獲取間質干細胞的方法

專利名稱：：獲取間質干細胞的方法
技術領域：
：本發明涉及研發，細胞生物學、分子生物學以及遺傳學領域。尤其特殊地，本發明涉及從胚胎干細胞中獲取間質干細胞的方法。
背景技術：
：與分化細胞不同，干細胞具有分裂以及自我更新或分化成表型和功能不同子細胞的能力(KellerGenesDev.2005；191129-1155；WobusandBoheler，PhsysiolRev.2005；85635-678；Wiles，MethodsinEnzymology.1993；225900-918；Choietal，MethodsMolMed.2005；105359-368)。鼠胚胎干細胞(ESCs)的多能性以及它們分化成來自所有三個胚層(threegermlayers)的能力使得胚胎干細胞成為用于再生性治療多種疾病和組織損傷的理想細胞源(Keller，GenesDev.2005；191129-1155；WobusandBoheler，PhysiolRev.2005；85635-678)。然而，胚胎干細胞的這種特別的性質也帶來獨特的挑戰，即需要足量并同質性地產生用于治療特定疾病或組織損傷的合適細胞類型以保證治療效果，并抑制對組織修復和再生有害的其它細胞類型的產生。目前，既可以強化胚胎干細胞向特定細胞系分化和/或富集特定組織細胞類型的方法過于低效并且一般會產生導致腫瘤發生的異質細胞群體(Keller，GenesDev.2005；191129-1155；WobusandBoheler，PhysiolRev.2005；85635-678)。有關于治療肌肉骨骼損傷、在心血管疾病方面提高心功能以及改善GVHD嚴重性的療效的書面證據(LeBlancandPittenger，2005)表明間質干細胞(MSCs)是多能干細胞。作為限制性細胞系，它們具有受限地但卻高水平地分化成間質細胞類型的潛能，例如脂肪細胞、軟骨細胞以及骨細胞，而其形成畸胎瘤的風險是微不足道的。宿主對移植MSCs的免疫排異通常可以通過自體同源或異源移植來規避。MSCs可以從幾種成體組織包括骨髓(BM)、脂肪組織(ad)、臍帶血中分離出來并在體外擴增。然而，用于擴增它們的組織的可獲得性是有限的并且需要采用有風險的侵入方法，而且體外培養雖然是重要的，但仍然是有限的。可替換的MSCs來源是不受限制地供應可無限擴增且多能的人體胚胎干細胞(hESCs)，其也可以排除具有潛在性風險的侵入性技術。如果hESC細胞系變得足夠大的話，宿主對源自hESC的MSCs(hESC-MSC)的免疫排斥性就可以通過治療性克隆所產生的自體同源性hESCs或免疫兼容的異源性hESCs來規避。之前已經描述過從hESC中分離MSC或MSC樣細胞。Barberi，等(2005)PloSMed2，e161公開了一種方法，其包括在挑揀占細胞總群數50％的CD73+細胞之前，hESCs與鼠OP9細胞在血清存在的條件下共培養40天。Xu，C.等.(2004)干細胞22，972-80描述一種方法，該方法包括用表達hTERT(Xu等)的逆轉錄病毒感染源自胚胎的hESCC。然而，這些方法的關鍵組成部分即外源DNA的病毒感染、在鼠細胞中的暴露以及血清的使用引入了不可接受的致腫瘤和xenozootic感染的風險，因而在臨床應用中排除使用這些MSCs。本發明試圖解決現有技術中的方法所存在上述以及其它問題。
發明內容根據本發明，正如權利要求中所提出的，我們提供了間質干細胞(MSC)、間質干細胞系、分化的間質干細胞、獲取這些細胞的方法以及這些細胞的應用。優選實施方式列于在權利要求中并且在說明書中作了描述。除非另有指出，本發明的實際操作采用傳統化學技術、分子生物學、微生物學、重組DNA以及免疫學，它們都屬于本領技術人員的能力。這些技術在文獻中有解釋。參考，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，以及T.Maniatis，1989，MolecularCloningAlaboratoryManual，SecondEdition，Books1-3，ColdSpringHarborlaboratorypress；Ausubel，F.M.etal(1995andperiodicsupplements；CurrentProtocolsinMolecularBiology，ch.9，13，and16，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，andA.Kahn，1996，DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques，JohnWiley&Sons；J.M.PolakandJamesO`D.McGee，1990，OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach，IrIPress；D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg，1992，MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology，AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManualPortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow，DavidLane，EdHarlow(1999，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ISBN0-87969-544-7)；AntibodiesALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor)，DavidLane(Editor)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ISBN0-87969-314-2)，1855；andLabRefAHandbookofRecipes，Reagents，andOtherReferenceToolsforUseattheBench，EditedJaneRoskamsandLindaRodgers，2002，ColdSpringHarborLaboratory，ISBN0-87969-630-3。這些工具書每份都通過參考方式結合在本文中。圖1A-1GhESC-MSC培養物的特性表現。圖1A相襯下的細胞形態學。圖1BhESC-MSC中多能性相關基因的表達。通過基于Taqman的定量RT-PCR來測量轉錄水平并將其標準化為hESC的水平。HESC的轉錄水平源自HuES9和H1hESC細胞系的平均值。圖1CHuES9和H1hESC，HuES9.E1，HuES9.E3和H1.E2hESC-MSC培養物以及E14鼠ESC細胞系中多能性相關基因的免疫蛋白印跡分析(Westernblotanalysis)。圖1D腎包膜下移植HuES9和HuES9.E1。在移植HuES9.E1(上部)或HuES9(底部)4個月之后，石蠟包埋并對腎切片進行H&E染色。圖1E人體HuES9ESC細胞系、鼠E14ESC細胞系、鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養層以及HuES9.E1的堿性磷酸酶活性。圖1F用PCR法對人Alu和鼠c-mos重復序列做基因組DNA分析。圖1GHuES9.E1的染色體G顯帶分析(上圖)和光譜核型分析(SKY)(中圖)。下圖顯示了9號染色體臂間畸變。圖2A-2B用FACS分析法展現表面抗原的表達譜。圖2A對HuES9.E1HuES9.E3和H1.E2hESC-MSCs，HuES9hESCs，以及鼠胚胎成纖維飼養層細胞進行染色并用WinMDI軟件在CyanLX(DakoNorthAmerica，Inc.，Carpinteria，CA)儀器上進行分析。通過把相同樣本量的細胞和異型配對的鼠單克隆抗體進行溫育的方法來測定非特異性熒光。圖2B在用FACS法分析BM-MSCs之前，HuES9.E1和HuES9.E3hESC-MSCs在含血清的BM-MSC培養基中傳代兩次。圖3A-3CHuES9.E1細胞的分化。采用標準方法誘導HuES9.E1細胞經歷成脂肪細胞、成軟骨細胞、成骨細胞的分化的過程。圖3A脂肪細胞分化.i)在誘導向脂肪細胞分化后14天，用油紅對細胞油滴進行染色；ii)在7天和14天時用Taqman定量RT-PCR法測定PPARγmRNA。所有測定值標準化為HuES9.E1的量；iii)用Taqman定量RT-PCR所測定的PPARγmRNA在HuES9和HIhESCs、源自它們的MSC細胞培養物(HuES9.E1、HuES9.E3及H1.E2)以及源自成體組織的MSCs(BM-MSC和ad-MSC)中的相對水平。所有值都以HuES9.E1的量為準進行標準化。圖3B成軟骨細胞分化i)在誘導向成軟骨細胞分化21天后，用愛爾新藍(alcianblue)(左邊)對細胞中的蛋白多糖進行染色并采用基于HRP的可視化分析法檢測對骨膠原II型的免疫反應；ii)用在7天和14天時用Taqman定量RT-PCR法測定Aggrecan和PPARγmRNA。所有值都以HuES9.E1的量為準進行標準化；iii)用Taqman定量RT-PCR所測定的PPARγmRNA在HuES9和HIhESCs、源自它們的MSC細胞培養物(HuES9.E1、HuES9.E3及H1.E2)以及源自成體組織的MSCs(BM-MSC和ad-MSC)中的相對水平。所有值都以HuES9.E1的量為準進行標準化。圖3C成骨細胞分化i)在誘導向成骨細胞分化21天后，用vonKossa染色劑對細胞進行染色使其礦化，ii，iii)在第7天和14時用Taqman定量RT-PCR測定骨特異性堿性磷酸酶(ALP)和骨涎蛋白(BSP)mRNA。所有值都以HuES9.E1的量為準進行標準化。圖4A-4D基因表達分析。圖4A對3種由HuES9.E1，HuES9.E3和H1.E2所構成的hESC-MSC培養物，3種BMMSC樣品，3種ad-MSC樣品以及3種由HuES9、H1和H3s3所構成的hESC細胞系中所表達的基因進行聚類分析。圖4B對hESC-MSCs和BMMSCs(左邊)之間以及hESC-MSCs和hESCs(右邊)之間的基因表達作兩兩對比。圖4ChESC-MSCs和BM-MSCs的通常所表達的基因進行分析(＜2倍差異)。采用Panther分類系統根據生物學過程對該基因進行分類。如果生物學過程顯著性高于或低于代表物(p＜0.01)，則通過把每個生物學過程所觀測到的基因頻率與包括23481個基因的NCBIH.人類(H.sapiens)基因數據庫中的基因頻率進行比較。對顯著性高于或低于代表物的過程進行分組并圖示。圖4DhESC-MSCs和BM-MSCs中差異性表達基因(＞2倍差異)的分析。對通過基因在hESC-MSCs和BM-MSCs中高度表達的顯著性高于或低于代表物(p＜0.01)生物學過程進行分組并圖示。圖5A-5DhESC-MSCs傳代與否的分類。圖5AFACS分析HuES9.E1，HuES9.E3和H1.E2hESC-MSCs，對HuES9hESCs以及鼠胚胎成纖維飼養細胞進行染色并用WinMDI軟件在CyanLX(DakoNorthAmerica，Inc.，Carpinteria，CA)儀器上分析是否存在CD24。通過把相同的細胞試樣和異型配對的鼠單克隆抗體進行溫育來確定非特異性熒光。圖5B對經過胰蛋白酶消化并在添加了PDGF及FGF2的無飼養層培養基中增殖一周的HuES9細胞中的CD105+、CD24-細胞進行分類，。挑選在Q4中表達的CD105+、CD24-細胞進行培養。圖5C兩兩比較Q4.1與其它名為Q4.2-Q4.5的各種Q4培養物的基因表達。圖5D兩兩比較所有Q4培養物和由HuES9.E1，HuES9.E3和H1.E2所組成的hESC-MSCs的基因表達，并對所有Q4培養物和BM-MSCs兩兩進行比較；e)Q4.3的SKY分析。圖6HuES9.E1條件培養基中的蛋白質分析。80％融合的HuES9.E1細胞培養物用PBS洗滌3次，在由不含酚紅并添加了ITS、5ng/mlFGF2，5ng/mlPDGFAB谷氨酸鹽-青霉素-鏈霉素以及β-巰基乙醇的DMEM培養基所組成的化學合成培養基中培養過夜。該培養物隨后用PBS洗滌3次，然后用新鮮的合成培養基進行替換。在0，24，48和72小時時間移取培養基樣液，500g離心并對上清液作0.2μ微孔過濾。10μl培養基在4-12％SDS-PAGE中分離并作銀染。圖7抗體陣列。根據操作指南(RayBioNorcross，CA)把1ml合成(CM)或非合成(NCM)培養基和細胞因子抗體陣列一起進行培養。實施例中列出了每個陣列的抗體圖。配體與特異性抗體之間的結合可以通過基于HRP的化學發光分析進行肉眼觀測。對各膜的不同曝光度進行了分析。按照是否在與CM雜交的膜上出現了信號而在與NCM雜交的膜上沒有產生信號對抗原進行打分。對4個獨立的CM和NCM批次所作的分析數據概括在實施例中。圖8201個基因產物在生物學過程中的分布。這201個基因在GO分裂系統中被分配到不同的生物學過程中。分泌基因組的基因頻率相對于Unigene、Entrez和基因庫歸類的數據庫中基因的頻率而言是過度呈現，p值＜0.05的58種生物學過程被分成3個主要的組別代謝，防御性響應以及組織分化。圖9把201基因產物分布到多個途徑中。這201個基因在GO分裂系統中被分入不同的途徑中。分泌基因組的基因頻率相對于Unigene、Entrez和基因庫歸類的數據庫中基因的頻率而言是過度呈現，p值＜0.05的30種生物學過程被分成幾個主要的類別受體結合、信號傳導、細胞-細胞間相互作用、細胞遷移、免疫應答以及代謝。具體實施例方式從hESCs中獲取間質干細胞(MSC)或MSC樣細胞的現有方法包括把人端粒逆轉錄酶(hTERT)基因轉染到正在分化的hESCs(Xu等，2004)或者和鼠op9細胞系進行共培養(Barberietal.，2005)。在這些分化方法中使用外源性遺傳物質和鼠細胞引入了不可以接受的致腫瘤風險或被xenozootic感染性試劑感染的風險。相反的，我們的方法提供了臨床相關并可重復的用于從正在分化的hESCs中分離類似或相同(優選同源的)MSC群體的操作方法。總體上，我們的方法包括把胚胎干細胞(ES)集落分散成多個細胞，隨后涂布這些細胞并增殖。這些細胞在沒有共培養物的條件下，在不含血清的具有成纖維生長因子2(FGF2)的培養基中進行增殖，以便獲取間質干細胞(MSCs)。因此，我們的方法不需要血清，不需要使用鼠細胞或遺傳操作，并且所需的操作和時間更少，因而是高度升級的(highlyscalable)。實施例描述了從兩個不同的hESC細胞系HuES9和H-1，也可以是第三種細胞系，Hes-323中分離MSCs，并闡述了本方法的穩健性。通過本方法所獲取的人ES細胞分化的MSCs(hESC-MSCs)以及本文所描述的組分與骨髓分化的MSCs(BM-MSCs)相當類似。在優選實施方式中，胚胎干細胞培養物包括人胚胎干細胞(hESC)培養物。在一個實施方式中，生成間質干細胞的方法包括在對CD105+CD24-進行挑選之前，用胰蛋白酶消化并在沒有飼養層的添加有FGF2和可選的PDGF的培養基中增殖hESCs。在優選實施方式中，該方法包括在沒有飼養層的情況下在添加有FGF2以及可選的PDGFAB的培養基中增殖一周后從經胰蛋白酶消化的hESCs中挑選CD105+，CD24-細胞，這可以導致生成hESC-MSC細胞培養物，其中至少部分，優選基本上全部，更優選所有細胞彼此之間都是類似的或者相同的(優選同源的)。本文所描述的用于生成臨床相關的并在實體、生物學以及功能上都類似于BM-MSCs的hESCMSC培養物的方法可以潛在地緩和用于分離BM-MSCs的BM的限制供應，所述BM-MSCs已經在許多臨床和臨床前的動物研究中表現出了治療效果10，25。它也可以免除了所需要的有風險的BM抽吸過程，減少了每個患者等待時間以及制備BM-MSCs的費用，并減少了批次間的差異。此外，從諸如hESC之類的有限細胞類型中高水平地分化MSCs為研究和更好地理解MSC的分化過程和生物學提供了有用的模式，雖然其目前在臨床和臨床前有著廣泛的應用，但其分化過程和生物學仍舊是一個謎。由本方法所產生的間質干細胞的其它應用包括取代臨床或治療應用中的成體組織源性MSCs；替換用于作諸如人ESCs等其它細胞類型增殖、臍帶血或骨髓干細胞群體擴增飼養層的成體組織源性MSCs；以及制備用于治療心血管疾病的MSC合成培養基。胚胎干細胞集落的消化我們用于產生間質干細胞的方法包括把胚胎干細胞集落分散或消化成細胞。胚胎干細胞集落可能包括huES9集落(CowanCA，KlimanskayaI，McMahonJ，AtienzaJ，WitmyerJ，etal.(2004)Derivationofembryonicstem-celllinesfromhumanblastocysts.NEnglJMed3501353-1356)或者H1ESC集落(ThomsonJA，Itskovitz-EldorJ，ShapiroSS，WaknitzMA，SwiergielJJ，etal.(1998)EmbryonicStemCellLinesDerivedFromHumanBlastocysts.Science2821145-1147)。優選地，集落中的細胞被消化或分散至相當的程度，也就說至少成為細胞團。更優選地，集落被消化或分散成相當的程度即集落中的細胞是單個的，也就是說，該集落完全消化。消化可以通過分散劑來實現。分散劑可以是能夠使集落中至少一些細胞相互之間分開的任何物質。該分散劑優選包括破壞集落中細胞間粘連，或者破壞細胞和基質之間粘連的試劑。優選地，該分散劑包括蛋白酶。在優選實施方式中，該分散劑包括胰蛋白酶。胰蛋白酶消化可以例如在大約37℃下持續3min左右。隨后在被接種之前對這些細胞進行中和、離心并重懸于培養基中。在優選實施方式中，本方法包括用胰蛋白酶分散人胚胎干細胞的培養板并接種細胞(platingthecellout)。消化包括至少下列步驟順序中的一部分抽吸、洗滌、胰蛋白酶消化，溫育，移取，終止，重新接種并將試樣等分。下列方法改編自HedrickLab，UCSanDiego(http:\\hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)。在吸取過程中，把培養基從容器中抽吸或者一般是移取出來，例如燒瓶。在洗滌步驟中，用例如5-10ml體積的緩沖介質對細胞進行洗滌，優選不含Ca2+和Mg2+的介質。例如，這些細胞可以用不含鈣和鎂的PBS進行洗滌。在胰蛋白酶消化步驟中，往容器中添加一定量的分散劑，并搖動容器以使分散劑溶液覆蓋生長的表面。例如，可以往燒瓶中添加1ml溶于Hank`s平衡鹽溶液中的胰蛋白酶。在溫育步驟中，細胞在預定溫度下保留一定時間。例如細胞可以在37℃下保留幾分鐘(例如2-5分鐘)。在移取步驟中，細胞可以通過機械作用來移取，例如通過刮取或用手擊打容器壁。這些細胞成片脫落并從表面上滑下來。在終止步驟中，往燒瓶中加入一定體積的培養基。該培養基優選含有中和試劑以停止分散劑的作用。例如，如果分散劑為諸如胰蛋白酶之類的蛋白酶，那么培養基中就含有諸如血清蛋白之類的蛋白，其可以消除蛋白酶的活性。在特定實施例中，往燒瓶中添加了3ml含有細胞培養基的血清以補足4ml的體積。用吸管吸取這些細胞以便分開或分散這些細胞。在再接種(re-sending)步驟中，細胞被接種到新鮮的培養皿中并添加新鮮培養基。大規模的接種可以以不同的比例進行。例如，細胞可以1/15和1/5的稀釋度進行重新接種。在一個特定實施例中，細胞接種可以通過添加1滴細胞液到25cm2燒瓶中以及添加3滴細胞液到另一燒瓶中來實現從而接種培養物，并且隨后往每個燒瓶，例如75cm2的燒瓶中添加7-8ml培養基以提供1/15和1/5的稀釋度。在等分試樣步驟中，細胞可以等份分入新的培養皿中或者以任何期望的比例分配，并添加培養基。細胞培養物的維持消化的細胞可以細胞培養物的形式接種并維持。細胞可以接種在培養容器或諸如膠狀板之類的基質上。非常重要地，細胞在不存在共培養物，例如沒有飼養層細胞的情況下生長并增殖。細胞培養物中的細胞在不含血清的培養基中生長，其中添加了一種或多種諸如成纖維生長因子2(FGF2)以及可選擇的源自血小板的生長因子AB(PDGFAB)之類的生長因子，濃度為例如5ng/ml。如果通過胰蛋白酶消化、洗滌并再接種(replating)后細胞培養物中的細胞是融合性的，則細胞優選是分裂的或者是1∶4次培養的。不存在共培養物在高度優選的實施方式中，我們的方法包括在沒有共培養物的情況下對細胞進行培養。詞語“共培養物”是指兩種或多種不同種類一起生長的細胞的混合物，例如基質飼養層細胞。由此，在典型的ES細胞培養物中，培養皿內表面通常覆蓋有鼠胚胎干細胞飼養層，其已經通過處理因而不會分裂。飼養層提供粘著表面以使ES細胞貼壁并生長。此外，飼養層細胞把營養因子釋放到ES細胞生長所需的培養基質中。在本文所描述的方法和組分中，ES和MSC細胞在沒有該共培養物的情況下進行培養。優選地，細胞被培養成單層或在沒有飼養層細胞的情況進行培養。根據本方法的優選實施方式，胚胎干細胞在沒有飼養層細胞的情況下進行培養以便生長出間質干細胞(MSC)。在優選實施方式中，分離或消化的胚胎干細胞被直接接種在培養基質上。該培養基質包括組織培養容器，流入Petri培養皿。該容器經過預處理的。在優選實施方式中，細胞被接種在膠狀組織培養板上并在其上生長。下面是制作明膠鋪底的培養板的一個示例性方法。制備0.1％的凝膠蒸餾水溶液并高壓滅菌。其可以在室溫下保存。在組織培養皿的底部覆蓋明膠溶液并溫育5-15min。除去明膠，然后培養皿就可以使用了。培養基應當在加入細胞前添加以防止低滲溶解。不含血清的培養基分離或解決的胚胎干細胞在培養基中培養，該培養基優選是不含血清的培養基。詞語“不含血清的培養基”包括不含血清蛋白的細胞培養基，例如胎牛血清。不含血清的培養基是現有技術中已知的，并在例如美國專利5,631,159和5,661,034中作了公開。