGGCCGGGAG GAAGCAAATG GATGTACGTT1320
GGCAAACAAC ACGCTGGAAA AGTGTTCTAT GACCTTACCG GCAACCGGAG TGACACCGTC1380
ACCATCAACA GTGATGGATG GGGGGAATTC AAAGTCAATG GCGGTTCGGT TTCGGTTTGG1440
GTTCCTAGAA AAACGACCGT TTCTACCATC GCTCGGCCGA TCACAACCCG ACCGTGGACT1500
GGTGAATTCG TCCGTTGGAC CGAACCACGG TTGGTGGCAT GGCCTTGA 1548
(2)SEQ ID No.7的信息
(i)序列特征
(A)長度485個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型肽
(xi)序列描述SEQ ID No.7
(A)長度485個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型肽
(xi)序列描述SEQ ID No.7
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly His Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys
385 390 395 400
Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Ala Gly Gly Ser Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Ser Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Asn Lys
48權利要求
1.α-淀粉酶變體，其中所述的變體具有α-淀粉酶活性，并按SEQ IDNO3的編號方式包含179位和180位氨基酸的缺失，并且其中所述的變體與SEQ ID NO3或嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶具有至少95％的同源性。
2.權利要求1的變體，其中所述的變體按SEQ ID NO3的編號方式，進一步包含349位和428位的氨基酸的半胱氨酸的替換。
3.權利要求1的變體，其中所述的變體衍生自親本嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶。
全文摘要
本發明公開了一種親本α－淀粉酶的變體，該親本α－淀粉酶(i)具有選自分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的氨基酸序列；或(ii)和這些氨基酸序列中的一種或多種顯示出至少80％的同源性；和/或顯示出與由抗具有這些氨基酸序列之一的α－淀粉酶產生的抗體的免疫交叉反應性；和/或由與編碼具有這些氨基酸序列之一的α－淀粉酶之DNA序列相同的探針雜交的DNA序列編碼；在這種變體中(a)至少一種所說的親本α－淀粉酶的氨基酸殘基已被缺失；和/或(b)至少一種所說的親本α－淀粉酶的氨基酸殘基已被一種不同的氨基酸殘基取代；和/或(c)相對親本α－淀粉酶而言至少有一種氨基酸殘基已被插入；所說的變體具有α－淀粉酶活性并且相對于親本α－淀粉酶表現出至少一種下列性質增加的熱穩定性；增加的氧化穩定性；降低的Ca2+依賴性；其條件是所說的變體的氨基酸序列不與分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之任一相同。
文檔編號C12N15/00GK1624124SQ200410088019
公開日2005年6月8日 申請日期1996年2月5日 優先權日1995年2月3日
發明者H·比斯加德-佛蘭茨, A·斯文森, T·V·伯切爾特 申請人:諾沃奇梅茲有限公司