不含血清的培養基可以從例如Gibco-BRL(Invitrogen)處商業獲得。不含血清的培養基可以是不含蛋白的，其中沒有蛋白，水解物以及未知其組成的成分。不含血清的培養基可以包括其中的所有成分都具有已知化學結構的化學合成培養基。不含血清的化學合成培養基是有利的，因為它提供了完全限定的系統，其排除了變量使重現性得以提高并具有更可靠的性能，而且減少了被外來試劑所污染的可能性。在優選實施方式中，不含血清的培養基包括KnockoutDMEM培養基(Invitrogen-Gibco，GrandIsland，NewYork)。不含血清的培養基中可以添加有一種或多種諸如血清替換培養基之類的成分，濃度例如為5％、10％、15％等。不含血清的培養基優選添加有10％的來自Invitrogen-Gibco(GrandIsland，NewYork)的血清替換培養基。生長因子培養分開或消化胚胎干細胞的不含血清的培養基包括一種或多種生長因子。許多生長因子是已知的，包括PDGF，EGF，TGF-a，FGF，NGF，(促)紅細胞生成素，TGF-b，IGF-I以及IGF-II.在優選實施方式中，生長因子包括成纖維細胞生長因子2(FGF2)。該培養基也可以包括其它生長因子，例如源自血小板的生長因子AB(PDGFAB)。這些生長因子是現有技術中已知的。在高度優選的實施方式中，該方法包括在含有FGF2和PDGFAB這兩種生長因子的培養基中培養細胞。FGF2是廣譜促有絲分裂、血管生成以及神經營養性的因子，其在多種組織和細胞類型中低濃度表達而在大腦及垂體中則可以達到高濃度。FGF2已經涉及到多種生理和病例過程，包括肢體發育，血管生成，傷口愈合以及腫瘤生長。FGF2可以商業獲得，例如從Invitrogen-Gibco(GrandIsland，NewYork)。源自血小板的生長因子(PDGF)是多種細胞類型的潛在促細胞分裂劑，包括成纖維細胞，平滑肌，結締組織。PDGF，其由名為鏈A和鏈B兩條鏈的二聚體構成，能以AA或BB同型二聚體或AB異型二聚體存在。人PDGF-AB是由13.3kDa的A鏈和12.2kDa的B鏈所組成的25.5kDa同型二聚體蛋白。PDGFAB可以商業獲得，例如從Invitrogen-Gibco(GrandIsland，NewYork)。生長因子(多種生長因子)，優選FGF2以及可選擇的PDGFAB，優選以約100pg/ml，約500pg/ml，約1ng/ml，約2ng/ml，約3ng/ml，約4ng/ml，最優選約5ng/ml的濃度存在于培養基中。該培養基也可以包括PDGFAB，優選濃度5ng/ml。分裂細胞培養物中的細胞一般會持續生長直到融合，此時接觸抑制會導致細胞分裂和生長的停止。該細胞隨即從基質或燒瓶中被分離出來，然后通過稀釋到組織培養基中并移植的方式來“分裂”，次級培養或傳代。本文所描述的方法以及組合物因而可以包括傳代，或在培養期間的分裂。優選地，細胞培養物中的細胞以1∶2或更大的比例，優選1∶3，或者更優選1∶4，1∶5或更大比例分裂。詞語“傳代”指包括取細胞系融合培養物試樣，接種到新鮮培養基中，并培養細胞系直至得到融合或飽和。選擇，篩選或挑選步驟在高度優選的實施方式中，本方法進一步包括選擇或挑選步驟，以便進一步分離或選擇間質干細胞。選擇或挑選步驟包括通過一種或多種表面抗原標記物的方式從細胞培養物中選擇間質干細胞(MSC)。采用選擇或挑選步驟進一步加強了特異性挑選或選擇MSCs的嚴格性而且潛在地減少了源自初始材料的hESCs以及其它hESC胚胎干細胞可能的污染。這樣隨后還進一步減少了畸形瘤形成的風險以及進一步增加本文的方法的臨床相關性。許多基于抗原表達的選擇或挑選方法是已知的，并且任何這些方法都可以用于本文的選擇或挑選步驟。在特別優選的實施方式中，選擇或挑選可以通過激發熒光的細胞挑選(FACS)方式來實現。這樣，根據已有技術，FACS包括把細胞暴露在報告物質中，例如標記抗體，該標記抗體結合并標記由細胞所表達的抗原。生產抗體及對其進行標記以形成報告物質的方法是已知的，并在例如HarlowandLane中有所描述。細胞然后通過FACS儀，它基于標記把細胞彼此挑選出來。我們已經明白雖然已知有大量候選表面抗原與MSCs相關，例如CD105，CD73，ANPEP，ITGA4(CD49d)，PDGFRA，但某些MSC相關表面抗原例如CD29和CD49e在諸如hESCs之類的ES細胞中也有表達，并且它們的表達可通過FACs分析來證實。表面抗原與MSCs的相關性并不足以把該抗原定性為用來從諸如hESC之類的ES細胞中分離MSCs的選擇性標記物。由此，選擇或挑選步驟優選采用在MSCs和ES細胞之間區別性表達的抗原。我們的方法中的選擇或挑選步驟可以基于抗原的表達來陽性選擇間質干細胞。該抗原可以通過例如實施例中所描述的hESCs和hESCMSCs基因表達譜的對比來識別。在特定實施方式中，所述選擇或挑選可以特定地利用下表E1A和E1B中所示的任何抗原。在優選實施方式中，我們的方法中的選擇或挑選步驟可以基于確定在MSCs上表達而不在諸如hESCs中表達的ES細胞抗原的表達來陽性選擇間質干細胞。這樣，按照實施例中所示，我們證實CD73在MSCs3中有高度表達，而在hESCs(圖4A)上沒有高度表達。此外，根據實施例證實CD73和CD105兩者都是在MSCs中有高度表達的抗原并且屬于與hESC相比在hESC-MSCs中表達量居前20位的高表達抗原(圖3，表格)，使用CD73或CD105(或兩者)作為推定MSCs的選擇性標記物，在hESCs分化所產生的推定MSCs的挑選中是等效的。可替換地，或者另外地，選擇或挑選步驟可以否定性選擇基于在諸如hESCs的胚胎干細胞(ES細胞)中高度表達而在例如hESC-MSC中沒有高度表達的相反抗原。選擇或挑選可以基于已知或先前確定的諸如MIBP、ITGB1BP3和PODXL22和CD24之類的hESC-特異性表面抗原。實施例表明FACS分析證實CD24在hESC上有表達而在hESC-MSCs上不表達。因此，CD24可以單獨用作否定性選擇或挑選標記物，或者和陽性標記物CD105一起來挑選由hESC培養物分化而來的推定MSCs。重要地，間質干細胞能夠維持自身更新而無需轉化。由此，例如，已知諸如與腫瘤細胞之類的無限生長分化的細胞或腫瘤細胞系融合之類的轉化處理，用諸如SV40、EBV、HBV、或HTLV-1之類的轉化病毒對細胞系進行病毒感染，用諸如含有大T抗原的SV40載體(R.D.Berry，Br.J.Cancer，57，287-289，1988)之類的特定合適載體所進行的轉染，端粒酶(Bodnar-A-Getal，Science(1998)279；p349-52)或者含有人乳頭瘤病毒DNA序列的載體(美國專利5,376,542)，顯性致癌基因的引入，或者突變等等因而在本文所描述的制備間質干細胞的方法中都是不需要的。在優選實施方式中，間質干細胞和細胞系(或源自其的分化細胞)不會展示出一種或多種胚胎干細胞的特征。優選這些特征包括表達OCT4基因以及堿性磷酸酶活性。優選地，間質干細胞表現出一種或多種多能性特征性標記物表達的減少。這些多能性標記物在下面有進一步的描述，僅包括Nanog，BMP4，FGF5，Oct4，Sox-2以及Utf1。由本文所述方法制備的間質干細胞優選是非腫瘤基因的。優選地，如果該間質干細胞被植入免疫損傷或免疫缺陷宿主動物，相比于導致腫瘤形成的親代胚胎干細胞，其不會導致腫瘤形成。優選地，免疫損傷或免疫缺陷宿主動物是SCID鼠或Rag1-/-鼠。優選地，在接種延長期之后間質干細胞不會形成腫瘤，優選大于兩周，更優選大于兩月，最優選大于9個月。具體的致腫瘤測試方法描述于實施例中。本方法制備的間質干細胞也優選展示一種或多種下列特性。優選在細胞培養基中維持至少10代時，它們具有基本穩定的染色體組型，這通過染色體數來評估。它們也優選表現出基本穩定的代與代之間的基因表達模式。我們通過此所表達的意思是在這一代間質干細胞和下一代干細胞之間所選一組基因中的一段或多段，優選基本上所有基因的表達水平都不會發生明顯變化。優選地，基因組包括下列基因中的一個或多個，亞群，或全部cerberus(基因庫登錄號NM_009887，AF031896，AF035579)，FABP(基因庫登錄號NM_007980，M65034，AY523818，AY523819)，Foxa2(基因庫登錄號NM_010446，X74937，L10409)，Gata-1(基因庫登錄號NM_008089，X15763，BC052653)，Gata-4(G基因庫登錄號NM_008092，AF179424，U85046，M98339，AB075549)，Hesx1(基因庫登錄號NM_010420，X80040，U40720，AK082831)，HNF4a(基因庫登錄號NM_008261，D29015，BC039220)，c-kit(基因庫登錄號NM_021099，Y00864，AY536430，BC075716，AK047010，BC026713，BC052457，AK046795)，PDGFRα(NM_011058，M57683，M84607，BC053036)，Oct4(基因庫登錄號NM_013633，X52437，M34381，BC068268)，Runx1(基因庫登錄號NM_009821，D26532，BC069929，AK051758)，Sox17(基因庫登錄號NMJ)11441，D49474，L29085，AK004781)，Sox2(基因庫登錄號NM_011443，U31967，AB108673)，Brachyuiy(NM_009309，X51683)，TDGF1(基因庫登錄號NM_011562，M87321)andTie-2(基因庫登錄號NM_013690，X67553，X71426，D13738，BC050824)。本文所述方法既能夠產生分化細胞也可產生間質干細胞，其包括間質干細胞的克隆后代。詞語細胞的“克隆后代”是指基本不經任何轉化處理或基因替換的細胞后代。不經實質性基因改變的克隆后代與親代細胞或祖細胞，優選胚胎干細胞(保留減弱的潛能)的基因基本相同。詞語“間質干細胞”也應當優選包括源自間質干細胞的細胞系，即間質干細胞系，反之亦然。祖細胞的獲得在優選實施方式中，本文所述方法進一步采取了選擇或篩選間質干細胞的步驟。該進一步的步驟可以發生在上述步驟之前，在該兩步驟之間或在這些步驟之后。該進一步的步驟實際上可以是獨立發生的，并特異性地分化一種或多種來自ES細胞的祖細胞或細胞系。我們因而公開了一種分化間質干細胞的替換方法。該方法包括(a)提供胚胎干細胞(ES)；并(b)建立來自胚胎干細胞的祖細胞系；其中祖細胞系是基于自我更新的能力來選擇的。然而，優選的，這幾種方法可以一起采用。由此，例如，我們的方法包括在分散步驟或增殖步驟之前，期間，或之后從胚胎干細胞中分化祖細胞或祖細胞系。這樣，該方法例如可以包括通過提供由分散胚胎干細胞集落所獲得的細胞或者其子代細胞的方法來獲取間質干細胞(MSC)，從胚胎干細胞中分化一種或多種祖細胞或祖細胞系并在沒有共培養物的情況下在不含血清但含FGF2的培養基中增殖細胞。優選地，基于其自我更新的能力來選擇祖細胞系，或者該方法可以基于缺乏自我更新能力，或者同時采用上述兩種方法來選擇排除體細胞。在優選實施方式中，在沒有共培養物的情況下，優選在沒有飼養層細胞的情況下，構建祖細胞系。優選地，在沒有共培養物的情況下選擇排除胚胎干細胞。在優選實施方式中，構建祖細胞系而不進行轉化。該祖細胞系可以通過把胚胎干細胞或其子代細胞暴露在可以促進推定的祖細胞自我更新的條件下構建。優選地，促進自我更新的條件阻礙胚胎干細胞的增殖。促進自我更新的條件可以包括在豐富培養基中進行生長。更優選地，促進自我更新的條件包括在沒有LIF的情況下生長細胞。優選地，促進自我更新的條件包括連續傳代過程。優選地，自我更新的條件包括至少12次連續傳代。在優選實施方式中，祖細胞系相對于胚胎干細胞具有減小的潛力。優選地，祖細胞系是譜系限制的，優選非多能性的。優選地，祖細胞系是不會致腫瘤形成的。優選地，分化祖細胞系的步驟包括把胚胎干細胞暴露在加強分化成特定譜系的條件中。優選地，加強分化的條件包括從胚胎干細胞中產生胚胎。優選地，在多能性消失后把細胞從加強分化的條件中移離。優選地，從譜系限制性促進條件中移除細胞包括消化類胚體。優選，該方法包括消化已經生長了約3-6天之間的類胚體。在優選實施方式中，祖細胞系表現出減弱表達或基本不表達OCT4和堿性磷酸酶活性兩者中的一者或兩者。優選地，祖細胞系相對于其所來源的胚胎干細胞系表現出多功能性標記物的減弱表達，多功能性標記物優選從下列組中選擇Nanog，BMP4，FGF5，Oct4，Sox-2和Utf1。在優選實施方式中，祖細胞系表現出一種多種下列特性(a)可以在細胞培養物中維持大于40代；(b)在細胞培養物中維持至少10代時具有基本穩定染色體組型或染色體數目；(c)代與代之間具有基本穩定的基因組型。優選地，祖細胞系在移植到受體動物中時基本不誘導畸形瘤的形成，受體動物優選免疫損傷受體動物，優選3周以后，更優選2-9個月之后。優選地，胚胎干細胞或祖細胞系是哺乳動物，優選鼠或人胚胎干細胞或祖細胞系。優選地，祖細胞系包括內皮細胞祖細胞系，優選E-RoSH細胞系。可替換地，或另外地，祖細胞系可以包括間質祖細胞干細胞，優選huES9.E1細胞系。在一些實施方式中，該方法進一步包括步驟(d)從祖細胞系中獲取分化細胞。優選地，在分化之前祖細胞系增殖至少5代。我們提供從胚胎干細胞(ES)中生成分化細胞，該方法包括(a)從胚胎干細胞中獲取祖細胞系；(b)增殖祖細胞系；以及(c)從祖細胞系中獲取分化的細胞。提供了一種方法，其包括(a)提供胚胎干細胞(ES)；(b)從胚胎干細胞中獲取祖細胞；以及(c)從祖細胞中構建祖細胞系，其中基于其自我更新的能力選擇祖細胞。該方法特定地用于從胚胎干細胞(ES)中產生分化細胞。優選地，分化的細胞是內皮細胞或間質細胞。更優選地，分化的細胞是脂肪細胞或骨細胞。我們提供由根據本發明任何前述方面的方法所產生的祖細胞系。本為所描述的方法和組成也可以進一步包括其它步驟，其中采用該MSCs的其它因素或特性來進行選擇或篩選或者既選擇又篩選。定向分化在優選實施方式中，產生源自胚胎干細胞并具有特定譜系的祖細胞系的方法優選進一步包括第一步驟，即使得胚胎干細胞定向地向特定期望的譜系或感興趣的譜系分化。本發明的方法也可以包括第二步驟，即促進推定祖細胞的自我更新以及阻礙胚胎干細胞的增殖。第一個步驟可以包括促進感興趣的特定細胞系的生長或增殖。不同的感興趣的特定細胞系的祖細胞系可以通過把細胞暴露在促進那樣感興趣的細胞系發生分化環境中來制得。例如，可以把胚胎干細胞暴露在諸如促進或啟動分化的生長因子或小分子中。由此，本文所描述的用于構建源自胚胎干細胞的具有特定譜系的細胞系優選包括加強胚胎干細胞向特定細胞系分化的步驟。優選地，在預定時期內實行該加強分化的步驟。因而，優選地，胚胎干細胞或它們的子代細胞過渡性地暴露在加強分化的環境中。加強或定向分化的方法的選擇決定于感興趣的特定細胞系，感興趣的細胞系是為了制備期望的祖細胞。本領域技術人員可以意識到不同的細胞可使用各種不同的方法。內胚層祖細胞在期望胚胎干細胞向內胚層組織定向分化的地方，例如，形成類胚體并消化(見后文)。該消化的類胚體可以暴露在誘導內胚層分化的生長因子或藥物及其組合物中。該生長因子和藥物的例子包括激活素A，FGF4，地塞米松以及維甲酸。造血祖細胞和內皮祖細胞另一方面，在期望胚胎干細胞向造血細胞系或內皮細胞系定向分化的地方，消化類胚體可以暴露在誘導造血細胞或內皮細胞分化的生長因子或藥及其組合物中。這類生長因子和藥物包括GM-CSF，G-CSF，SCF，PDGF，IL-3，(促)紅細胞生成素，TNFa以及雷帕霉素。心臟中胚層祖細胞以及成肌祖細胞另一方面，在期望胚胎干細胞向心臟中胚層細胞系以及成肌細胞系定向分化的地方，消化的類胚體可以暴露在可以誘導心臟中胚層細胞以及成肌細胞分化的生長因子或藥物及其組合物中組合物中。這類生長因子和藥物的例子包括地塞米松，PPARγ抑制劑以及睪丸激素及其類似物。第二步驟包括把分化細胞接種在豐富培養基中。在該實施方式中，連續增殖可以選擇性地富集隨即就可以克隆的祖細胞。類胚體的形成在一些實施方式中，加強分化的步驟包括從胚胎干細胞形成類胚體。類胚體，及其制備方法是已知的。詞語“類胚體”是指由懸浮液中胚胎干細胞生長所產生的培養物中的球狀克隆體。類胚體是混合細胞類型的，并且特定細胞類型的分布和出現時間與在胚胎中所觀測到的一樣。優選地，類胚體是通過把胚胎干細胞接種到半固體培養基中產生的，優選在Limetal，Blood.1997；901291-1299中所描述的甲基纖維素培養基。優選地，該類胚體的年齡在3-6天之間。在該實施方式中，類胚體是消化的，也就是把組成細胞相互分離開，例如通過膠原酶或胰蛋白酶消化，以便從譜系限制性促進環境中移離出來。優選實施方式中的方法包括選擇用于分化期望特定譜系的推定祖細胞的步驟。該選擇步驟可以基于細胞形態，或通過標記物的表達等方式來實施。基因表達譜或抗原表達譜也可以用于選擇特定期望譜系的祖細胞。隨后對該用于期望特定譜系的推定祖細胞進行培養，或者之后立即實施其它選擇步驟。在優選實施方式中，在加強分化的步驟之后把分化細胞暴露在促進自我更新的推定祖細胞并阻礙胚胎干細胞增殖的環境中。該環境可以優選包括在沒有共培養物或飼養層細胞的環境中進行培養。豐富培養基可替換地，或者另外地，該環境包括接種到培養基中。本文所用的詞語“豐富培養基”是指營養豐富的培養基。優選地，該培養基包括相關細胞生長所必需的營養物。優選地，該豐富培養基含有血清。更優選地，其包括基本上所有的該生長所必需的營養物。最優選地，該豐富培養基支持、促進和有阻于相關細胞的生長。在高度優選的實施方式中，相關細胞是感興趣的祖細胞或推定祖細胞。豐富培養基的例子是含有4500mg/lD-葡萄糖并添加有20％胎牛血清、非必需氨基酸、L谷氨酸以及β-巰基乙醇的DMEM。在優選實施方式中，該豐富培養基不包括其它促進或有助于胚胎干細胞生長的生長調節劑或激素，例如白血病抑制因子(LIF)根據該實施方式，持續的增殖可以選擇性富集隨后能夠被克隆的祖細胞。在培養基中長期維持優選地，本文所述方法包括培養胚胎干細胞或它們的子代細胞超過一代。優選地，培養細胞大于5，大于10，大于15，大于20，大于25，大于50，大于40，大于45，大于50，大于100，大于200，大于500或者大于800代。特別地，細胞系可以維持1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，35，40，45，50，75，100，200，500或更多代。培養物中的細胞一般會持續生長直到融合，此時接觸抑制會導致細胞分裂和生長的停止。該細胞隨后從基質或燒瓶中被分離出來，以及通過稀釋到組織培養基中并重新接種的方式進行“分裂”或傳代。祖細胞由此可以在培養期間被傳代或分裂；優選它們以1∶2或更大的比例，優選1∶3，更優選1∶4，1∶5或更大比例。詞語“傳代”指包括獲取細胞系的融合培養物，接種到新鮮培養基中，并培養細胞系直至實現融合或飽和。然而基于它們自我更新的能力，根據本方法所得的祖細胞可以維持許多代。另一方面，已經明確直接源自生物體的“正常”(也就是未轉化的體細胞)細胞是無限生長分化的。用另外的話說，該體細胞在培養物(它們是無限生長分化的)中具有有限的壽命。它們不會無限連續生長，而是在一定次數的傳代后最終會失去增殖或分裂的能力。在達到“急變期”該細胞在約50代后死亡。由此，該體細胞僅可以有限次的傳代。重要地，祖細胞能夠維持自我更新而無需轉化。由此，例如，已知諸如與腫瘤細胞之類的無限生長分化的細胞或腫瘤細胞系融合，用諸如SV40、EBV、HBV、或HTLV-1之類的轉化病毒對細胞系進行病毒感染，用諸如含有大T抗原的SV40載體(R.D.Berry，Br.J.Cancer，57，287-289，1988)之類的特定合適載體所進行的轉染，端粒酶(Bodnar-A-Getal，Science(1998)279；p349-52)或者含有人乳頭瘤病毒DNA序列的載體(美國專利5,376,542)，顯性致癌基因的引入，或者突變之類的轉化處理因而在本文所描述的制備間質干細胞的方法中都是不需要的。根據本文所述方法的優選實施方式，祖細胞可以在不用轉化的情況下增殖超過50代。在優選實施方式中，作為祖細胞系和祖細胞可以不受限制地增殖而無需轉化。祖細胞和祖細胞系相對于它們的親代胚胎干細胞優選是譜系限制性的。特殊地，它們不能形成所有3個胚層。在高度優選的實施方式中，原始細胞系優選是非多能性的。祖細胞的特性在優選實施方式中，祖細胞和細胞系(或源自它們的分化細胞)不會展示出一種或多種胚胎干細胞的特性。優選這些特征包括表達OCT4基因以及堿性磷酸酶活性。優選地，祖細胞表現出一種或多種多能性特征性標記物表達的減少。這些多能性標記物在下面有進一步的描述，僅包括Nanog，BMP4，FGF5，Oct4，Sox-2以及Utf1。用本文所述方法制備的祖細胞優選是非致腫瘤發生的。優選地，相對于會導致腫瘤發生的親代胚胎干細胞的接種，祖細胞在被接種到免疫損傷或免疫缺陷宿主動物中時不會導致形成腫瘤。優選地，免疫損傷或免疫缺陷宿主動物時SCID鼠或Rag1-/-鼠。優選地，祖細胞在接種延長期中不會形成腫瘤，優選地大于2周，更優選大于2個月，最優選大于9個月。具體的致腫瘤發生的測試方法描述于實施例中。通過本文所述方法制備的祖細胞也優選表現出一種或者多種下列特性。優選在細胞培養物中維持至少10代時，它們具有基本穩定的染色體組型，其通過染色體數目來評估。它們也優選表現出基本穩定的代與代之間的基因表達模式。我們通過此所表達的意思是在這一代間質干細胞和下一代干細胞之間所選一組基因中的一段或多段，優選基本上所有基因的表達水平都不會發生明顯變化。優選地，基因組包括下列基因中的一個或多個，亞組，或全部cerberus(基因庫登錄號NM_009887，AF031896，AF035579)，FABP(基因庫登錄號NM_007980，M65034，AY523818，AY523819)，Foxa2(基因庫登錄號NM_010446，X74937，L10409)，Gata-1(基因庫登錄號NM_008089，X15763，BC052653)，Gata-4(基因庫登錄號NM_008092，AF179424，U85046，M98339，AB075549)，Hesx1(基因庫登錄號NM_010420，X80040，U40720，AK082831)，HNF4a(基因庫登錄號NM_008261，D29015，BC039220)，c-kit(基因庫登錄號NM_021099，Y00864，AY536430，BC075716，AK047010，BC026713，BC052457，AK046795)，PDGFRα(NM_011058，M57683，M84607，BC053036)，Oct4(基因庫登錄號NM_013633，X52437，M34381，BC068268)，Runx1(基因庫登錄號NM_009821，D26532，BC069929，AK051758)，Sox17(基因庫登錄號NM_011441，D49474，L29085，AK004781)，Sox2(基因庫登錄號NM_011443，U31967，AB108673)，Brachyury(NM_009309，X51683)，TDGF1(基因庫登錄號NM_011562，M87321)andTie-2(基因庫登錄號NM_003690，X67553，X71426，D13738，BC050824)。本文所述方法使祖細胞和祖細胞系的生產和分化的細胞一樣成為可能，其包括祖細胞的克隆子代。詞語細胞的“克隆子代”是指基本不經任何轉化處理或基因替換的細胞的子代。該沒有經歷實質性基因組改變的克隆子代與親代細胞，或祖細胞，優選胚胎干細胞(保留減弱的潛能)的基因基本相同。詞語“祖細胞”也優選包括源自祖細胞的細胞系，也就是親代細胞系，反之亦然。自我更新和分化的調節劑本發明的方法也用于識別推定自我更新或分化的調節劑。該方法包括實施描述用來存在或不存在候選分子的條件下產生祖細胞系或分化細胞，并識別該分子的存在對過程是否有影響的方法。例如，加速祖細胞或分化細胞產生的分子可以被用作分化過程的陽性調節劑(或者可替換地作為自我更新的抑制劑)。相反地，妨礙該過程的分子可以被認為是分化的抑制劑或自我更新促進劑。在優選實施方式中，我們也提供所選細胞系的細胞，優選祖細胞，其可根據本方法獲得。迄今為止，祖細胞的制備對于要確定是否任何所選細胞都是祖細胞而言是過于復雜的。采用根據本發明中能夠提供基本100％純祖細胞配制品的培養物，可以實現單個祖細胞的分離。我們在優選實施方式中進一步提供包括大量細胞的組合物，其中主要細胞是所選譜系的祖細胞。優選地，至少60％的細胞是所選譜系的祖細胞。更優選地，至少60％的細胞是祖細胞。此外，本發明提供分離的祖細胞。詞語細胞系優選指能夠在培養物中維持并生長且表現出無限生長分化或無限壽命的細胞。本文所述方法可以和降低mTOR活性相組合以促進分化，這公開于US60/609,216中，其以參考的方式結合在本文中。祖細胞的使用本發明的方法能夠產生各種類型的祖細胞和細胞系。例如，我們公開了制備外周血祖細胞(PBPC)、神經祖細胞、造血祖細胞、骨髓祖細胞、骨髓成體細胞，骨骼肌祖細胞、胰島祖細胞、間葉細胞祖細胞、心臟中胚層干細胞、肺上皮祖細胞、肝臟祖細胞，以及內胚層祖細胞的方法。根據本文所述方法所制備的祖細胞可以用于各種商業的重要研究，診斷，以及治療目的。這些用法總體上是本領域所公知的，因而僅在本文中作大概描述。例如，干細胞可用于為再生性治療而制備祖細胞群。祖細胞可以通過體外擴增的方法來制備或直接施用給患者。它們也可以用于外傷造成的損毀組織的再生。由此，造血祖細胞可用于骨髓更換，而心臟祖細胞則可用于心臟衰竭的患者。皮膚祖細胞可用于培育患者移植用皮膚，而內皮祖細胞可用于諸如支架或人造心臟之類的人工修復術的內皮化。胚胎干細胞和組織干細胞衍生物可用作治療諸如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病等用的祖細胞的來源。干細胞，例如可以用作癌癥免疫療法所用NK或枝狀細胞的祖細胞的來源，祖細胞可通過本文所述方法或組合物來制備。確信的是本文所述方法和組合物使祖細胞的生產成為可能，其當然可以采用現有技術中的已知方法來進行分化。由此，任何分化細胞的使用都等同于伴隨著那些用作細胞來源的祖細胞。本方法所制備的祖細胞和本文的組合物可以用于疾病的治療，或用于制備治療疾病的藥物組合物。該疾病可以包括可通過再生性療法進行治療的疾病，包括心力衰竭，骨髓疾病，皮膚疾病，燒傷，糖尿病、阿爾茨海默病病、帕金森病等退行性疾病以及癌癥。我們因此描述了疾病治療方法，包括(a)提供胚胎干細胞(ES)；(b)從胚胎干細胞構建祖細胞，祖細胞干細胞基于其自我更新的能力從胚胎干細胞中得以選擇；(c)可選擇地從祖細胞干細胞系中獲取分化細胞；以及(d)把祖細胞系或分化細胞施用于病人。所獲得的MSCs的特性通過本文所述方法和組成所得的MSCs優選滿足通常用于識別MSCs9的形態、顯性和功能標準，這是現有技術中已知的。為了便于引用，由本文所述方法和組成所獲得的間質干細胞，特別是源自人胚胎干細胞的，可以是指“hESC-MSCs”。由此，通過本文所述方法和組合所得的MSCs可以優選表現出一種或多種間質干細胞的形態學特性。例如，所獲得的MSCs可以形成具有成纖維表型的粘著單層。進一步地，所得的MSCs優選表現出與間質干細胞類似或相同的表面抗原表達譜。由此，所得的MSCs的表面抗原表達譜可以包括CD29+、Cd44+、CD49a以及e+、CD105+、CD166+以及CD34-、CD45-9-11中的一種或多種，優選所有。利用現有技術中的已知方法和下面的方法，可以把所獲得的MSCs化成任何間葉細胞系。由此，通過本文的方法和組合所獲得的MSCs表現出包括成脂肪、成軟骨和成骨分化潛能。所述獲得的間質干細胞，例如，hESC-MSCs，在體內具有基本的增殖能力。在一些實施方式中，所得的間質干細胞經過至少10個群體倍增的同時維持正常的雙倍體染色體組型。優選地，然而，MSCs能夠經歷至少20-30個群體倍增的，同時維持維持正常的雙倍體染色體組型。在優選實施方式中，在整個這段時間中MSCs表現出穩定的基因表達和表面抗原表達譜。優選地，所得的MSCs不會表現出任何缺陷，例如基因表達中的染色體畸變和/或改變。在優選實施方式中，該缺陷是不明顯的直到10代以后，優選13代，更優選15代以后。HESC-MSC基因組實施例描述了用來分析源自MSCs(hESC-MSCs)的人ESC基因組的實驗。根據實施例7-15所示，hESC-MSCs具有和源自成體骨髓的MSCs(BM-MSCs)類似的表達譜。這些結果表明用我們的方法所得的MSCs和源自它們骨髓的類似物具有明顯的生物學類似性，例如，在分泌旁分泌因子方面。由此，hESC-MSCs可以用于BM-MSCs所適用的任何目的。我們進一步提供了通過hESC-MSCs培養物所合成的培養基。該合成培養基包含hESC-MSCs分泌的分子，包括201個獨特的基因產物。該合成培養基和包括其中的任何分子的組合，特別地包括蛋白質或多肽，可以用于增加或替換hESC-MSCs的活性，其目的在于例如治療或防止疾病。hESC-MSCs的基因組分析顯示所表達的蛋白參與了3種生物學過程代謝，防御響應以及組織分化，包括血管形成、造血細胞生成以及骨骼成長。由此，hESC-MSCs可以用于治療這些功能在其中發揮一定作用的疾病，或者對其所進行的修復或治療，包括任何一種或多種這些生物學過程。類似地，hESC-MSCs所表達的蛋白，單個或組合，優選以合成培養基的形式，被用于補充或代替hESC-MSCs的活性，其目的在于例如治療或防止這類疾病。hESC-MSCs的201種基因產物顯示于激活心臟血管生物學、骨骼成長以及造血細胞形成中重要信號途徑，例如Jak-STAT、MAPK、Toll樣受體、TGF-beta信號和mTOR信號途徑。因此，hESC-MSCs及其所表達蛋白等，可以用于防止或治療涉及任何這些信號途徑的或者其病因涉及一種或多種這些信號途徑缺陷的疾病。進一步地，任何一種或多種由所述MSCs所分泌的蛋白，包括以合成培養基的形式，可用于與所述BM-MSCs所針對的相同目的。HESC-MSCs也可以用作任何由它所分泌或表達的蛋白的來源，這列于實施例10-14中，尤其是在本文的列表中。我們因而提供了在任何實施例10-14中所示的產生多肽的方法，該方法包括按照獲取所述間質干細胞，培養間質干細胞并從間質干細胞中分離多肽，優選從間質干細胞所生長的培養基中分離。同源性在優選實施方式中，由所述方法產生的間質干細胞本質上是類似或相同的(優選是同源的)。這也就是說，用該方法所分離的間質干細胞(MSC)集落相互之間表現出高度類似或一致性，無論是在表型或是其它方面。相似性或一致性可通過多種方法來測定并通過一種或多種特性來測量。在優選實施方式中，集落在基因表達上是相似或相同的。優選地，該方法是一種通過其所選擇的任何兩種或多種間質干細胞表現出基本相同或相似的基因表達譜的方法，也就是說，所表達基因的一致性和其表達水平的組合。優選地，基本上所有分離的間質干細胞都表現出基本相同或相似的基因表達譜。基因表達的同源性可以用多種方法來測量。優選地，全基因組基因的表達是通過例如實施例的抽提RNA的陣列雜交來實施的。可以抽提總RNA并轉化成cDNA，其和含有來自相關基因組的大量基因序列的芯片雜交。優選地，該陣列包括NCBI參考序列(RdefSeq)基因，其為經生物技術信息國家中心工作者與合作者基于現行標準確認、注釋并治愈的特征基因。隨后采用分析軟件對樣品之間的基因表達進行對比。在優選實施方式中，基因表的相似性和一致性被表示成“相關系數”。在該測量中，兩種樣品之間的高相關系數表示兩種樣品之間的基因表達模式的高度相似性。相反地，兩種樣品之間的低相關系數表示兩種樣品之間基因表達模式的的相似性。標準化的實施可以在數據分析之前消除系統誤差或偏差(包括密度偏差、空間偏差、板偏差以及背景偏差)。相關性測試是現有技術中已知的并包括T檢驗和Pearson`s檢驗，這在例如Hill，T.&Lewicki，P.(2006).StatisticsMethodsandApplications.Statsoft，Tulsa，OK，ISBN1884233587(同樣是Statsoft，Inc.(2006)。ElectronicStatisticsTextbook.Tulsa，OKStatsoft.WEBhttp://www.statsoft.com/textbook/stathome.html)。可以參考Khojastehetal，2005，AstepwiseframeworkforthenormalizationofarrayCGHdata，BMCBioinformatics2005，6274.AnIntra-classcorrelationcoefficient(ICC)也可以實施，這描述于Khojastehetal，supra中。在優選實施方式中，進行Pearson`s檢驗以生成Pearson`s相關系數。相關系數1.0表示相同的基因表達類型。在優選實施方式中，cDNA被雜交到SentrixHumanRaf-8表達珠芯片(ExpressionBeadChip)上并用IlluminaBeadstation500x掃描。優選地，抽提數據，標準化并采用IlluminaBeadStudio(Illumina，Inc，SanDiego，CA，USA)進行分析。然而讀者容易明白任何合適的芯片和掃描硬件和軟件(其輸出相關性測量值)可以用于分析基因表達譜的相似性。優選地，任何兩種優選通過上述方式所測得的分離物基因表達相關系數大于0.65，優選大于0.85，更優選大于0.90，最優選大于0.95。在一些實施方式中，所述方法產生的間質干細胞是這樣的，所獲取任何兩種或多種間質干細胞分離物之間的基因表達相關系數與相同RNA樣品的技術性復制子之間的相關系數相同或略小一點，其中技術性復制在相隔一段時期后實施，例如相隔1個月。在另一個實施方式中，任何兩種或多種間質干細胞分離物之間的相關系數大于0.9，優選大于0.95。優選地，對于經歷上述選擇或挑選程序的細胞而言，基因表達相關系數在這樣的范圍內。優選地，主要分離物之間的基因表達相關系數，優選所有分離物，落在這樣的范圍內。由此，根據實施例所示，相關系數顯示所獲的5種間質干細胞之間具有高度相似性，其中4種細胞系之間的相關系數為0.96，其中1種為0.9；相對地，在相隔一個月時間所進行分析的RNA樣品技術性復制子之間的相關系數在0.97和0.98之間。因此，我們提供了產生相互之間基本類似或相同的(優選同源的)間質干細胞。分離物優選表現出幾乎相同的基因表達譜。和上述“內”同質性(也就是用所述方法獲得的MSCs分離物之間的同質性)一樣，這些分離物和其它細胞或細胞類型中間的同質性也可以被評估。特別地，與用其它方法獲得的間質干細胞進行了比較，例如來自骨髓的間質干細胞(BM-MSCs)。在優選實施方式中，用本方法所得的MSCs與組合顯示出與BM-MSC類似的，或同源，或者一致的基因表達譜。由此，所獲得的MSCs顯示出比BM-MSCs的基因表達相關系數大于0.5，優選大于0.6，優選大于0.7。由此，按照實施例所示，可以發現3種獨立獲取的hESC-MSC群和3種單獨的BM-MSC樣品具有類似的相關系數0.72。間質干細胞形成的調節劑我們的方法也可用于識別推定的從胚胎干細胞中形成間質干細胞的調節劑。該方法包括在存在或不存在候選分子的情況下實施所述用于產生間質干細胞的方法，以及識別該分子的存在對該過程是否產生影響。例如，加速間質干細胞繁殖的分子可用作間質干細胞形成的陽性調節劑。相反地，阻礙該過程的分子可被認為是間質干細胞形成的抑制劑。在優選實施方式中，我們也提供了根據該方法所能獲得的細胞，優選間質干細胞。迄今為止，間質干細胞的制備既復雜，表型又基本不相似或相同(例如，關于基因表達)，還因為它們用包括共培養或存在血清的方法來生產因而不適用于臨床目的。利用根據本發明的培養物，其可以提供幾乎100％純種的間質干細胞制劑，它們相互之間是類似的或相同的(優選同源的)。此外，我們描述了分化細胞的生產過程，該方法包括通過所述方法獲取間質干細胞，并分化成間質干細胞。例如，我們提供分化成脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞等細胞的方法。我們進一步提供可用該方法獲得的分化的細胞。也提供用該間質干細胞和分化的細胞所制備的細胞系。詞語細胞系優選指能夠在培養物種維持并生長并表現出無限生長分化或永生的細胞。本文所述方法可以和mTOR活性的降低相組合以促進分化，這公開于US60/609,216中，其以參考的方式結合在本文中。應用本文所述方法和組合可用于上調細胞間葉細胞樣或內皮標記物的表達。它們也可以或者替代地用于下調干細胞或細胞多能性的表達。本文所述方法和組合可以用于識別能夠促進或阻礙干細胞自我更新或分化的試劑。該方法包括在存在候選分子的情況下實施根據任何前述權利要求的方法，并在其后確定效果。本方法所述方法和組合也生產祖細胞系或分化的細胞，其可用于疾病的治療，或用于制備治療疾病的藥物組合物，該疾病包括下述任何一種可通過再生性療法進行治療的疾病、心力衰竭、骨髓疾病、皮膚病、燒傷、諸如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病等退行性疾病以及癌癥。根據本文所述方法制備的間質干細胞和分化的細胞可以用于各種商業性重要研究、診斷以及治療目的。這些應用一般都是現有技術所公知的，僅在此作大概描述。例如，干細胞可以用于產生再生性治療目的間質干細胞和分化的細胞群。間質干細胞和分化的細胞可以通過體外擴增的方法來制備或者直接給患者施用。他們也可以用于外傷損毀組織的再生。由此，脂肪細胞或脂肪可以從此可用于軟骨修復而骨細胞則可用于骨頭的修復。用本文所述方法和組合所獲得的間質干細胞可以分化成這些類型并用于的目的。胚胎干細胞及其組織干細胞衍生物可用作用于治療例如糖尿病阿爾茨海默病、帕金森病等退行性疾病的間質干細胞和分化細胞的來源。干細胞，例如可用作分化成癌癥免疫性治療用的NK或枝狀細胞的間質干細胞和分化細胞的來源，間質干細胞和分化的細胞可以用本文所述方法和組合來制備。可以確定本文所述方法和組合使生產間質干細胞成為可能，采用現有技術中已知的方法必然可以對所述間質細胞進行分化。由此，分化細胞的任何應用都同樣適用于那些用作分化細胞來源的間質干細胞。本文所述方法和組合所生成的間質干細胞和分化的細胞可以用于疾病的治療，或用于制備治療疾病的藥物組合物，該疾病包括下述任何一種可通過再生性療法進行治療的疾病、心力衰竭、骨髓疾病、皮膚病、燒傷、諸如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病等退行性疾病以及癌癥。我們因此描述了治療疾病的方法包括(a)提供胚胎干細胞(ES)；(b)由胚胎干細胞來構建間質干細胞系，其中該間質干細胞通過分散胚胎干細胞(ES)集落，或其子代細胞來獲得，并在沒有共培養物的情況下在不含血清而含有FGF2的培養基種增殖細胞；(d)可選地，從間質干細胞系中獲取分化的細胞；以及(e)給患者施用間質干細胞系或分化的細胞。該培養基可選地含有PDGFAB。我們的方法一般可用于上調細胞的間葉細胞樣或內皮標記物。選擇性地，或者額外地，它們可以用于下調干細胞或細胞多能性標記的表達。我們進一步提供根據前述發明任何方面的用于生成治療或制備治療下述一種疾病的藥物的祖細胞系或分化細胞的方法可用再生性療法治療的疾病、心力衰竭、骨髓疾病、皮膚病、燒傷、諸如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病等退行性疾病以及癌癥。我們也提供了用根據本發明前述方面的方法所生成的分化細胞。分化細胞分化細胞，例如終末分化的細胞，可用從根據所述方法制備的間質干細胞或細胞系中獲取。我們因此公開了用于生成分化細胞的方法，該方法包括生成所述間質干細胞或細胞系，并從這些細胞中獲取分化的細胞。用本文所述方法制備的間質干細胞可以分化成任何這些細胞類型或用于所述目的。根據本發明的方法制備的分化細胞可以包括任何或所有下列細胞i)脂肪細胞功能性脂肪或脂肪組織細胞類型，其發現于整個身體中，尤其在皮膚下面。脂肪細胞為調節能量、熱量以及緩沖機械沖擊而儲存和合成脂肪。ii)心肌細胞心臟的功能性肌細胞類型，其允許連續而有節律的跳動。iii)軟骨細胞為關節、耳道、氣管、會厭軟骨、喉、椎骨和肋骨末端之間的椎間盤制造軟骨的功能性細胞類型。iv)成纖維細胞體內大多數組織中所發現的連接或支持細胞。成纖維細胞提供了有意的支持平臺以幫助特定組織的功能性細胞正確地工作。v)肝細胞消除代謝廢物毒素、破壞血紅細胞并回收它們的組成成分以及用于血漿蛋白的合成的功能性細胞類型。vi)造血細胞造血的功能性細胞。造血細胞發現于成體骨髓。在胎兒中，在肝臟、脾、骨髓以及在子宮中圍繞胎兒的支持組織中發現造血細胞。vii)肌細胞肌肉功能性細胞類型。viii)神經細胞專用于傳導沖動的大腦功能性細胞類型。ix)成骨細胞負責制造骨骼的功能性細胞類型。x)胰島細胞胰腺的功能性細胞，其負責分泌胰島素、胰高血糖素、促胃液素以及生長激素抑制因子。同時，這些分子調節包括碳水化合物的代謝、血糖水平以及向胃中分泌酸液等多種過程。間質干細胞以及分化細胞的應用根據本文所述的方法制備的祖細胞系及分化細胞和本文所述組合物可用于各種重要的商業研究、診斷以及治療目的。例如，為分化的細胞群可用于制備分化表型特異性的抗體和cDNA文庫。培養、純化及修飾抗體的一般技術和它們在免疫檢測中的用途以及免疫分離方法在HandbookofExperimentalImmunology(Weir&Blackwell，eds.)；CurrentProtocolsinImmunology(Coliganetal，eds.)；andMethodsofImmunologicalAnalysis(Masseyeffetal.，eds.，WeinheimVCHVerlagsGmbH)中公開了。而涉及mRNA和cDNA文庫制備的一般技術則在RNAMethodologiesALaboratoryGuideforIsolationandCharacterization(R.E.Farrell，AcademicPress，1998)；cDNALibraryProtocols(Cowell&Austin，eds.，HumanaPress)；andFunctionalGenomics(Hunt&Livesey，eds.，2000)中公開了。相對的同源細胞群特別適用于藥物篩選和治療性應用。祖細胞系和分化細胞的這些及其它應用在下文以及本文的其它部分中作了進一步描述。祖細胞系和分化細胞可特定的用于制備治療疾病的藥物組合物。這類疾病包括可通過再生性療法進行治療的疾病，包括心力衰竭、骨髓疾病、皮膚病、燒傷、諸如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森疾病等退行性疾病以及癌癥。如實施例所示，通過本文所述方法以及組合物所制得的間質干細胞具有與骨髓源性間質細胞(BM-MSCs)類似或相同的性質。因此，間質干細胞及其任何分化細胞都可以用于BM-MSCs的已知應用中，或者用于可能用到它們的地方。藥物篩選根據本文所述方法制得的祖細胞系和分化細胞和本文所述組合物也可以用于篩選因子(例如溶劑、小分子藥物、肽、多聚核苷酸等等)或影響分化細胞特征的環境條件(例如培養條件或操作)。在某些應用中，祖細胞系和分化細胞被用于篩選促進成熟或促進這類細胞在長期培養中表達及維持的因子。例如，候選成熟因子或生長因子可通過把它們添加到處于不同孔中的祖細胞或分化細胞中，然后根據進行進一步培養所期望的標準來確定任何所導致的表型變化并利用這些細胞。進一步地，祖細胞系和分化細胞的基因表達譜可用于識別在這些細胞中特異性或高表達的受體、轉錄因子及信號分子。特異性配體、受體的小分子抑制劑或激動劑、翻譯因子以及信號分子都可以用于調節祖細胞系和分化細胞的分化和性質。特定的篩選應用涉及藥物研究中藥物化合物的測試。讀物一般是指標準教科書“InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch”，AcademicPress，1997以及美國專利5030015)，以及本文其它地方關于藥物篩選的一般性描述。候選藥物化合物的評估通常包括把分化細胞和候選化合物混合在一起，確定由該化合物所導致的細胞形態學、標記物表型或代謝活性改變(與未經處理或與經無效化合物處理的細胞進行對比)，然后把化合物作用與所觀測到的改變相關聯。進行篩選可以是因為，例如該化合物被設計成具有對特定細胞類型由藥理作用，或者是因為被設計成具有其它作用的化合物可能具有意想不到的副作用。兩種或更多種藥物可以組合起來進行檢測(通過同時或依次的方式來進行組合)以便檢測可能的藥物和藥物之間的相互作用。在某些應用中，化合物最初被篩選是因為其潛在毒性(Castelletal.，pp.375-410“InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch”，AcademicPress，1997)。對細胞毒性的檢測首先可以通過細胞生活力、生存力、形態學已經特定標記物、受體或酶的表達或釋放。藥物對染色體DNA的作用能夠通過測量DNA合成或修復的方法來進行檢測。[3H]胸腺嘧啶或BrdU結合物，尤其在細胞循環中不定期的，或高于細胞復制所需水平，與藥效一致。副作用也可能包括非正常速率的姊妹染色單體交換，其通過雜交分裂相(metaphasespread)來進行測定。讀物可參考A.Vickers(PP375-410“InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch”AcademicPress，1997)以獲取更詳盡的描述。組織再生根據本文所述方法和組合所獲得的間質干細胞和分化細胞也可以用于需要進行該治療的人類患者的組織重構或再生。細胞以被允許移植到企望組織點的方式進行使用并重構或再生功能缺陷區域。例如，本文所述方法和組合物可以用于調節干細胞的分化。祖細胞系及分化的細胞可用于組織工程，例如皮膚移植的生長。干細胞分化的調節可用于人工器官或組織的生物工程化，或用于修復學，例如支架。癌癥根據本文所述方法獲得的祖細胞系及分化細胞和本文所述的組合物可以用于癌癥的治療。詞語“癌癥”和“癌癥”是指或描述哺乳動物中以不受調節的細胞生長為典型特征的生理狀態。癌的例子包括但不限于惡瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤以及白血病。這類癌的更特殊的例子包括鱗片狀細胞癌、小細胞肺癌、肺小細胞肺癌、胃癌、胰腺癌、諸如成膠質細胞瘤和神經纖維瘤病之類的膠質細胞腫瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、涎腺癌、腎癌(kidneycancer)、腎癌(renalcancer)、前列腺癌、外陰腫瘤、甲狀腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)以及各種類型的頭部和頸部癌。其它例子為固定的腫瘤癌癥，包括結腸癌、乳腺癌、肺癌，以及前列腺癌、包括白血病和淋巴瘤的惡性血液病、Hodgkin`s病、再生障礙性貧血、皮膚癌及類似的腺瘤息肉病。其它例子還包括腦瘤、直腸瘤、乳腺腫瘤、子宮頸瘤、眼腫瘤、肝腫瘤、肺腫瘤、胰腺腫瘤、卵巢腫瘤、前列腺瘤、皮膚瘤、睪丸腫瘤、贅生物、骨腫瘤、滋養層腫瘤、輸卵管腫瘤、直腸瘤、結腸腫瘤、腎臟腫瘤、胃部腫瘤以及甲狀旁腺腫瘤。乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、直腸癌、肺癌、惡性黑色素瘤、白血病、淋巴癌、卵巢癌、宮頸癌以及膽道癌也包括在內。根據本文所述方法和組合所獲得的間質干細胞及分化細胞也可用于和抗癌藥物的組合，例如內皮抑素和血管抑制素或者細胞毒性藥物或化療藥物。例如，諸如阿霉素、柔毛霉素、順鉑、足葉乙甙、紫杉醇、泰索帝及生物堿。例如長春新堿、諸如甲氨蝶呤之類的抗代謝物。此處所用的詞語“細胞毒性藥物”是指抑制或防止細胞功能和/或導致細胞破壞的物質。該詞語試圖包括放射性同位素(例如I、Y、Pr)、化療藥物、以及諸如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒劑或其片段之類的毒素。同樣地，該詞語包括腫瘤基因產物/酪氨酸激酶抑制劑，例如WO94/22867中公開的雙環安沙霉素類(bicyclicansamycins)、EP600832中公開的1，2-bis(arylamino)benzoicacid衍生物、EP600831中公開的6，7-diamino-phthalazin-1-one衍生物、或者是抑制酪氨酸與含SH2基質蛋白的肽(例如參見WO94/07913)。“化療藥物”是用于治療癌癥的化合物。化療藥物的例子包括阿霉素(adriamycin)、多比柔星(Doxorubicin)、5-氟脲嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、環磷酰胺、噻替派、白消安、細胞毒素、紫杉醇、甲氨蝶呤、順鉑、美法侖、長春堿、爭光霉素、足葉乙甙、VP-16、長春瑞濱、卡鉑、替尼泊、柔紅霉素、洋紅霉素、氨甲喋呤、放線菌素、絲裂霉素、煙酰胺、埃斯培拉霉素(參見美國專利4,675,187)、美法侖以及其它相關氮芥以及內分泌治療(例如二乙基己烯雌酚(DES))、三苯氧胺、LHRH拮抗劑、黃體酮、抗黃體酮等等)。干細胞如本文中所使用的，詞語“干細胞”是指一種細胞面臨兩種分化選擇子代細胞與種細胞相同(自我更新)或者它們可以是更特殊細胞類型的祖細胞(分化)。因此干細胞能夠適應一種或其它途徑(其它途徑存在于能夠形成每種細胞類型中的一種的地方)。干細胞因此是非終末分化且能夠產生其它細胞類型的細胞。本文所指的干細胞可以包括全能干細胞、亞全能干細胞、以及多能干細胞。全能干細胞詞語“全能”細胞是指具有變成成體組織中任何細胞類型或者變成胚外膜(例如胎盤)的細胞。由此。受精卵和由其分裂所產生的大約前4代細胞是僅有的全能細胞。亞全能干細胞“亞全能干細胞”是真正的干細胞，其具有產生任何體內分化細胞的潛能。然而，它們并不能有助于產生源自滋養層的胚外膜。已經發現了幾種類型的亞全能細胞。胚胎干細胞胚胎干細胞(ES)可以從胚胞的內細胞群(ICM)中分離而得，胚泡為移植發生時胚胎發育的階段。胚胎生殖細胞胚胎生殖細胞(EG)可以從流產胎兒性腺前體中分離而來。胚胎癌細胞胚胎癌細胞(EC)可以從畸形惡瘤中分離得到，畸形惡瘤時偶然發生于胎兒性腺的腫瘤。與前兩種不同，它們通常是異倍體。所有這三種類型的亞全能干細胞僅能從胚胎或胎兒組織中分離得到并在培養基中培養生長。防止這些亞全能細胞進行分化的方法是現有技術中已知的。成體干細胞成體干細胞包含各種類型，其包括神經、皮膚以及血形成干細胞，這些干細胞是骨髓移植中的活性活性成分。這些后面的幾種干細胞類型也是源自臍帶干細胞的主要部分。雖然細胞類型的精確數目受到所選干細胞類型的限制，但是成體干細胞可以在實驗室或體內發育成熟并形成功能性的、更特定的細胞類型。多能干細胞多能干細胞是真正的干細胞，但其僅能分化成有限種細胞類型。例如，骨髓就含有分化成所有血細胞但無法分化成其它細胞類型的多能干細胞。多能干細胞發現于成體動物中。可以認為體內每個器官(腦、肝)都含有它們，在其中它們能夠替換死亡或受損細胞。表征干細胞的方法是現有技術中已知的，其包括采用諸如克隆分析、流式細胞分析、長期培養以及分子生物學技術，例如PCR、RT-PCR及印跡雜交法(Southernblotting)等標準分析方法。除了形態學區別，人和鼠科動物的亞全能干細胞在它們的細胞表面抗原(干細胞標記物)表達上有所不同。識別包括階段特異性胚胎抗原1和4(SSEA-1和SSEA-4)及腫瘤排斥抗原1-60及1-81(TRA-1-60、TRA-1-81)在內的干細胞標記物抗體可以通過商業方式獲取，例如從ChemiconInternational，Inc(Temecua，CA，USA)。這些抗原的利用單克隆抗體的免疫檢測法已經廣泛地用于表征亞全能干細胞(ShamblottM.J.et.al.(1998)PNAS9513726-13731；SchuldinerM.etal.(2000).PNAS9711307-11312；ThomsonJ.A.et.al.(1998).Science2821145-1147；ReubinoffB.E.et.A1(2000).NatureBiotechnology18399-404；HendersonJ.K.etal.(2002).Stemcells20329-337PeraM.et.al.(2000).J.CellScience1135-10)。干細胞來源各種類型的干細胞，其可以包括下列非限制性例子，可以用于本文所述用于生長祖細胞、祖細胞系及分化細胞的方法與組合物中。美國專利5,851,832報道了從腦組織中獲取的多能神經干細胞。美國專利5,766,948報道了從新生腦半球中獲取的神經原。美國專利5,654,183和5,849,553報道了哺乳動物神經嵴干細胞的用途。美國專利6,040,180報道了以體外方式從哺乳動物多能CNS干細胞中產生分化神經細胞。WO98/50526和WO99/01159報道了神經神經上皮干細胞、少突膠質細胞-星形膠質細胞前體、以及細胞系限制性神經細胞前體的產生和分離。美國專利5,968,829報道了從胚胎前腦中獲取并在含有葡萄糖、轉鐵蛋白、胰島素、硒、黃體酮及幾種其它生長因子的培養基中培養的神經干細胞。肝原代細胞能夠從通過合適膠原酶和透明質酸酶的組合所進行的灌注法從人活檢組織或手術切除組織中獲取。可替換地，EP0953633A1報道了通過制備切碎人肝臟組織、在生長培養液中重懸濃縮的組織細胞并在培養基中擴增細胞從而分離肝臟細胞。該生長培養液含有葡萄糖、胰島素、轉鐵蛋白、T3、FCS以及各種允許肝細胞在不發生惡性轉化的情況下進行生長的組織抽提物。肝臟中的細胞被認為含有特定的細胞，包括薄壁組織細胞、Kuffer細胞、竇狀小管上皮細胞、以及膽管上皮細胞、也包括具有分化成成熟肝細胞或膽管上皮細胞能力的前體細胞(指“肝母細胞”或“卵細胞”)(L.E.Rogler，Am.J.Pathol.150591，1997；M.Alison，CurrentOpin.CellBiol.10710，1998；Lazaroetal.，Cancerres.58514，1998).美國專利5,192,553報道了用于分離人新生或胎兒造血干細胞或祖細胞。美國專利5,716,827報道了作為Thyl-1陽性祖細胞的人造血細胞，并在體外合適的生長培養基中再生它們。美國專利5,635,387報道了用于培養人造血細胞及其前體細胞的方法和裝置。美國專利6,015,554描述了重新構建人淋巴和枝狀細胞的方法。美國專利5,486,359報道了能夠分化成多于一種結締組織細胞的人間質干細胞的同源種群，例如骨頭、軟骨、肌腱、韌帶以及真皮等。它們從骨髓或骨膜中獲得。也報道了用于增殖間質干細胞的培養基。WO99/01145報道了從經諸如G-CSF或GM-CSF之類的生長因子處理的個體的外周血中分離到的人間質干細胞。WO00/53795報道了成脂肪干細胞及(lattices)，其中基本不含脂肪細胞和紅細胞。據報道這些細胞能夠進行增殖并培養以產生激素及合成培養基。可以使用任何脊椎動物物種的干細胞。和非人靈長類動物、家畜、牲畜以及其它諸如嚙齒動物、小鼠、大鼠等非人哺乳動物一樣，來自人類的干細胞包括在內。來自妊娠期之后所形成的組織的靈長類亞全能干細胞(pPS)屬于適用于本發明的干細胞，例如妊娠期間的任何時候所中取得的胚囊或新生或胚胎組織。非限制性實施例是胚胎干細胞的初級培養物或所構建的細胞系。培養基和飼養層細胞用于分離并增殖亞全能細胞的培養基可能有任何幾種不同的配方，只要所獲得的細胞具有期望的特征，并能夠被進一步增殖。合適的來源如下所述Dulbecco′smodifiedEaglesmedium(DMEM)，Gibco#11965-092；KnockoutDulbecco′smodifiedEaglesmedium(KODMEM)，Gibco#10829-018；200mML-谷氨酸，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巰基乙醇，Sigma#M7522；人重組堿性成纖維生長因子(bFGF)，Gibco#13256-029。示例性含血清胚胎干細胞(ES)培養基由80％的DMEM(典型的KODMEM)、20％的不會熱失活的特級胎牛血清(FBS)、0.1mM非必需氨基酸、1mML-谷氨酸、以及0.1mM的β-巰基乙醇組成。該培養基經過過濾并在4℃下保存不超過2周。不含血清的胚胎干細胞(ES)培養基用80％的KODEME、20％的血清替代物、0.1mM非必需氨基酸、1mML-谷氨酸以及0.1mMβ-巰基乙醇組成。有效的血清替代物是Gibco#10828-028。培養基是經過并在4℃下保存不超過2周。在使用之前，人bFGF被加到終濃度為4ng/mL(Bodnaretal.，GeronCorp，國際專利公開文本WO99/20741)。在優選實施方式中，培養基包括KnockoutDMEM培養基(Invitrogen-Gibco，GrandIsland，NewYork)，其中添加10％血清替換物培養基(Invitrogen-Gibco，GrandIsland，NewYork)，5ng/mlFGF2(Invitrogen-GibcoGrandIsland，NewYork)以及5ng/mlPDGFAB(Peprotech，RockyHill，NewJersey)。飼養層細胞(在用到之處)在mEF培養基中增殖，其含有90％DMEM(Gibco#11965-092)，10％FBS(Hyclone#30071-03)，以及2mM谷氨酸。MEFs在T150燒瓶(Coming#430825)，隔一天用胰島素以1∶2的比例傳代(分裂細胞，保持細胞的次融合狀態。為了制備飼養層細胞，細胞在一定劑量下進行照射以已知分化但允許支持人間質干細胞的重要因子的合成(約4000rads的γ射線)。6孔培養板(例如Falcon#304)在37℃下通過溫育的方法用每孔1ml0.5％明膠包被過夜，并以每孔375000個經照射的mEFs進行培養。飼養層細胞一般在種植后使用5小時-4天。就在接種pPS細胞之前采用新鮮人胚胎干細胞(hES)培養基來替換該培養基。用于培養其它干細胞的條件是已知的，并能夠根據細胞類型進行合適地優化。用于特定細胞類型的培養基和培養技術是指在前述部分所引用文獻中所提供的內容。胚胎干細胞胚胎干細胞可以從靈長類物種成員的胚細胞中分離而得(Thomsonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA927844，1995)。人胚胎干細胞(hES)可以通過Thomsonetal(美國專利5,843,780；Science2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38133ff.，1998)所描述的技術從人胚囊細胞中制備而得。大概地，從人體外預先移植的胚胎中獲取人胚細胞。可選擇地，可以采用體外受精(IVF)的晶胚，或者一個人晶胚細胞可以在G1.2和G2.2培養基(Gardneretal.，Fertil.Steril.6984，1998)中發育至胚囊階段。發育的晶胚被選擇用于胚胎干細胞的分離。通過簡短地暴露在鏈霉蛋白酶(Sigma)中來移除Zonapellucida。該內細胞群可以通過免疫手術的方法來分離，其中晶胚暴露在1∶50稀釋的兔抗人脾細胞抗血清中30min，然后在DMEM中洗滌3次，每次5min，并在1∶5稀釋的Guineapigcomplement(Gibco)暴露3min(參見Solteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA725099，1975)。在DMEM中作兩次進一步洗滌后，水解的滋養外胚層細胞通過輕輕地吸取而從完整的內細胞群(ICM)中除去，并且該ICM被接種在mEF飼養層上。在9-15天后，自內細胞群的產物既可以通過暴露在具有1mMEDTA的不含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，通過暴露在分散酶或胰島素中，也可以通過采用移液管的機械分離法而從細胞團中分離出來。分離的細胞被重新接種在新鮮的胚胎干細胞(ES)培養基的mEF飼養層上，并觀察集落的形成。集落顯示未分化的形態通過移液管單獨選擇，機械地分離成細胞團，并重新接種。胚胎干細胞樣的形態具有如下特征即明顯高的細胞核-細胞質比例以及顯眼的核仁。所獲得的胚胎干細胞隨后通過胰蛋白酶作用，暴露在IV型膠原酶(約200U/mL；Gibco)或通過采用移液管單獨選擇集落的方法每隔1-2周進行常規地split。優選細胞團的大小為50-100個細胞。胚胎生殖細胞人胚胎生殖(hEG)細胞可以從在最后一次經期之后約8-11周時所獲取的人胎兒物質中所存在的原生殖細胞中制備得到。合適的制備方法公開于Shamblottetal.，ProcNatl.Acad.Sci.USA9513726，1998以及美國專利6,090,622中。簡要地，用等滲緩沖液清洗生殖脊，然后放入0.1mL0.05％胰蛋白酶/053mMEDTA鈉溶液(BTL)中并分成＜1mm3的塊(chunks)。隨后用100/ul移液管對該組織進行移液以便進一步消化細胞。37℃下孵育5min，然后加入約3.5mLEG生長培養基。EG生長培養基為DMEM、4500mg/LD-葡萄糖、2200mg/LmM重碳酸鈉；15％胚胎干細胞(ES)優等胎牛血清(BRL)；2mM谷氨酸(BRL)；1mM丙酮酸鈉；1000-2000U/mL人重組白血病抑制因子(LIF，genzyme)；1-2ng/ml人重組堿性成纖維生長因子(bFGF，genzyme)；以及10uM佛司可林(溶于10％DMSO中)。在替換方式中，采用透明質酸酶/膠原酶/DNAse來分離EG細胞。解剖用胎兒材料(fetalmaterial)獲取生殖腺原基或具有腸系膜(meseteries)的生殖脊，生殖脊在PBS中洗滌，隨后被放入0.1mLHCD消化溶液中(0.01V型透明質酸酶，0.002％DNAseI，0.1％IV型膠原酶，它們全部都來自Sigma并在EG生長培養基中制備。把組織切碎并在37℃下孵育1h或過夜，在1-3mL的Eg生長培養基中重懸，并飼養層上進行培養。把亞融合飼養層細胞鋪在96孔組織培養板上，該融合飼養層細胞在不含LIF、bFGF或佛司可林的經處理的EG生長培養基中培養3天，用5000rad的射線鈍化。合適的飼養層為STO細胞(ATCC登錄號.CRL1503)。往細胞中加入0.2mL初生生殖細胞(PGC)懸浮液。7-10天后在EG生長培養基中進行首次傳代，把每個孔轉入24孔培養皿的一個孔中，該培養皿事先鋪有經輻射處理的STO鼠纖維原細胞。該細胞在培養基每天一換的條件下培養直至觀察到細胞形態與EG細胞相同為止，一般在7-30或1-4次傳代以后。自我更新和分化自我更新自我更新的干細胞可以通過該
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中各種已知的方法進行識別，例如，形態學、免疫組織化學、分子生物學等等。該干細胞優選表現出Oct4和/或SSEA-1表達升高。優選地，任何Flk-1、Tie-2以及c-kit中的一種或多種表達降低。自我更新的干細胞優選表現出相對于無法自我更新的細胞而言具有縮短的細胞周期。例如，在標準二維顯微圖像的中，人胚胎干細胞表現出在該圖像平面上的核/質比，顯著的核仁以及形成具有少數無法識別的細胞連接的致密型集落。細胞系能夠用標準G-banding技術(在許多提供常規染色體分類服務的臨床診斷實驗室中都可獲得，例如CytogeneticsLabatOaklandCalif)，進行染色體分類并與公開的人染色體作對比。人胚胎干細胞和人胚胎生殖細胞也可以通過細胞標記物的表達來表征。總體上，在本文中所討論的組織特異性標記物可以采用合適的免疫學技術來檢測，例如用于膜結合標志物的流式細胞術、用于胞內標記物的免疫組織化學和用于分泌到培養基中的標記物的酶聯免疫法。蛋白標記物的表達也可以通過使用特異性標記引物的逆轉錄酶-PCR在mRNA水平上進行檢測。進一步的細節參見美國專利5843780。階段特異性的胚胎抗原(SSEA)是特定胚胎細胞類型的特征。SSEA標記物的抗體可以從DevelopmentStudiesHybridomaBank(BethedaMd.)獲得。其它有用的標記物可以采用標明Tra-1-60和Tra-1-81的抗體(Andrewsetal.，CellLinesfromHumanGernCellTumors，inE.J.Robertson，1987，supra)來檢測。人胚胎干細胞一般是SSEA-1陰性而SSEA-4陽性的。HEG細胞一般是SSEA-1陽性的。PPS細胞的體外分化導致SSEA-4、Tra-1-60以及Tra-1-81表達的消失而SSEA-1.pPS細胞的表達也能夠通過堿性磷酸酶活性的出現來進行表征，其可以按照廠商(VectorLaboratories，BurlingameCalif)的描述，通過用4％的多聚甲醛來固定細胞，并隨即用VectorRed作為基質進行增殖。胚胎干細胞一般也是端粒酶陽性的以及OCT-4陽性的。端粒酶活性可以利用TRAP活性分析來確定(Kimetal.，Science2662011，1997)，采用可商業獲得的試劑盒(TRAPeze.RTM.XKTelomeraseDetectionKit，Cat.S7707；IntergenCo.，PurchaseN.Y.；或TeloTAGGG.TM.TelomerasePCRELISAplus，Cat.201389；RocheDiagnostics.Indianapolis)。hTERT的表達也能用RT-PCR造mRNA水平上來評估。LightCyclerTeloTAGGG.TM.hTERT定量試劑盒(Cat.3012344；RocheDiagnostics)可以為了研究目的而商業獲得。分化分化中的細胞，包括間質干細胞以及從中所分化而得的已分化細胞。優選表現出強化的4E-BP1和/或S6K1的去磷酸化過程。它們優選表現出Oct4和/或SSEA-1的升高表達。優選地，FlK-1、Tie-2以及c-kit中任何一種或多種表達升高。優選地，Brachyury、AFP、nestinl中任何一種或多種表達以及nurr表達升高。自我更新的干細胞優選表現出相對于無法自我更新的細胞具有更長的細胞周期。分化中的干細胞，也就是開始或進入分化途徑的細胞，能夠根據多種表型標準來進行表征，包括特殊的轉錄改變。該標準包括但不限于形態學特點的表征、細胞標記物表達和酶活性的檢測和定量、基因表達以及細胞體外功能性特征的確定。總體上，分化干細胞會具有一種或多種細胞類型特點，該特點是分化過程的終產物，即分化的細胞。例如，如果目標細胞類型是肌細胞，處于向該細胞分化過程中的干細胞會例如具有肌球蛋白表達的特點。在多個方面，由此，標準依賴于分化干細胞的結局，并且下文對各種細胞類型的作了總體描述。分化或分化中神經細胞的感興趣的標志物包括β-微管蛋白EIII或神經絲，神經細胞的特征；膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，存在于星形細胞中；半乳糖腦苷脂酶(GaIC)或髓磷脂堿性蛋白(MBP)；少突細胞的特征；OCT-4，未分化人胚胎干細胞的特征；nestin，神經前體的特征以及其它細胞。A2B5和NCAM各自為神經膠質細胞的祖細胞以及神經祖細胞的特征。細胞也能夠用來檢測特征性生物活性物質的分泌。例如，分泌GABA的神經細胞能夠通過谷氨酸脫羧酶或GABA的產生而得以識別。多巴胺能神經細胞能通過多巴脫羧酶、多巴胺或酪氨酸水解酶的產生而得以識別。用于分化或分化中的肝細胞的感興趣的標記物包括α-胎蛋白(肝臟祖細胞)；白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、細胞色素p450活性、轉鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白受體以及糖原倉庫(肝細胞)；CK7、CK9以及γ-谷氨酰轉移酶(膽囊上皮細胞)。已經報道肝細胞分化過程需要轉錄因子BNF-4α(Lietal.，GenesDev.14646，2000)。依賴于HNF-4α表達的標記物包括α1-抗胰蛋白酶、α-胎蛋白、載脂蛋白E(apoE)、葡萄糖激酶、胰島素生長因子1和2、IGF-1受體、胰島素受體以及煙酸。HNF-4表達依賴的標記物包括白蛋白、載脂蛋白AI(apoAI)、載脂蛋白AII(apoAII)、載脂蛋白B(apoB)、載脂蛋白CIII(apoCIII)、載脂蛋白CII(apoCII)、醛縮酶B、苯基丙氨酸羥化酶、L-型脂肪酸結合蛋白、轉鐵蛋白、視黃醇結合蛋白以及(促)紅細胞生成素(EPO)。源自pPS細胞的混合細胞群體中的細胞類型源自pPS細胞能夠通過特征性形態以及它們所表達的標記物而得以識別。對于骨骼肌而言為myoD、肌細胞生成素以及myf-5。對于內皮細胞而言為PECAM(血小板內皮細胞粘附分子)、Flk-1、tie-i、tie-2、血管內皮(VE)鈣粘素、MECA-32以及MEC14.7。對于平滑肌細胞而言為特定的肌球蛋白重鏈以及ANF。對于胰腺細胞而言為pdx和胰島素分泌。對于造血細胞及其祖細胞而言GATA-1、CD34、AC133、β-major球蛋白以及β-major球蛋白樣基因PH1。列于本文中或是本領域已知的特定的組織特異性標記物能夠通過免疫學技術來檢測，例如用于表面標記物的流式免疫細胞化學、用于細胞內或細胞表面標記物的免疫組織化學(例如，固定的細胞或組織部分)、細胞抽提物的免疫印跡(Westernblot)分析，以及酶聯免疫檢測，其用于細胞抽提物或分泌到培養基中的產物。組織特異性基因產物的表達也能夠利用Northernblot分析、dot-blot雜交分析或者利用在標準擴增方法中采取了序列特異性引物的逆轉錄酶起始聚合酶鏈式反應(RT-PCT)在mRNA水平上對其進行分析。本文所列的特定標記物序列數據能夠從公共數據庫中獲得，例如基因庫(URLwww.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)。實施例實施例1.方法hESC-MSC的獲取(間質干細胞)按照之前的描述6，7擴增Hues9和H1hESCs。為了分化hESCs，在6cm板上鋪滿培養的hESCs在37℃下用胰蛋白酶消化3min，中和，離心，并在KnockoutDMEM培養基中重懸(Invitrogen-Gibco，GrandIsland，NewYork)，往明膠覆蓋的10cm板中添加10％的血清替換培養基(Invitrogen-Gibco，GrandIsland，Newyork)、5ng/mlFGF2(Invitrogen-Gibco，GrandIsland，Newyork)以及5ng/mlPDGFAB(Peprotech，RockyHill，NewJersey)。當細胞融合時用胰蛋白酶進行處理并1∶4split。HESCs經胰蛋白酶消化一周后實施CD105+和CD24-的挑選。分化的hESCs用胰蛋白酶消化3min，中和，離心，在培養基中重懸并隨后置于細菌培養皿中。2小時之后置于37℃的CO2培養箱中，收獲細胞，用PBS洗滌并在室溫下與CD24-PE與CD105-FITC(PharMingen，SanDiego，California)一起溫育90min。細胞隨后用PBS進行洗滌并采用FACSDiva軟件(BDBiosciencesPharmingen，SanDiego，CA)在FACSAria上進行挑選。按照前述那樣內容26制備BMMSCs。細胞在添加有青霉素-鏈霉素-谷氨酸、非必需氨基酸基10％胎牛血清(InvitrogenGibco，GrandIsland，NewYork)的DMEM中進行培養。按照前述那樣3實施向脂肪細胞、軟骨細胞以及骨細胞的分化。采用標準技術實行油紅、阿利新藍和vonKossa染色。利用羊抗骨膠原a1II型抗體和連接有HRP的驢抗羊IgG抗體(SantaCruz，SantaCruz，California)在多聚甲醛固定的石蠟包埋切片上進行膠原II型的免疫反應。染色體分類細胞在Petri培養皿中達到80％的融合。用秋水仙酰胺對細胞進行處理以抑制有絲分裂并通過標準低滲處理法收獲細胞，再用甲醇∶醋酸(3∶1)固定化。采用標準空氣干燥法制備切片并與SKYpaintprobe(ASI)進行雜交。根據廠商所提供并在我們的實驗室中建立的操作規程實施雜交后沖洗。每份培養物中有20-30個中期細胞。每份培養物染色體組型代表了＞80％的中期細胞。遷移研究2×106個細胞在4個小時后按照前述27那樣被重懸于30ul的生理鹽水中并移植到腎薄膜下，老鼠被解剖并取出腎臟，固定在4％的多聚甲醛中，用石蠟包埋，4uM切片并用H&E染色。WesternBlot分析使用標準方法28。簡要地，細胞在RIPA緩沖液中裂解并在4℃下14,000rpm離心15min。使20ug上清液變性，在10SDS-聚酰胺凝膠中分離，電轉移至硝酸纖維素膜上，并且膜依次與一抗、隨后與HRP結合的二抗進行溫育，或者隨后與生物素結合的二抗進行溫育并加入neutroavidin-HRP，最后加入HRP加強的化學發光底物，ECS(PierceRockford，IL)。所用一抗為1∶200稀釋的OCT4抗體、SOX-2抗體或β-肌動蛋白抗體(SantaCruzBiotechnology，CA)，二抗為HRP連接的羊抗兔、兔抗羊或兔抗鼠抗體。PCR按照前述那樣實施用于檢測鼠和人特異性重復序列的基因組PCR。用于檢測鼠和人特異性重復序列的基因組PCR。通過利用大容量cDNAArchive試劑盒(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)對1ug總RNA進行逆轉錄從而實施實時RT-PCR。cDNA在水中稀釋10倍并用Taqman引物(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)擴增40個循環。表面抗原分析利用FACS對hESC-MSCs細胞表面抗原進行分析。該細胞用胰蛋白酶消化5min，離心，在培養基中重懸并在置于37℃，含5％CO2的培養箱中的細菌培養皿中培養2-3小時。采用FACS對hESC-MSCs細胞表面抗原和hESCs進行分析。細胞用胰蛋白酶消化1min，離心，PBS洗滌，室溫下在4％多聚甲醛中固定0.5h，洗滌并在2％FCS中室溫下封閉0.5h，同時進行攪拌。1.5×105個細胞隨后與下列各種連接的單克隆抗體室溫下溫育90minCD24-PE、CD29-PE、CD44-FITC，CD49a-PE、CD49e-PE、CD105-FITC、CD166-PE、CD34-FITC、CD45-FITC(PharMingen，SanDiego，CA)。溫育后，清洗細胞并在PBS中重懸。通過把等量的細胞試樣與同種型匹配的鼠單克隆抗體(PharMingen，SanDiego，CA)溫育來確定非特異性熒光。通過收集利用了WinMDI軟件CyanLX儀(DakoNorthAmerica，Inc.，Carpinteria，CA)上的20000個來對數據進行分析。通過把等量的細胞試樣與同種型匹配的鼠單克隆抗體(PharMingen，SanDiego，CA)，或單獨與二抗進行溫育從而確定非特異性熒光。Illumina基因芯片分析利用IlluminaRNA擴增試劑盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)并根據廠商說明書，把分別來自初級BM和成脂肪MSCs的3份樣品的總RNA(2ug)，來自HuES9.E1、EuES9.E3、HuES9.E1的兩份生物復制品的RNA(2ug)和來自3份未分化的hESC細胞系H1、Hes3和HuES9的總RNA(2ug)轉換成生物素化cRNA。利用Rneasy試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)純化樣品。根據IlluminaBeadStation500x手冊實施與SentrixHumanRef-8ExpressionBeadChip(Illumina，Inc.，Austin，TX)的雜交，清洗以及掃描。利用廠商所提供的IlluminaBeadStudio抽提數據，標準化并分析。99％置信度下低于檢測限(LOD)的轉錄信號被當作不表達的(notexpressed)基因而排除。實施例2.從人ES細胞系中產生MSC培養物如果用蛋白酶分散hESC集落并且隨后在不存在飼養層的情況下在鋪有明膠的培養板上傳代，并且在不含血清并添加血清替換培養介質，FGF2以及可選地PDGFAB的培養基中兩周內長起彼此類似或相同的纖維原細胞。培養物具有類似于BM-MSCs(附圖1A)的成纖維細胞形態。用膠原酶分散hESC的方法在生產這些纖維原樣細胞中是無效的。兩種單克隆培養物，huES9.E1和huES9.E3，獨立地從huES9ESC細胞系分化而來，而第三中單克隆培養物，H1.E2則從H1ESC細胞系中產生。幾種亞全能相關基因的表達一般是減少了，例如，HESX1、POUFL5、SOX-2、UTF-1以及ZFP42的轉錄水平比其在hESCs中的水平要低于超過101-5倍(＞101-5)(附圖1B)。OCT4、NANOG以及SOX2的蛋白水平也減少了(圖1C)。以huES9.E1為代表，這些細胞都沒有可檢測到的堿性磷酸酶活性(圖1D)。與其親代HuES9不同，1×106個HuES9.E1細胞在被移植至免疫損傷SCID鼠腎包膜中的4個月觀測期中都沒有誘導形成畸形瘤(圖1E)。為了評估這些細胞被鼠飼養層細胞8污染或融合的可能性，測試這些培養物并且鼠特異性c-mos重復序列呈陰性而人特異性alu重復序列則呈陽性(圖1F)。HuES9.E1、huES9.E3和H1.E2的平均群體倍增時間分別是72、72和120小時。群體倍增時間高度依賴于細胞密度且在融合度為30％-80％之間是最優選的。在大約80次群體倍增后，HuES9.E1具有46XXinv(9)(p13q12染色體組型)。從子代huES9hESC細胞系6開始出現9號染色體畸變。HuES9.E3也具有46XXinv(9)(p13q12染色體組型)，而H1.E1則在36和32次群體倍增時間后具有具有46，XY染色體組型。我們觀察到細胞在約35次群體倍增之后開始出現不正常，在～10-30％的細胞中出現非克隆性染色體畸變(數據未示出)并且在35次群體倍增后細胞便無法使用了。實施例3.表面抗原表達譜利用FACS分析對HuES9/E1、HuES9/E3以及H1.E2的表面抗原表達譜的描繪揭示了表面抗原表達譜，其與BMMSCs的表面抗原表達譜即CD29+、CD44+、CD49a和e+、CD105+、CD166+以及CD34-、CD45-9-11在性質上類似(圖2A)。標記細胞的熒光標記和分布隨著各種hESC-MSC培養物的不同而不同。(圖2A)為了把這些細胞的表面抗原表達譜與BM-MSCs進行比較，HuES9.E1、HuES9.E3以及H1.E1在添加有10％胎牛血清的相同的BM-MSC培養基中增殖2代。即使培養條件發生變化，HuES9.E1、HuES9.E3以及H1.E1依舊是CD29+、CD44+、CD49a和e+、CD105+、CD166+以及CD34-、CD45-(圖2B；H1.E1的數據未示出)并與BM-MSCs十分相似。不同的是CD49a，其具有在BM-MSCs中的表達要低得多。這些數據表明hESC-MSCs表現出BM-MSC表面抗原表達譜的特征，這種表達譜是穩定且不會受到其所處微環境變化的影響。實施例4.hESC-MSC的分化潛能成脂肪、成軟骨以及成骨由于所有與MSCs相關的表面抗原在許多其它細胞類型中也有表達且這些表面抗原的表達是多樣化的，按照傳統對假定的MSCs的識別依賴于功能參數9。有報道MSCs在培養物中默認的分化途徑是伴隨者不同程度脂肪生成和軟骨生成的成骨作用9。因而通過利用已公開規程3中的成脂肪、成軟骨以及成骨作用標準分化條件對HuES9.E1的分化潛能進行測試。成脂肪分化是高度有效的，在＞99％的細胞中都觀察到了油滴(圖3A)。與其作為成脂肪過程中的重要轉錄因子的角色相一致地，源自MSCs的hESC中的PPARγmRNA，其大約比其各自子代ESC細胞系中的PPARγmRNA要高出10-100倍，進一步提高了2倍(圖3A)。成軟骨或軟骨的形成也是有效的，＞99％的細胞在胞外基質中都產生了蛋白多糖，這通過alcianblue染色檢測可知(圖3B)，并且20％的細胞對骨膠原II具有免疫反應。軟骨蛋白聚糖(Aggrecan)的轉錄水平也有所提高13(圖3B)，所述軟骨蛋白聚糖為軟骨特異性胞外基質蛋白。然而，盡管在基質中出現了骨膠原II的免疫反應，骨膠原II的轉錄水平則降低了，所述骨膠原II為另一種軟骨特異性胞外基質蛋白。其原因未知，但已知某些mRNAS特別是那些具有豐富AUelement的mRNAS在轉錄時會變得不穩定14，15。當誘導HuES9.E1細胞經歷成骨或骨形成時骨特異性堿性磷酸酶(ALP)和骨唾液酸糖蛋白(BSP)的表達下調了2-3倍(圖3C)。然而，骨形成的高級階段時下調水平最小化，所述高級階段通過較少的vonKossa染色來判定(圖3C)。在分化的培養物中存在＜1％的陽性染色。實施例5.基因表達譜描繪hESC-MSCs的基因表達譜是為了1)評估hESC-MSCs培養物和源自成體組織的MSCs的相關性，所述源自成體組織的MSCs是利用來自3個不同個體的BM-MSCs以及源自脂肪的(ad)MSCs而獲得的，并且屬于3種人ESC細胞系；2)評估3種hESC-MSC彼此之間的相關性；3)比較源自hESC的MSCs和那些源自BM的MSCs之間的相似和不同之處。從總RNA中制備的經標記的cDNA與含有24000個獨特特征的IlluminaBeadArray雜交。3種hESC-MSC培養物即HuES9.E1、HuES9.E3和H1.E2中，3種BM-MSC樣品以及3種源自脂肪的(ad)-MSC樣品中所表達的基因Hierarchiacal聚類顯示hESC-MSC的表達譜比它的親代hESCs更接近于源自成體組織的MSCs即所謂的BM-MSC與ad-MSC(圖4A)。有趣的是，MSCs根據其來源組織而進行聚類，并且其進一步被劃分入成體組織中而不是胚胎組織中，這一點從ad-MSCs與BMMSCs作為相對于hESC-MSCs的區別性組而得以聚類中得到提示。hESC-MSCs和BM-MSCs之間基因表達的兩兩比較顯示其相關系數為0.72，這提示在hESC-MSC和BM-MSCs的基因表達都是相當保守的同時，它們也存在顯著的區別(圖4B)。hESC-MSCs和hESCs之間兩兩比較證實了hESC-MSCs和hESC之間的區別，其相關系數為0.65(圖4C)。為了評價3種hESC-MSC培養物各自之間的相關性，HuES9.E1、H1.E2和HuES9.E3各自與由HuES9.E1、H1.E2和HuES9.E3所構成的同一參照物作了比較。HuES9.E1、H1.E2和HuES9.E3與同一參照物之間的相關系數時本質上是一致的，即0.93，0.95和0.93，這分別提示了HuES9.E1、H1.E2和HuES9.E3是高度相似的(圖4C)。在hESC-MSCs和BM-MSCs中的表達高于檢測限且置信度為99％的8699和8505個基因中，各自的6376基因在hESC-MSCs和BM-MSCs中以＜2.0倍的差別程度進行表達。由于這些基因可能提供了解MSCs基礎生物學的方法，我們檢測了受這些基因驅動的生物學過程。在6376個共同表達的基因中，4064個基因可以在模式分類基因表中尋找到(2006年3月；http://www.pantherdb.org/)。把這些基因分入不同生物學過程的分類顯示與NCBIH.sapiens基因數據庫的23481個基因所構成的參考列表相比，在某些生物學過程中基因頻率顯著高于或低于代表基因(p，0.01)。這些過程包括關于分解代謝和合成代謝活力的基礎代謝過程、需要高強度后轉錄修飾例如糖基化的分泌產物合成、以及細胞表達(圖4C)。與它們的間質潛能一樣，涉及外胚層分化尤其是神經發育的基因也存在不能呈現的問題。基因表達分析也提示MAPKKK信號在BM-MSC和hESC-MSCs中都是顯著的。由至少3種亞族所構成的MAPKKK信號，即所謂的經典MAPK(也被認為是ERK)，應急激活的蛋白激酶/c-JunN-末端激酶(JNK)以及p38激酶，與表達、分化、發育、細胞應急響應調節、細胞循環、凋亡和生存18-21相關。對hESC-MSC和BM-MSC的基因表達譜的進一步分析顯示1142和1134個基因各自在hESC-MSC和BM-MSC中以＞2倍的程度進行表達。在這些基因中，738和880個基因各自位于模式分類基因列表中(2006年3月；http://www.pantherdb.org/)并被分類入生物學過程。選擇了在與NCBIH.sapiens基因數據庫中23481個基因所構成的參考列表相比時顯著高于或低于代表基因(p＜0.01)的生物學過程。優選在BM-MSCs中表達的基因根據涉及代謝過程、細胞結構、分化以及信號傳遞的生物學過程進行分類，同時優選表達的hESC-MSC基因按照涉及表達、分化、免疫和信號傳導的那些過程進行分類(圖3C)。在與分化相關的生物學過程中基因的過度呈現與hESC-MSC較之BM-MSC具有更高分化能力是相一致。雖然hESC-MSC或BM-MSC中的高表達基因在總的分化和信號傳遞分類中是過度呈現的，但是各種類型中的特定生物學過程在hESC-MSC和BM-MSC中具有不同的代表基因。例如，與諸如胚胎形成和分裂等早期胚胎發育相關的分化過程在hESC-MSC是過度呈現的，而那些與晚期胚胎發育例如骨骼發育及肌肉發育相關的過程則在BM-MSC中是過度呈現的。類似地，胞外基質蛋白介導的信號傳遞以及MAPKKKcascade在BM-MSC中是過度呈現的。總而言之，這些觀察結果提示hESC-MSC和BM-MSC中的分化潛能和信號途徑的利用是不相同的。實施例5’.對hESCs和hESCs以及源自hESC的MSCs的表面標記物進行區分以分離源自單個細胞的MSC群體全基因組基因表達要求有在hESC-MSC或hESC中高表達的基因，其編碼膜蛋白以便于從正在分化的hESCs中分離MSCs。從在hESC-MSCs和hESCs中編碼假定膜蛋白的前20位高表達基因列表中，選擇編碼抗其基因產物的抗體的候選基因可以商業獲得(下表E1A和E1B)。在hESC源(hESCderived)中高度表達的那些候選基因中表E1A.在源自hESC的MSC中的表達超過hESC的高表達膜蛋白表E1B.在hESC的表達超過源自hESC的MSC的高表達膜蛋白。上表E1A和E1B顯示在源自hESC的MSCs中(表E1A)或在其親代hESCs(表E1B)中高表達的表面抗原編碼基因。基于通過微陣列雜交的基因表達分析，相對于hESCs(HuES9、H1及Hes3hESCs)在源自hESC的MSCs(HuES9.E1、HuES9.E3以及H1E2)中高表達的前20位基因(表E1A)以及相反的(表E1B)。MSCs為ENG(CD105)、ITGA4(CD49d)、PDGFRA、NT5E(CD73)，這些都是源自成體組織的MSCs的特征性表面標記物9-11并且前述被識別為高表達hESC特異性基因ITGB1BP3和PODXL22以及CD24屬于那些在hESC中具有高表達的候選基因，這些hESC特異性基因與hESCs并不相關。我們證實CD24在hESC中相對于其在hESC-MSC中而言具有高度表達(圖5A)。實施例6.獲取同源性hESC-MSC群體我們接下來檢測這些標記物在強化hESC-MSCs同質性中的有效性。在用胰蛋白酶消化過后1周，在添加有血清替代介質FGF2以及可選地PDGFAB的培養基中進行培養，通過FACS挑選表達CD105且不表達CD24的細胞。CD105+和CD24-的細胞大約構成了培養物5％(圖5B)。挑選的細胞以1個細胞/孔的密度接種到10×96孔板上，以100個細胞/孔的密度接種到1×24孔板上，以1000個細胞/孔的密度接種到3×6孔板上。在這些細胞中，只有在18份1000個細胞/孔中的5份培養物產生了MSC樣培養物，這暗示這些MSC樣培養物有可能是從單一細胞分化而來的。利用含約24,000特定特征的IlluminaBeadArray對這5份培養物Q4.1-Q4.5的全基因組基因表達譜所進行的描繪揭示了這5種培養物之間的相似性，其中4份細胞系的相關系數為0.96而剩下的一份則為0.90(圖5C)。從我們這方面看，在距使用同一RNA樣品至少一個月時間后所實施的技術性重復實驗之間的相關系數一般在0.97-0.98之間。Q4.1-Q4.5也都與由huES9.E1、H1E2以及huES9.E3所構成的hESC-MSCs高度相似，而與BM-MSCs的相關系數為0.87和0.81(圖5D)。相反地，Q4.1-Q4.5與其親代HuES9.E1hESC細胞系的相關系數低于0.55(圖5D)。采用G顯帶進行染色體分析并在任意選擇的Q4.3中實施SKY。Q4.3具有9號染色體發生畸變的正常染色體組型，所述染色體畸變源自其親代HuES9hESC細胞系(圖5E)6。這些觀察結果一起顯示通過在添加有bFGF2及可選的PDGFBB的培養基中增殖一周后再從胰蛋白酶消化的hESC培養物中挑選CD105+和CD24-細胞的方法可以產生高度同源的MSC培養物。把陽性和陰性選擇性標記物結合到制備規程中導致獲得了5種具有的相互之間幾乎相同的全基因組表達譜的單克隆分離物，并證實了選擇的特異性或挑選標準。5種分離物之間基因表達兩兩綜合比較顯示出幾乎相同的基因表達譜，其與采用同一RNA樣品的技術性重復試驗中所觀察到的基因表達譜相似。實施例7-15描述了多個試驗以分析源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)基因組。在這些試驗中，采用臨床適用的試驗方案來對用源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)合成的化學合成的不含血清培養基進行了分析。該合成培養基用多維蛋白識別技術(MuDPIT)以及細胞因子抗體陣列分析法來進行分析，并發現存在201種獨特基因產物。86-88％的這些基因產物具有利用微陣列或qRT-PCR分析法可檢測到的轉錄水平。計算機分析預測這些基因產物顯著分為3個主要的生物學過程組別代謝、防御性響應以及包括血管形成、造血以及骨骼成長在內的組織分化。其也預測201個基因產物激活了心臟血管生物學、骨骼成長以及造血作用中的重要信號途徑，例如JakSTAT、MAPK、Toll樣受體、TGF-β信號傳遞以及mTOR信號傳遞途徑。實施例7.源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)的蛋白組學分析材料和方法合成培養基的制備HuES9.E1按照上述那樣進行培養。用PBS對80％融合的HuES9.E1細胞培養物洗滌3次，在由不含酚紅并添加有ITS(Invitrogen-Gibco，GrandIsland，NewYork)、5ng/mlFGF2(Invitrogen-Gibco，GrandIsland，NewYork)、5ng/mlPDGFAB(Peprotech，RockyHill，NewJersey)谷氨酸-青霉素-鏈霉素以及β-巰基乙醇的DMEM所構成的化學合成培養基(Catalog31053；Invitrogen-Gibco，GrandIsland，NewYork)中培養過夜。該培養物隨后用PBS清洗3次，并隨即放入新鮮培養基中。3天后，收集培養基，500g離心并0.2μ微孔過濾上清液。為了LCMS/MS檢測，合成培養基被放入截止分子量為3500的透析袋中(PierceBiotechnology，Rockford，IL)，在10倍體積0.9％NaCl中透析3次，然后利用Slide-A-Lyzer濃縮液濃縮20倍，隨后在0.2μ過濾之前于100倍體積的0.9％NaCl中透析10次。對同樣體積的非合成培養基進行透析并平行地對合成培養基進行濃縮。細胞因子抗體Blot檢測依據廠商的說明書(RayBioNorcross，GA)用RayBioCytokine抗體陣列檢測1ml合成或非合成培養基中是否存在細胞因子以及其它蛋白質。LCMS/MS分析按照所公開的那樣{Washburn，2001#2997}對2ml經透析的合成(CM)或非合成培養基(NCM)中的蛋白質進行還原，烷基化并用胰蛋白酶消化。該樣品隨后經過使消化混合物通過合成Sep-PakC-18SPE芯(Waters，Milford，MA，USA)，3％乙腈(ACN)(JTBaker，Phillipsburg，NJ)以及0.1％蟻酸(FA)緩沖液清洗兩次，并在70％的CAN和0.1％的FA緩沖液中抽提，從而得以脫鹽。該抽提的樣品隨后通過speedvac到約10％的初始體積并用0.1％的蟻酸調節從而得到水合。樣品在LCMS//MS分析之前，于4℃下保存。通過利用LC-MS/MS系統(LTQ，ThermoFinnign，SanJose，CA，USA)對脫鹽的蛋白質進行MudPIT分析。該樣品被加載到強離子(SCX)交換柱(BiodbasicSCX，5um，thermoEletron，SanJose，USA)上并且在第一維中用50ul的緩沖液沖洗6次(0、2、5、10、100和1000mM的含5％ACNyiji0.1蟻酸的氯化氨)分餾。濃縮從SCX柱子洗脫的肽并在Zorbaxpeptidetrap(Agilent，PolaAlto，CA，USA)中脫鹽。第二維色譜分離在home-packednanoboredC18柱(75um，id.10cm，5um顆粒)上進行并直接進入pico-frit納米電噴霧針尖(NewObjective，Wubrun，MA，USA)中，以200nL/min的流速梯度洗脫120min。LTQ在數據獨立模式中進行操作，通過對來自每次MS掃描中3個最強峰執行MS/MS掃描。對于每次試驗，通過home-wrriten程序把6次鹽洗脫的MS/MS(dta)譜組合成多路存取系統控制終端類文件。蛋白識別利用經由in-houseMascot服務器對照IPI人蛋白質數據庫對組合數據進行搜尋而實現。搜索參數為利用胰蛋白酶對2處未裂解處中的最大一處進行處理；固定化的修飾為氨基甲酸甲基化物并且多樣化的修飾物為甲硫氨酸氧化以及蛋白質N端乙酰化。把肽前體以及片段離子各自的分子量公差設定為20和0.8Da。如果2種不同的肽被發現具有50分或更高分值則把該蛋白質識別結果作為真陽性結果接受。既然多種生長因子和細胞因子使小分子蛋白/肽且少量分泌，則相應的MS/MS譜便是弱的并且對于每種蛋白質僅識別一種肽。對于那些mascot分值在20和50之間的肽，對MS/MS譜進行手動確證。生物信息學已確證的蛋白質通過去掉在非合成培養基中所識別的背景蛋白的方法而得以比較。每種蛋白的IPI識別符通過蛋白質交叉參考表被轉換為基因標識。用GeneSpringGX7.3表達分析儀(AgilentTechnologies，PaloAlto，CA)把基因產物分成不同的GO分類系統(geneontology分類體系)中的生物學過程或途徑。隨后，把各個過程或途徑中的基因頻率與基因庫中的人類基因數據庫進行對比，那些基因頻率顯著較高(p＜0.05)的過程或途徑被認為受到MSC分泌的顯著調節。QRT-PCR按照廠商說明用Trizol試劑(Gibco-BRL)從HuES9.E1中抽提總RNA并在旋轉柱(spincolumn)(NucleospinRNAII系統，Macherey-NagelGmbH&Co.，Germany)中進行純化。利用高容量cDNAArchivekit(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)在50ul反應體積中把1ug總RNA被轉換成具有隨機引物的cDNA。該cDNA用蒸餾水稀釋成100ul體積。根據廠商說明把1ul用于途徑特異性的RT2ProfilerPCRArrays(SuperArray，Frederick，USA)中所設定的每種引物。用于分析板是Chemmokines&ReceptorsPCRArray(cat.no.APH-022)，NfkBSignalingPathwayPCRArray(cat.no.APH-025)，炎癥細胞因子&受體(InflammatoryCytokines&Receptors)PCRArray(cat.no.APH-011)，普通細胞因子PCRArray(cat.no.APH-021)，JAK/STAT信號途徑PCRArray(cat.no.APH-039)。實施例8.源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)基因組分析合成培養基(CM)和非合成培養基(NCM)的制備為了確保合成培養基的污染最小化而添加諸如血清替代物等介質，HuES9.E1MSC被培養至80％融合，用PBS清洗3次，在由不含酚紅并添加了ITS(胰島素、轉鐵蛋白以及selenoprotein)、5ng/mlFGF2，5ng/mlPDGFAB谷氨酸鹽-青霉素-鏈霉素以及β-巰基乙醇的DMEM培養基所組成的化學合成培養基溫育過夜。HuE9.E1MSCs在該基本培養基中增殖至少一周。第二天，細胞培養物再次用PBS進行清洗，并在新現的合成培養基中進行溫育。在條件處理3天后收集培養基，該合成培養基(CM)一般和等量的非合成培養基(NCM)平行進行分析或處理。為了進行LCMS/MS分析，在按材料和方法項中的0.9％生理鹽水中粗透析之前，把該培養基濃縮～10倍。經濃縮的CM和NCM的平均蛋白質濃度各自為98.0±17.9ug/ml和41.6±1.2ug/ml(n＝3)。用MSCs對培養基的調節處理通過在蛋白凝膠運行培養基試樣而得以監測。培養基中的蛋白組合物隨著時間的增加而增加(圖6)。CM比NCM具有更復雜的蛋白組合物。實施例9.源自ESC的MSCs(hESC-MSCs)的蛋白質組分析通過LCMS/MS以及抗體陣列對MSC合成培養基進行分析LCMS/MS分析識別了250種存在于獨立制備的幾批CM中的蛋白質，但在經類似處理的NCM中沒有發現該蛋白質。這些蛋白質為IPI00021428肌動蛋白，α骨骼肌；2.IPI00414057肌動蛋白α1骨骼肌蛋白；3.IPI00008603肌動蛋白，動脈平滑肌；4.IPI00021439肌動蛋白，細胞質1；5.IPI00023006肌動蛋白，α心肌；6.IPI00021440肌動蛋白，細胞質2；7.IPI00025416肌動蛋白，γ腸平滑肌；8.IPI00479925凝集素；9.IPI00015102CD166抗原前體；10.IPI00007423酸性亮氨酸豐富的核磷蛋白質32家族成員B；11.IPI0041333136kDa蛋白；12.IPI0041257734kDa蛋白；13.IPI0041350633kDa蛋白質；14.IPI00418169推定蛋白DKFZp686P03159；15.IPI00003815RhoGDP-解離抑制劑1；16.IPI00004656β-2-微球蛋白前體；17.IPI00218042骨形態形成蛋白1前體的spliceisoformBMP1-5；18.IPI00009054骨形態形成蛋白1前體的剪接異構體BMP1-3；19.IPI00014021骨形態形成蛋白1前體的剪接異構體BMP1-1；20.IPI002180420骨形態形成蛋白1前體的剪接異構體BMP1-4；21.IPI00006980蛋白C14或f166；22.IPI00296165補體C1r亞成分前體；23.IPI00152540OTTHUMP00000016748；24.IPI00305064剪接異構體CD44抗原前體；25.IPI00297160推定蛋白DKFZp451K1918；26.IPI00293539Cadherin-11前體的剪接異構體2；27.IPI00304227Cadherin-11前體的剪接異構體1；28.IPI00386476Cadherin11，2型，前蛋白原異構體1；29.IPI00024046Cadherin-13前體；30.IPI00290085Neural-cadherin前體；31.IPI00029739剪接異構體1of補體因子H前體；32.IPI00012011Cofilin，非肌性異構體；33.IPI00007257calsyntenin1異性體2；34.IPI00218539膠原α-1(XI)鏈前體的剪接異構體B；35.IPI00477350膠原，XI型，α1；36.IPI00329573SpliceIsoformLongofCollagenα-1(XII)chain前體；37.IPI00221384膠原α-1(XII)鏈前體的短剪接異構體(SpliceIsoformShortofCollagenα-1(XII)chain前體)；38.IPI00400935膠原α-1(XVI)鏈前體；39.IPI00297646膠原α-1(1)鏈前體；40.IPI00164755Prepro-α2(I)膠原前體；41.IPI00304962膠原α-2(I)鏈前體；42.IPI00021033膠原α-1(III)鏈前體；43.IPI00167087COL3A1蛋白；44.IPI00021034膠原α-1(IV)鏈前體；45.IPI00479324α2IV型膠原前蛋白原；46.IPI00306322膠原α-2(IV)鏈前體；47.IPI00303313膠原α-1(V)鏈前體；48.IPI00477611184IcDa蛋白；49.IPI00293881COL5A2蛋白；50.IPIOOO18279膠原α-3(V)鏈前體；51.IPI00291136膠原α-1(VI)鏈前體；52.IPI00304840剪接異構體2C2of膠原α-2(VI)鏈前體；53.IPI00220613剪接異構體2C2Aof膠原α-2(VI)鏈前體；54.IPI00022200α3VI型膠原異構體1前體；55.IPI00072918α3VI型膠原異構體4前體；56.IPI00220701膠原α-3(VI)鏈前體的剪接異構體2；57.IPI00072917α3VI型膠原異構體3前體；58.IPI00021828胱抑素B；59.IPI00007778Di-N-乙酰幾丁質(acetylchitobiase)前體；60.IPI00295741組織蛋白酶B前體；61.IPI00299219蛋白CYR61前體；62.IPI0051490042IdDa蛋白；63.IPI00333770與胞質分裂蛋白10的主要貢獻者(Dedicator)相似；64.IPI00478332胞質分裂蛋白9的主要貢獻者(Dedicator)相似；65.IPI00000875延伸因子1-γ；66.IPI00465248α-烯醇化酶；67.IPI00013769α-烯醇化酶，肺特異性；68.IPI00216171γ-烯醇化酶；69.IPI00218803Fibulin-1前體的剪接異構體B；70.IPI00296537Fibulin-1前體的剪接異構體C；71.IPI00328113原纖緯蛋白-1前體；72.IPI00019439原纖緯蛋白2前體；73.IPI00385645成纖維細胞生長因子17前體的剪接異構體2；74.IPI00216602成纖維細胞生長因子2前體的剪接異構體5；75.IPI00216604成纖維細胞生長因子2前體的剪接異構體8；76.IPI00034099假定蛋白FLJ21918；77.IPI00333541細絲蛋白-A；78.IPI00302592細絲蛋白A，α；79.IPI00339227假設蛋白DKFZp68601166；80.IPI00414283纖維連接蛋白前體(FN)(冷凝球蛋白)(CIG).剪接異構體3；81.纖維連接蛋白前體的剪接異構體5；82.IPI00339319纖維連接蛋白前體的剪接異構體11；83.IPI00556632纖維連接蛋白前體的剪接異構體12；84.IPI00411462假設蛋白DKFZp686B18150；85.IPI00029723卵泡抑制蛋白相關的蛋白1前體；86.IPI00005401多肽N-乙酰氨基半乳糖轉移酶5；87.IPI00219025谷氧還蛋白-1；88.IPI00171411高爾基體磷蛋白2；89.IPI00026314凝溶膠蛋白前體；90.IPI00219757谷胱甘肽S-轉移酶P；91.IPI00027569C型不均一核糖核蛋白(HeterogeneousnuclearribonucleoproteinC-1ike)1；92.IPI00003881HNRPF蛋白；93.IPI00442294Neurotrimin前體的剪接異構體1；94.IPI00003865熱休克同源71kDa蛋白的剪接異構體1；95.IPI00037070熱休克同源71kDa蛋白的剪接異構體2；96.IPI0022036210kDa熱休克蛋白，線粒體；97.IPI00024284基底膜特異性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白前體；98.IPI00297284胰島素樣生長因子結合蛋白2前體；99.IPI00297284胰島素樣生長因子結合蛋白2前體；100.IPI00029236胰島素樣生長因子結合蛋白5前體；101.IPI00029236胰島素樣生長因子結合蛋白5前體；102.IPI00029235胰島素樣生長因子結合蛋白6前體；103.IPI00029235胰島素樣生長因子結合蛋白6前體；104.IPI00016915胰島素樣生長因子結合蛋白7前體；105.IPI00016915胰島素樣生長因子結合蛋白7前體；106.IPI00328163K-A-I蛋白；107.IPI00021396管內皮生長因子受體2前體；108.IPI00298281層粘連蛋白γ-1鏈前體；109.IPI00219219半乳糖凝集素-1；110.IPI00023673半乳糖凝集素-3結合蛋白前體；111.IPI00021405核纖層蛋白-A/C的剪接異構體A；112.IPI00216953核纖層蛋白-A/C的剪接異構體ADelta10；113.IPIOO180173預測與原肌球蛋白4相似；114.IPI00401614預測與FKSG30相似；115.IPI00374397預測與原肌球蛋白4相似；116.IPI00374732預測與PPIA蛋白相似；117.IPI00402104預測與肽基脯氨酰異構酶A異構體1相似；親環素A；肽基脯氨酰；118.IPI00455415預測；與C型不均一核糖核蛋白相似dJ845O24.4；119.IPI00454722預測與磷脂酰乙醇胺-結合蛋白相似；120.IPI00454852預測與畸胎瘤源的生長因子1相似；121.IPI00002802蛋白-賴氨酸6-氧化酶前體；122.IPI00410152潛在轉化生長因子β結合蛋白1異構體LTBP-1L；123.IPI00220249潛在轉化生長因子β結合蛋白，異構體IL前體；124.IPI00220249潛在轉化生長因子β結合蛋白，異構體IL前體″；125.IPI00410152潛在轉化生長因子β結合蛋白1異構體LTBP-1L；126.IPI00020986光蛋白聚糖前體；127.IPI00291006蘋果酸脫氫酶，線粒體前體；128.IPI00005707巨噬細胞甘露糖受體2前體；129.IPI00020501肌球蛋白-11；130.IPIOOO19502肌球蛋白-9；131.IPI00604620核仁素；132.IPI00220740剪接異構體2of核仁磷酸蛋白；133.IPI00219446磷脂酰乙醇胺-結合蛋白；134.IPI00299738前膠原C-內肽酶增強子1前體；135.IPI00015902β血小板源性生長因子受體前體；136.IPI00216691抑制蛋白-1；137.IPI00169383磷酸甘油酸激酶1；138.IPI00219568磷酸甘油酸激酶，睪丸特異；139.IPI00296180尿激酶型纖溶酶原激活物前體；140.IPI00215943網蛋白1的剪接異構體3；141.IPI00215942網蛋白1的剪接異構體2；142.IPI00014898網蛋白1的剪接異構體1；143.IPI00398777網蛋白1異構體8；144.IPI00398776網蛋白1異構體7；145.IPI00186711網蛋白1異構體6；146.IPI00420096網蛋白1異構體3；147.IPI00398779網蛋白1異構體11；148.IPI00398778網蛋白1異構體10；149.IPI00398002網蛋白1異構體1；150.IPI00419585肽基脯氨酰順反異構酶A；151.IPI00472718肽基脯氨酰異構酶A異構體2；152.IPI00000874過氧化還原酶-1；153.IPI00024915過氧化還原酶-5，線粒體前體；154.IPI00375306過氧化還原酶5前體，異構體b；155.IPI00012503剪接異構體Sap-mu-0of激活劑前體多肽前體；156.IPI00374179蛋白酶體激活因子亞基1異構體2；157.IPI00030154蛋白酶體激活因子配合物亞基1；158.IPI00168812PTK7蛋白酪氨酸激酶7異構體d前體；159.IPI00419941PTK7蛋白酪氨酸激酶7異構體a前體；160.IPI00003590QuiescinQ6，異構體a；161.IPI00015916骨源生長因子(片段)；162.IPI00015916骨源生長因子；163.IPI00298289網狀蛋白-4的剪接異構體2；164.IPI00021766網狀蛋白-4的剪接異構體1；165.IPI00013895調鈣結合蛋白；166.IPI00010402假定蛋白；167.IPI00218733超氧化物歧化酶；168.IPI00014572SPARC前體；169.IPI00005614收縮蛋白β鏈，腦1的長剪接異構體(SpliceIsoformLongofSpectrinbetachain，brain1)；170.IPI00008780外周血人類斯鈣素-2前體；171.IPI00301288SEL-OB蛋白；172.IPI00216138膠轉蛋白；173.IPI00018219轉化生長因子-β-誘導蛋白ig-h3前體；174.IPI00304865轉化生長因子，β受體III″；175.IPI00296099血小板反應素-1前體；176.IPI00032292金屬蛋白酶抑制劑1前體；177.IPI00027166金屬蛋白酶抑制劑2前體；178.IPI00220828胸腺素β-4；179.IPI00180240胸腺素樣3(thymosin-like3)；180.IPI00299633OTTHUMP00000031270(片段)；181.IPI00465028磷酸丙糖異構酶1變異體(片段)；182.IPI00451401磷酸丙糖異構酶的剪接異構體2；183.IPI00010779原肌球蛋白4；184.IPI00216975原肌球蛋白α-4鏈的剪接異構體2；185.IPI00180675微管蛋α-3鏈；186.IPI00218343微管蛋白α-6鏈；187.IPI00216298硫氧還蛋白；188.IPI00472175CDNAFLJ46672菲斯，克隆TRACH3009008，與硫氧還蛋白還原酶高度相似；189.IPI00450472泛蛋白連接酶E2I；190.IPI00018352泛素羧基末端水解酶L1；191.IPI00010207泛素-倍改性劑1(Ubiquitin-foldmodifier1)前體；192.IPI00260630URB；193.IPI0002126314-3-3蛋白δ/Δ；194.IPI00642991假設蛋白DKFZp686F10164；195.IPI00470919假設蛋白DKFZp686K08164；196.IPI00719088膠原，VI型，α1前體；197.IPI00654685與SPARC前體相似；198.IPI00641961膠原，XII型，α1；199.IPI00645849細胞外基質蛋白1；200.IPI00554786硫氧還蛋白還原酶1；201.IPI00645018纖溶酶原激活物，尿激酶；202.IPI00552339金屬蛋白酶的組織抑制因子1；203.IPI00642997肌動蛋白，細胞質2；204.IPI00719778與膜聯蛋白相似A2；205.IPI00647915膠轉蛋白2；206.IPI00552815膠原，V型，α1；207.IPI00552981CDNAPSEC0266菲斯，克隆NT2RP3003649，與Homosapiensfibulin-lDmRNA高度相似；208.IPI0018077629IcDa蛋白；209.IPI00552416細絲蛋白A，α；210.IPI00640698肌動蛋白，γ腸場平滑肌；211.IPI00514530肌動蛋白，α1，骨骼肌；212.IPI00556442胰島素樣生長因子結合蛋白2變異體(片段)；213.IPI00513782凝溶膠蛋白；214.IPI0047873129IcDa蛋白；215.IPI0039647924IcDa蛋白；216.IPI0033462739IcDa蛋白；217.IPI00555762PTK7蛋白酪氨酸激酶7異構變異體(片段)；218.IPI0065820297IcDa蛋白；219.IPI00006273CYR61蛋白；220.IPI00719405TMSL6蛋白；221.IPI00658096胸腺素β-4；222.IPI003761635IdDa蛋白；223.IPI00556217原纖維蛋白1變異體(片段)；224.IPI00514817與核纖層蛋白A/C類似；225.IPI00644087Progeria；226.IPI00655812橫紋肌肉瘤抗原MU-RMS-40.12；227.IPI00604517與核仁素相似；228.IPI00444262CDNAFLJ45706菲斯，克隆FEBRA2028457，與核仁素高度相似；229.IPI00412473蛋白；230.IPI00414489蛋白；231.IPI00411463蛋白；232.IPI00556415膠轉蛋白變異體(片段)；233.IPI00718825鈣調蛋白；234.IPI0047815617kDa蛋白；235.IPI00386621CALM3蛋白；236.IPI00647001酸性；237.IPI00642650與外周血人斯鈣素2前體相似；238.IPI00641471膠原樣蛋白；239.IPI00514669SH3富谷氨酸結合結構域蛋白樣3；240.IPI00719422磷酸丙糖異構酶(片段)；241.IPI00003734PutativeS100鈣結合蛋白H_NHO456N16.1；242.IPI0002957411kDa蛋白；243.IPI00641047凝溶膠蛋白；244.IPI00647556凝溶膠蛋白；245.IPI00654821假設蛋白LOC54845異構體1；246.IPI00647572Dickkopf相關的蛋白-3前體；247.IPI00639879與胞質分裂蛋白sepA相似；248.IPI00657746與胞質分裂蛋白8的主要貢獻者(Dedicator)相似；249.IPI00555993血管內皮生長因子受體3變異體；250.IPI00552545胞質分裂蛋白8的主要貢獻者(Dedicator)。同時，這250種蛋白質由132各獨特的已知基因編碼ACTA1；COL5A2；HSPA8；PSAP；ACTA2；COL5A3；HSPE1；PSME1；ACTB；COL6A1；HSPG2；PTK7；ACTC；COL6A2；IGFBP2；QSCN6；ACTG1；COL6A3；IGFBP5；RTN4；ACTG2；CSTB；IGFBP6；S100A11；AGRN；CTBS；IGFBP7；SH3BGRL3；ALCAM；CTSB；K-A-I；SOD1；ANP32B；CYR61；KDR；SPARC；ANXA2；DOCK10；LAMC1；SPTBN1；ARHGDIA；DOCK8；LGALS1；STC2；B2M；ECM1；LGALS3BP；SVEP1；BMP1；EEF1G；LMNA；TAGLN；C14orf166；ENO1；LOX；TAGLN2；C1R；ENO1B；LTBP1；TGFBI；CALM1；ENO2；LUM；TGFBR3；CD109；FBLN1；MDH2；THBS1；CD44；FBN1；MRC2；TIMP1；CDH11；FBN2；MYH11；TIMP2；CDH13；FGF17；MYH9；TMSB4X；CDH2；FGFR2；NCL；TMSL3；CFH/HF1；FLJ21918；NPM1；TMSL6；CFL1；FLNA；PBP；TPI1；CLSTN1；FN1；PCOLCE；TPM4；COL11A1；FSTL1；PDGFRB；TUBA3；COL12A1；GALNT5；PFN1；TUBA6；COL16A1；GLRX；PGK1；TXN；COL1A1；GOLPH2；PGK2；TXNRD1；COL1A2；GSN；PLAU；UBE2I；COL3A1；GSTP1；PLEC1；UCHL1；COL4A1；HNRPCL1；PPIA；UFM1；COL4A2；HNRPF；PRDX1；URB；COL5A1；HNT；PRDX5；YWHAZ.有32種蛋白是未知的IPI00642991假定蛋白DKFZp686F10164；IPI00470919假定蛋白DKFZp686K08164；IPI00654685與SPARC前體相似；IPI00719778與膜聯蛋白A2相似；IPI00552981CDNAPSEC0266菲斯，克隆NT2RP3003649，與Homosapiensfibulin-1DmRNA高度相似；IPI0018077629IcDa蛋白；IPI0047873129IcDa蛋白；IPI0039647924IcDa蛋白；IPI0033462739IcDa蛋白；IPI0065820297IcDa蛋白；IPI003761635IcDa蛋白；IPI00514817與核纖層蛋白A/C相似；IPI00644087Progerin；IPI00655812橫紋肌肉瘤抗原MU-RMS-40.12；IPI00604517與核仁素相似；IPI00444262CDNAFLJ45706菲斯，克隆FEBRA2028457，與核仁素高度相似；IPI00412473蛋白；IPI00414489蛋白；IPI00411463蛋白；IPI0047815617IcDa蛋白；IPI00386621CALM3蛋白；IPI00647001酸性；IPI00642650與外周血人類斯鈣素基因2前體相似；IPI00641471膠原體樣蛋白；IPI00514669SH3富谷氨酸結合結構域蛋白樣3；IPI00003734推定的S100鈣結合蛋白HNH0456N16.1；IPI0002957411IcDa蛋白；IPI00654821假定蛋白LOC54845異構體1；IPI00647572Dickkopf相關的蛋白-3前體；IPI00639879與胞質分裂蛋白sepA相似；IPI00657746與胞質分裂蛋白8的主要貢獻者(Dedicator)相似；IPI00555993管內皮生長因子受體3變異體。本文的MSCs由此可以用作任何或所有的這些蛋白質，或者由它們所分泌的任何蛋白或其它分子的來源。MSCs已經顯示出分泌大范圍的影響其周圍細胞的細胞因子和生長因子8。這些因子中的許多都是不易用鳥槍法(shot-gun)LCMS/MS檢測的小分子。因此，CM和NCM也通過與5種集中載有抗101種細胞因子/生長因子抗體的不同抗體陣列雜交來進行分析(同樣參見圖7)。抗體陣列排布血管生成序列I人類趨化因子抗體序列I基質金屬蛋白酶抗體序列I人類細胞因子抗體序列I人類細胞因子抗體序列V已經發現HuES9.E1MSCs在4種獨立制備的CM而非NCM中的3種培養基中重復分泌72種細胞因子/生長因子。72中蛋白通過抗體陣列(名稱、基因標識、基因ID)來識別1.MDCADAMI1GI_11496997-A；2.血管生成素ANGGI_42716312-S；3.BDNFBDNFGI_34106709-A；4.1-309CCL1GI_4506832-S；5.EotaxinCCLI1GI_22538399；6.MIP-1δCCL15GI_34335180-A；7.HCC-4CCL16GI_22538800；8.MCP-ICCL2GI_22538812-S；9.Ckβ8-1CCL23GI_22538807-A；10.Eotaxin-2CCL24GI_22165426-S；11.Eotaxin-3CCL26GI_22547151-S；12.RANTESCCL5GI_22538813；13.MCP-3CCL7GIJ3435401-S；14.MCP-2CCL8GI_22538815-S；15.MCSFCSF1GI_27262666-I；16.GM-CSFCSF2GI_27437029-S；17.GCSFCSF3GI_27437048；18.FractalkineCX3CL1GI_4506856-S；19.GRO-aCXCL1GI_4504152-S；20.1-TACCXCLI1GI_14790145-S；21.SDF-ICXCL12GI_40316923；22.BLCCXCL13GI_5453576-S；23.ENA-78CXCL5GI_41872613-S；24.IP-IOCXCR3GI_4504098-S；25.EGFEGFGI_6031163-S；26.FGF-4FGF4GI_4503700；27.FGF-6FGF6GI_10337586；28.FGF-7FGF7GI_15147344；29.FGF-9FGF9GI_4503706-S；30.Fit3LigandFLT3LGGI_38455415-S；31.GDNFGDNFGI_40549410；32.GCP-2GOLGA4GI_45359854-S；33.HGFHGFGI_33859834-S；34.IFN-γIFNGGI_10835170-S；35.IGF-IIGF1GI_199231H-S；36.IGFBP-1IGFBP1GI_4504614-S；37.IGFBP-2IGFBP2GI_10835156-S；38.IGFBP-4IGFBP4GI_10835020-S；39.IL-I0IL10GI_24430216-S；40.IL-12p40p70IL12BGI_24497437-S；41.IL-13IL13GI_26787977-S；42.IL-16IL16GI_27262654-A；43.IL-IaILIAGI_27894329-S；44.EL-1βIL1BGI_27894305-S；45.IL-2IL2GI_28178860-S；46.IL-3IL3GI_28416914-S；47.IL-6IL6GI_10834983-S；48.IL-7IL7GI_28610152-S；49.IL-8IL8GI_28610153-S；50.SCFKITLGGI_4580419-A；51.LEPTINLEPGI_4557714-S；52.LIFLIFGI_6006018-S；53.MIFMIFGI_4505184-S；54.MMP-IMMP1GI_13027798-S；55.MMP-10MMP10GI_4505204-S；56.MMP-13MMP13GI_13027796-S；57.MMP3MMP3GI_13027803-S；58.MMP-9MMP9GI_4826835-S；59.PARCPARCGI_24307990；60.PDGF-BBPDGFBGI_15451785-A；61.PIGFPIGFGI_27894289-A；62.TGF-β1TGFB1GI_10863872；63.TGF-β2TGFB2GI_4507462-S；64.血小板生成素THPOGI_40805871-S；65.TIMP-ITIMP1GI_4507508-S；66.TIMP-2TIMP2GI_9257247-S；67.TIMP-3TIMP3GI_21536431-S；68.TIMP-4TIMP4GI_4507514-S；69.TNF-αTNFGI_25952110；70.破骨細胞抑制因子TNFRSF11BGI_22547122-S；71.VEGFVEGFGI_30172563-S；72.淋巴細胞趨化因子XCL1GI_4506852-S.29種蛋白無法通過抗體陣列來進行檢測(名稱、基因標識、基因ID)bFGFCCL23GI_22538807-A；MCP-4CCL13GI_22538799-S；TARCCCL17GI_22538801-S；MIP-3bCCL19GI_22165424-S；MIP-3aCCL20GI_4759075-S；MPIF-1CCL23GI_22538807-A；TECKCCL25GI_22538797-A；CTACKCCL27GI_22165428-S；CCL28CCL28GI_22538810-A；MIP-1bCCL4GI_4506844-S；SDF-1aCXCL12GI_40316923-1；SDF-1bCXCL12GI_40316923-1；CXCL16CXCL16GIJ1545764-S；MIGCXCL9GI_4505186-S；MIP-1aCXCR6GI_5730105-S；IGFBP-3IGFBP3GI_19923HO-S；IL-15IL15GI_26787979-A；IL-4IL4GI_27477091-A；IL-5IL5GI_28559032-S；TNF-bLTAGI_6806892-S；MMP-2MMP2GI_11342665-S；MMP-8MMP8GI_4505220-S；NAP-2NAP1L4GI_21327711-S；NT-3NTF3GI_45359869-S；NT-4NTF5GI_34328933-S；制瘤素MOSMGI_28178862-S；TGF-b1TGFB1GI_10863872-S；LIGHTTNFSFl4GI_25952146-A；VEGF-DVEGFDGI_19924297-S。然而，只有3種基因產物，名為IGFBP2、TIMP1以及TIMP2也通過LCMS/MS分析得以檢測，這可能是因為多種細胞因子和生長因子是小分子物質而在傳統的LCMS/MS中無法進行檢測。LCMS/MS和抗體陣列分析各自所識別的132和72種基因產物具有3種共同基因，名為IGFBP2、TIMPl和TIMP2。因此，總計201種獨特的基因產物得到了識別(下表E2)表E2.由LCMS/MS與抗體陣列所識別的201種獨特基因產物的字母順序列表。由LCMS/MS與抗體陣列所識別的蛋白是組合的并通過它們的基因符號來表示。各種基因的轉錄水平利用高通量激光共聚焦微珠芯片平臺(IlluminaBeadArray)進行評估。這29種名稱為ENA-78，FGF-4，FGF-7，FGF-9，GCP-2，G-CSF，GM-CSF，GRO-a，HCC-4，HGF，IGFBP-I，IGFBP-2，IGFBP-4，IL-Iβ，IL-6，IL-8，IP-10，LIF，MCP-1，MCSF，MIF，破骨細胞抑制因子，PARC，PIGF，SCF，TGF-β2，TIMP-I，TIMP-2，VEGF的基因產物在之前已經被報道由源自MSCs(13、16、19-21)的成體組織來分泌。4種其它名為IGFBP3、MIP-3α、制瘤素M及TGF-β3(參照上面)的蛋白被報道由源自MSCs的成體組織所分泌，但未出現在我們的201種基因產物列表中。實施例10.源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)的蛋白質組分析通過基因組基因表達分析的驗證201種基因產物與通過把總RNA雜交結合至激光共聚焦微珠芯片平臺(IlluminaBeadArray)的方法所產生的hESC-MSCs全基因組表達譜進行的對比顯示134種或67％的基因產物具有高于檢測限(LOD)且置信度為99％(表E2)的基因轉錄水平。同時由LCMS/MS所識別的115種基因產物或132種基因產物的88％具有可檢測的轉錄水平(表E2)，通過抗體陣列所識別的27種基因產物或72種基因產物中的38％具有可檢測的轉錄水平，并且45種基因產物或72種基因產物中的38％的轉錄水平無法檢測到(表E2)。兩種基因產物的探針，ENO1B和SVEP1沒有出現在IlluminaBeadArray中。可能是72種基因中多數的轉錄水平都太低以致無法用IlluminaBeadArray檢測，因為已知編碼細胞因子/趨化因子的mRNAs具有豐富AU的元件，該元件可以導致轉錄期間mRNA的迅速降解。因此采用了更靈敏的qRT-PCR檢測。隨機選擇了72種基因產物中的42種并進行了檢測。如果用＜35的標準Ct值來定義成可檢測，那么36種基因產物或者42種基因產物種的86％都具有可檢測的轉錄水平(表E3)。該頻率相當于由LCMS/MS所識別的基因產物中觀測到的頻率88％，而其基因轉錄可以通過IlluminaBeadArray進行檢測。此外，所有轉錄水平可通過IlluminaBeadArray檢測的15種基因產物都可以用qRT-PCR對其轉錄水平進行檢測(表E3)。27種轉率水平無法通過IlluminaBeadArray進行檢測的基因產物中的21種(78％)都可以利用qRT-PCR對其轉錄水平進行檢測(表E3)。表E3.定量RT-PCR檢測轉錄產物。隨機選擇可為抗體陣列所識別的72種基因產物中的42種進行qRT-PCR分析。在IlluminaBeadArray檢測中，一種高通量全基因組表達檢測，12種基因產物具有高于檢測限(LOD)且置信度為99％的轉錄水平。每種基因的Ct值都相對于β肌動蛋白進行標準化。實施例11.源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)的蛋白質組分析由所分泌蛋白調節的生物學過程為了研究所分泌的產物是否具有修復受傷組織或器官的潛能，基因產物首先根據其生物學過程和依照基因本體(GO)中的途徑進行分類。隨后，所分泌的與各種過程或途徑相關的MSC基因組中獨特基因的頻率與用Unigene、Entrez即基因庫分類的數據庫中代表性途徑或過程的基因頻率進行了對比。與58種生物學過程和30種途徑相關的基因頻率明顯較高(p＜0.05)。通過基因本體分類的生物學過程受這201種獨特基因產物的調節這58種生物學過程可能接近于3個主要的組代謝、防御性反應以及組織分化，同時30種途徑可能廣泛地分成幾類受體結合、信號傳導、細胞-細胞間作用、細胞遷移、免疫響應以及代謝(圖8、圖9)。推定的生物學過程和途徑都提示所分泌的蛋白對調節能量產生的細胞代謝、細胞分解、大分子生物合成及分泌、消除損毀組織及產生新組織所必須的過程有較大影響(圖8、圖9)。與MSC合成培養基中細胞因子和趨化因子的大量出現并占據優勢地位相一致，分析也預測到所分泌的因子可能引起多種依賴于外部刺激的細胞響應例如趨化現象、趨性和多種免疫響應(圖8)。注意，該合成培養基也能誘導對組織分化尤其是促進血管形成、造血和骨生長來說是重要的生物學過程(圖8)。在那些被預測通過所分泌的蛋白質組進行調節的途徑中，受體介導的細胞因子結合以及ECM途徑與所分泌蛋白質組中的細胞因子和ECM成分相符(圖9)。能被所分泌的蛋白質組所激活的主要信號傳導途徑包括Jak-STAT信號途徑、MAPK信號途徑、Toll樣受體信號途徑、TGF-β信號途徑、mTOR信號途徑、FcεRI信號途徑和幽門螺桿菌感染中上皮細胞信號途徑。分泌蛋白質組的計算機分析也提示MSC分泌能夠加強細胞-細胞間的相互作用、遷移及免疫響應。實施例12.源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)的蛋白質組分析討論MSCs已經用于臨床前和臨床試驗中以治療眾多疾病(3-5，24-27)。然而，作用機制仍舊沒有得到準確地了解。雖然MSCs具有分化成多種細胞類型的潛能，例如能潛在地修復或再生損毀組織的內皮細胞、心肌細胞凋亡(cardiomyctes)、軟骨細胞，由于MSCs的分化效率通常太低而無法介導組織修復或恢復組織功能，因而MSCs的治療作用不能單獨受源自MSC的修復性細胞類型。MSCs的某些治療性作用可以通過MSCs(8)所分泌的旁分泌因子來介導。我們在此通過組合兩種技術，LC-LC-MS和抗體陣列描述了所分泌的hESC-MSCs蛋白質組的組成。雖然通過LC-LC-MS進行的鳥槍法(shot-gun)蛋白質組分析是一種靈敏的技術且具有高通量的能力，但是其無法檢測包括多數細胞因子、趨化因子和生長因子在內的小分子蛋白/肽。這種情況通過利用抗體陣列而得以部分緩解。采用這兩種技術所獲得的MCS分泌蛋白質的定性表達譜具有較高重復性。LCMS/MS所識別的蛋白出現在兩個獨立制備的幾批CM中，同時那學通過抗體陣列得以識別的蛋白質則出現在4種獨立制備的幾批CM中的至少3種當中。所獲的hESC-MSCs分泌蛋白表達譜幾乎包括所有之前所報道的源自成體組織的MSCs所分泌的因子，同樣還包括許多其它尚未公開的蛋白。蛋白質高水平表達通過采用高通量微陣列基因表達分析法對蛋白質表達譜中86％-88％基因產物的轉錄產物所進行檢測得到進一步證實。為了評價和估計MSC進行大規模分泌的前者性能，我們利用較易獲得的計算機工具對基因表達進行了分析，其基于基因產物而非基于后轉錄修飾蛋白。與細胞因子和趨化因子在分泌過程中大量出現并占據優勢地位相符的，計算機分析預測了諸如趨化現象、趨性、細胞對外部刺激的響應、細胞分解、大分子物質的生物合成及分泌、細胞因子-細胞因子受體相互間作用、細胞-細胞關聯以及基礎代謝例如葡萄糖代謝和氨基酸代謝之類通常與細胞因子及趨化因子相關的多種過程和途徑。本文所描述的MSCs能夠用于治療這些功能在其中起到一定作用的疾病。雖然這些過程和途徑對任何特定細胞或組織類型中的受傷、修復以及再生過程而言并不是特異性的，但是它們的促進免疫細胞遷移至受傷組織，細胞代謝中ECM的重塑和增加將對大多數受傷或患病組織產生緩解作用。除了這些與細胞因子和趨化因子相關的基因途徑外，計算機分析也預測到所分泌的蛋白調節包括血管形成、造血和骨生長的多種過程(3-5，24-27)。途徑分析進一步揭示了可能涉及介導MSCs的某些緩解作用的候選途徑。實際上，這些候選途徑多數都已經在血管形成、造血以及肌骨骼生物學。例如，Jak-STAT信號與保護作用(28)、造血(29，30)、以及骨胳修復和重塑(31，32)；MAPK信號則在心血管響應(33，34)、骨骼修復和重塑(32，35)以及造血作用(36)中扮演重要角色；Toll樣受體信號已涉及心血管病理學的開始和進展過程及先天與獲得性免疫(38)當中；TGF-β信號對正確的心臟發育、心臟重塑、心力衰竭與血管形成(39-41)過程、造血作用(42)、骨骼與軟骨的形成及重塑(27，43)以及一般性傷口的愈合(44)而言是關鍵性的；并且mTOR作為重要的細胞生長及分化調節因子其在正常的生理機能和疾病中扮演了非特異性但是關鍵的角色(45-47)。總之，我們對源自hESC的MSCs中分泌的蛋白質，包括已報道成體組織的MSCs所分泌的多種細胞因子在內，所進行的分析提示所分泌蛋白質組能夠潛在地對組織修復和再生尤其是對心臟血管、造血以及肌骨骼組織的修復和再生產生調節作用，從而為MSC移植研究中MSC所介導的對組織修復和再生的緩解作用提供了分子學支持。該分泌的蛋白質組也揭示了多種可進行較好檢驗的MSC介導組織修復分子機理假設且也揭示了調節組織修復與再生的潛在藥物作用靶點。源自hESC的MSCs和成體組織MSCs之間的明顯相似性提示任一MSC培養物的合成培養基都可能具有類似的生物學活性。由此，這表明通過我們的方法所獲取MSCs與源自的骨髓類似物具有顯著的生物學相似性。這些發現闡述了hESC-MSCs與成體BM-MSCs在其分泌緩解因子的能力方面具有共同指出。進一步地，本文所示MSCs所分泌的一種或多種蛋白質，包括合成培養基形式，可以用于和本文所述MSCs相同的目的。然而，hESC-MSCs與成體組織MSCs相比具有幾大有點。把hESC細胞系用作MSC的組織來源構成了可無限更新與擴增的組織來源，并加強了MSCs制備批次之間的重復性和一致性，由此獲得了臨床適用的CM。它也提升了CM制備的可測量性及研發低成本off-the-shelf療法的潛力。此外，用于制備hESC-MSCCM的不含血清的化學合成培養基減少了令人生厭且多樣化的與諸如血清或血清替代介質等相關的復雜培養基添加劑的污染。因此，我們對CM的闡述與基于MSC的生物制劑轉向臨床應用十分相關。實施例13.58種生物學過程中每個過程所涉及的201個基因的列表實施例14.30種途徑種每個途徑所涉及的201個基因的列表實施例15.實施例7-14的參考文獻1.LeBlanc，K.，andPittenger，M.(2005)Cytotherapy7，36-45。2.Reiser，J.，Zhang，X.Y.，Hemenway，C.S.，Mondal，D.，Pradhan，L.，andLaRussa，V.F.(2005)ExpertOpinBiolTher5，1571-15843.Hui，J.H.，Ouyang，H.W.，Hutmacher，D.W.，Goh，J.C，andLee，E.H.(2005)AnnAcadMedSingapore34，206-2124.Caplan，A.I.(2005)TissueEng11，1198-12115.Menasche，P.(2005)CurrOpinMoITher7，293-2996.Laflamme，M.A.，andMurry，C.E.(2005)NatBiotechnol23，845-8567.Kinnaird，T.，Stabile，E.，Burnett，M.S.，Shou，M.，Lee，C.W.，Barr，S.，Fuchs，S.，andEpstein，S.E.(2004)Circulation109，1543-15498.Caplan，A.L，andDennis，J.E.(2006)JCellBiochem9.Leedham，S.J.，Brittan，M.，McDonald，S.A.，andWright，N.A.(2005)JCellMoIMed9，11-2410.Togel，F.，Hu，Z.，Weiss，K.，Isaac，J.，Lange，C，andWestenfelder，C.(2005)AmJPhysiolRenalPhysiol289，F31-42.11.Patschan，D.，Plotkin，M.，andGoligorsky，M.S.(2006)CurrOpinPharmacol6，176-183.12.Miyahara，Y.，Nagaya，N.，Kataoka，M.，Yanagawa，B.，Tanaka，K.，Hao，H.，Ishino，K.，Ishida，H.，Shimizu，T.，Kangawa，K.，Sano，S.，Okano，T.，Kitamura，S.，andMori，H.(2006)NatMed12，459-465.13.Gnecchi，M.，He，H.，Noiseux，N.，Liang，O.D.，Zhang，L.，Morello，F.，Mu，H.，MeIo，L.G.，Pratt，R.E.，Ingwall，J.S.，andDzau，V.J.(2006)FasebJ20，661-669.14.Gnecchi，M.，He，H.，Liang，O.D.，MeIo，L.G.，Morello，F.，Mu，H.，Noiseux，N.，Zhang，L.，Pratt，R.E.，Ingwall，J.S.，andDzau，V.J.(2005)NatMed11，367-368.15.Mayer，H.，Bertram，H.，Lindenmaier，W.，Korff，T.，Weber，H.，andWeich，H.(2005)JCellBiochem95，827-839.16.Nakagami，H.，Maeda，K.，Morishita，R.，Iguchi，S.，Nishikawa，T.，Takami，Y.，Kikuchi，Y.，Saito，Y.，Tamai，K.，Ogihara，T.，andKaneda，Y.(2005)ArteriosclerThrombVaseBiol25，2542-254717.VanOverstraeten-Schlogel，N.，Beguin，Y.，andGothot，A.(2006)EurJHaematol76，488-49318.Cheng，L.，Qasba，P.，Vanguri，P.，andThiede，M.A.(2000)JCellPhysiol184，58-6919.Liu，C.H.，andHwang，S.M.(2005)Cytokine32，270-27920.Haynesworth，S.E.，Baber，M.A.，andCaplan，A.I.(1996)JCellPhysiol166，585-59221.Kinnaird，T.，Stabile，E.，Burnett，M.S.，andEpstein，S.E.(2004)CircRes95，354-36322.Barreau，C，Paillard，L.，andOsborne，H.B.(2005)NucleicAcidsRes33，7138-7150.23.Espel，E.(2005)SeminCellDevBiol16，59-6724.Bhatia，R.，andHare，J.M.(2005)CongestHeartFail11，87-91；quiz92-8325.Mauney，J.R.，Volloch，V.，andKaplan，D.L.(2005)TissueEng11，787-80226.Zimmet，J.M.，andHare，J.M.(2005)BasicResCardiol100，471-48127.Lin，Z.，Willers，C，Xu，J.，andZheng，M.H.(2006)TissueEng28.Negoro，S.，Kunisada，K.，Tone，E.，Funamoto，M.，Oh5H.，Kishimoto，T.，andYamauchi-Takihara，K.(2000)CardiovascRes47，797-80529.Ward，A.C，Touw，L，andYoshimura，A.(2000)Blood95，19-2930.Ungureanu，D.，andSilvennoinen，O.(2005)SciSTKE2005，pe4931.Blair，H.C，Robinson，L.J.，andZaidi，M.(2005)BiochemBiophysResCommun328，728-73832.Malemud，C.J.(2004)ClinOrthopRelatRes，S145-15133.Nigro，J.，Osman，K，Dart，A.M.，andLittle，P.J.(2006)EndocrRev27.242-259.34.Pandya，N.，Santani，D.，andJain，S.(2005)CardiovascDrugRev23，247-254.35.Berenbaum，F.(2004)CurrOpinRheumatol16，616-622.36.Platanias，L.C.(2003)Blood101，4667-4679.37.deKleijn，D.，andPasterkamp，G.(2003)CardiovascRes60，58-67.38.Ozato，K.，Tsujimura，H.，andTamura，T.(2002)BiotecliniquesSuppl，66-68，70，72passim.39.Euler-Taimor，G.，andHeger，J.(2006)CardiovascularResearch69，15-25.40.Bertolino，P.，Deckers，M.，Lebrin，F.，andtenDijke，P.(2005)Chest128，585S-590S.41.Bobik，A.(2006)ArteriosclerThrombVaseBiol.42.Ruscetti，F.W.，Akel，S.，andBartelmez，S.H.(2005)Oncogene24，5751-5763.43.Janssens，K.，tenDijke，P.，Janssens，S.，andVanHuI，W.(2005)EndocrRev26，743-774.44.Faler，B.J.，Macsata，R.A.，Plummner，D.，Mishra，L.，andSidawy，A.N.(2006)PerspectVaseSurgEndovascTher18，55-62.45.Wullschleger，S.，Loewith，R.，andHall，M.N.(2006)Cell124，471-484.46.Proud，C.G.(2004)CardiovascRes63，403-413.47.Tee，A.R.，andBlenis，J.(2005)SeminCellDevBiol16，29-37一般性參考文獻1.LeBlanc，K.&Pittenger，M.Mesenchymalstemcellsprogresstowardpromise.Cytotherapy7，36-45(2005).2.Xu，C.etal.Immortalizedfibroblast-likecellsderivedfromhumanembryonicstemcellssupportundifferentiatedcellgrowth.StemCells22，972-80(2004).3.Barberi，T.，Willis，L.M.，Socci，N.D.&Studer，L.Derivationofmultipotentmesenchymalprecursorsfromhumanembryonicstemcells.PLoSMed2，e161(2005).4.vandenBos，C.etal.Humanmesenchymalstemcellsrespondtofibroblastgrowthfactors.HumCell10，45-50(1997).5.Kilian，O.et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GC45991NM_002587.3)；PODXL(PCLP；Gp200NM_005397.2)；GPR64(HE6；TM7LN2NM_005756.1)；PROM1(AC133；CD133；PROML1NM_006017.1)；GPRC5C(RAIG3；RAIG-3NM022036.2)；CD24(CD24ANM013230.1)；CLDN3(RVP1；HRVP1；CPE-R2；CPETR2NM_001306.2)；TACSTD1(EGP；KSA；M4S1；MK-1；EGP40；MIC18；TROP1；Ep-CAM；hEGP-2；CO17-1A；GA733-2NM_002354.1)；HTR3A(HTR3NM_000869.1)；FGFR4(TKF；JTK2NM_022963.1)；ADCY1(NM_021116.1)；FGFR3(ACH；CEK2；JJTK4；HSFGFR3EXNM_022965.1)；IL17RB(CRL4；EVI27；IL17BR；IL17RH1；MGC5245NM_018725.2)；SORL1(LR11；LRP9；SORLA；gp250；SorLA-1NM_003105.3)；GPM6B(M6BNM_005278.2)；KCNS3(KV9.3；MGC9481NM_002252.3)；以及FZD3(Fz-3；hFz3NM_017412.2)。17、根據權利要求12-16中任一所述的方法，其特征在于，表明標記物包括CD24(登錄號NM_013230.1)。18、根據權利要求12-17中任一所述的方法，其特征在于，通過選擇CD105+、CD24-的細胞來獲得間質干細胞。19、根據權利要求12-17中任一所述的方法，其特征在于，通過用抗表面抗原的抗體標記細胞的方法來選擇間質干細胞。20、根據權利要求12-19中任一所述的方法，其特征在于，通過熒光激活的細胞挑選法(FACS)來選擇間質干細胞。21、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，這些細胞的傳代超過少于35代。22、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，這些細胞被增殖約14天，優選增殖約7天。23、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，胚胎干細胞(hESC)集落包括huES9集落。24、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，胚胎干細胞(hESC)集落包括H1ESC集落。25、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，所獲得的間質干細胞(MSC)展現出表面抗原表達譜，所述抗原是下列一種或多種，優選所有的抗原CD29+、CD44+、CD49a及e+、CD105+、CD166+和CD34-、CD45-。26、根據任一前述權利要求的方法，其中所獲得的間質干細胞(MSC)表現出HESX1、POUFL5、SOX-2、UTF-1和ZFP42中一種或多種，優選全部，表達減小。27、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，所獲得的間質干細胞(MSC)表現出OCT4、NANOG和SOX2中的一種或多種，優選全部，表達減小。28、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，所獲得的間質干細胞(MSC)表現出無法檢測到的堿性磷酸酶活性。29、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，所獲得的間質干細胞(MSC)如果被移植到SCID鼠中，其不會形成畸胎瘤。30、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，所獲得的細胞培養物是鼠特異性c-mos重復序列陰性的而人特異性alu重復序列則為陽性。31、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，所獲得的間質干細胞(MSC)能夠經受骨生成、脂肪生成或軟骨形成，優選能夠分化成骨細胞、脂肪或軟骨。32、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，所獲得的細胞培養物包含huES9.E1、huES9.E3或H1.E2。33、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，任何兩種或更多種，優選全部，間質干細胞都通過展示基本一致的基因表達譜的方法來進行選擇34、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，通過該方法所獲得的任何兩種或更多種間質干細胞分離物之間的基因表達相關系數高于0.9。35、根據任一前述權利要求的方法，其特征在于，任何兩種或更多種，優選全部，通過該方法所獲得的間質干細胞分離物彼此之間基本類似或相同(優選同源)。36、根據任一前述權利要求，其特征在于，利用該方法所獲得的間質干細胞與親代培養物細胞之間的基因表達相關系數高于0.8。37、一種獲得間質干細胞系的方法，該方法包括實施根據任一前述權利要求的方法，然后從所選細胞中獲得細胞系。38、一種獲得間質干細胞系的方法，該方法包括通過根據權利要求1-36中任一者所述方法獲得的間質干細胞，或者通過權利要求37所述方法獲得的間質干細胞，并分化細胞培養物、間質干細胞或間質干細胞系。39、根據權利要求38所述方法，其中分化間質細胞是骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞。40、能利用任一前述權利要求的方法來獲得的細胞或細胞系。41、從胚胎干細胞中獲得細胞培養的方法，該方法包括(a)提供胚胎干細胞集落；(b)分散hESC集落；(c)對分散的細胞進行增殖(i)不存在飼養層(ii)不含血清但存在有FGF2；以及(d)隨后獲得細胞培養物。42、權利要求41所述的方法，其進一步包括權利要求1-36中任一者所述的特征。43、一種疾病治療方法，該方法包括獲得權利要求1-39中任一所述的間質干細胞、間質干細胞系或分化間質干細胞，可以視情況而定地從間質干細胞或間質肝細胞系中獲得分化細胞，并對患者施用該間質干細胞、間質干細胞系或分化細胞。44、可用權利要求1-39任一所述方法獲得的間質干細胞、間質干細胞系或已分化間質干細胞在制備治療或者防治個體中所患疾病的藥物中的應用。45、一種藥物組合物，其包括可用權利要求1-39任一所述方法獲得的間質干細胞、間質干細胞系或分化間質干細胞，連同藥學可接受的賦形劑或載體。46、根據權利要求43或44所述方法，其中所述疾病從由以下物質所構成組中選擇心力衰竭、骨髓疾病、皮膚病、燒傷以及諸如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病等退行性疾病以及癌癥。47、合成細胞培養基的方法，該方法包括在細胞培養基中對可用權利要求1-39任一所述方法獲得的間質干細胞、間質干細胞系或分化間質干細胞進行培養，并且可視情況而定分離該細胞培養基。48、可根據權利要求47的方法獲得的合成培養基。49、獲得實施例10-14中任一所述多肽的方法，該方法包括獲得權利要求1-39任一所述的間質干細胞、間質干細胞系或分化間質干細胞，并從間質干細胞、間質干細胞系或分化間質干細胞中分離所述多肽。50、根據權利要求48所述的合成培養基在個體疾病治療方法中的應用。51、基本按照上文中參考附圖1-9所述的以及按照附圖1-9所示的獲得細胞培養物的方法。52、基本按照上文中參考附圖1-9所述的以及按照附圖1-9所示的獲得間質干細胞的方法。53、基本按照上文中參考附圖1-9所述的以及按照附圖1-9所示的獲得細胞培養物的方法。54、基本按照上文中參考附圖1-9所述的以及按照附圖1-9的獲得的細胞培養物、間質干細胞、間質干細胞系或分化間質干細胞。全文摘要我們描述了一種獲取細胞培養物的方法，該方法包括提供通過把人胚胎肝細胞(hESC)集落及其衍生物進行分散，并在沒有細胞飼養層的情況下，在含有FGF2和可選擇的PDGFAB的無血清培養基中增殖細胞。優選地，采用分散劑對人胚胎干細胞(hESC)集落進行分散，所述分散劑為胰蛋白酶。文檔編號C12N5/0775GK101341244SQ200680041020公開日2009年1月7日申請日期2006年8月15日優先權日2005年9月2日發明者林賽江,埃利亞斯·賴申請人:新加坡科技研究局