環介導等溫擴增-納米硫化鎘標記電化學檢測單增李斯特菌的方法

專利名稱：環介導等溫擴增-納米硫化鎘標記電化學檢測單增李斯特菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種基因鵬檢測方法，具糊用環介導^T增(LAMP)獄與納嘛己電化學DNA 傳^^ra翻,^W氏薪中屬特異性基因(actA)的方S~~^環介導^T增-納米硫化鎘硫 電化雜測糊李鵬菌航法。
技術背景^if^(t菌(Listeriamonocytohenes)是一種廣泛分布于自然界的 ， fch壤、Jft^7K、 ^*、 駄、植物、青綱斗、 中瓶織被，所以繊很容易食入織，并艦口腔-鞭的謝鄉亍 傳播。據f隨，MmAHM中^t李氏菌W^率為0.6-16。/。，有70"/。的人可矢翻帶菌，4~8%的水產品、 5-10%的奶及其產品、30%以上的肉制品及15%^±的家糊被繊污染。單核細鵬生魏特氏菌是 一種人畜共患病的病原菌，是李鵬菌中唯一能引起人^i的一類。織生存環境可塑性大能耐受 較高的Mffi，在酸性堿性割牛下tl i^強的生存能力，能在242。C下生簾也有J腿0'C會緩個1^長)，能招zKll74^內較卡時間生長繁殖，不易被凍融，是mt食品lW人類MS的i^原菌之一。Ai要iia食入鄉酪、未充分加熱的雞肉、未幫効口熱的繊、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、 生判f、羊排、巻H凍色拉、錢、西紅柿、法式t縱、凍^^m麟糊李ffi^菌，約占85 —90%的病例是由波污染的食品弓胞的。該菌也可MI^W^JK、粘raA體內而it^i^，孕婦ii^后m^盤^^it^fl臺jut新生兒棲居于陰道、子宮頸的織也引^i染，性織蟲也是本病傳播的可能 激，且有上升激麟后錢彭助lfofll癥、腦膜炎和報細鵬多。以往檢測糊李船寺菌的戰方法有三沐1.生敏化鑒定獄，該法費時，謝衞貞，不能滿足病害防治的需要；2. KK^疫吸附微；3.聚^H^Sm法(PCR法)，該方激前兩種方法鵬、 靈敏，但需要昂貴的PCR儀。目前尚未鵬環介導^a擴it^法與納賴祐電化學DNA傳liK^ffl 檢測糊李鵬氏菌,法。電分析化學施具有職'斷，靈敏高，檢測方便鵬，儀 槲賺 糊鵬 面過程、薄膜條電子線過程的石欣。電化學DNA傳離是電分析化學的 一個SS分支，是指用固定化DNA作為^ i賜i」物質的電化學生物傳自。謝專li^愚射乍為^T識 別物質的S^tS^、單鏈DNA(ssDNA) ^X鏈DNA(dsDNA)固定在作為換能器的電&Jl，然后將與 互補DNA(csDNA)、藥物、化，、自由 相互作用的生物學信號轉妙電化學信號而進行檢測的器 件。它牛親iJ飽于具有特^ff列DNA的研究，能l^t檢測DNA序列，具有J^:低，易Tft^iW咱動 化 ^ 發明內容本發明的目的^Jii^ft米硫化鎘iHB電化學DNA傳ffi^:與環介導^a擴增ra檢測，^lt 氏菌actAs基因的^4~~^介導^U擴增一納米硫化鎘械己電化^^測糊李^#菌的方逸以劃艮 現有獄的缺點，從而為^WS的基因翻,簡單靈敏,法。本發明的主要原理為(1) i^^設i"h^且可以i賜脾巴DNA六個不同序列的兩個內弓吻(上游內引 物和下游內弓l物)和兩個外弓胸(上齡卜引物和下微卜弓胸)，內引t/^含耙DNA的IE3iC鏈和反義銀 (2)其中一個內引trt先和耙DNA雜交，ffijg的鏈置換DNA合 具^1*度,換活性的DNA聚彌的參與下由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA，荊乍為由雜效鵬的另一端的1內引物和一個外 引物啟動的DNA合^fe，產生一個原始的莖環DNA; (3)內弓物以原始執DNA嫩嫌，啟繊 置換DNA的合成，產生"^h原始的莖環DNA和一，的由兩倍莖M的，DNA; (4)在^M劍牛 下，內引物以莖環DNA為微，il51驢^^成多^"辯巴DNAS^^列的新DNA，在一小時內 該循環^g^可^!EDNA累積到109拷貝。擴增的，與納^f立子標己DNA微電化學傳ii^相結合， iffil電極表面的好雜交和高靈鵬的電化翔啶，從而,增，的多少轉化為電信號的測定結果， 以超臉測糊 #菌的目的。本發明涉及的納米硫化鎘硫電化學DNA傳離術與環介導^W增糊翻,^^氏薪中 屬特異性基因(actA)的方法，其中的淑胖嚼液包括如下(1) — (5):(1) 環介導等|增(LAMP)腿液包括lOx"Hieimopol a^爰沖液、300—500nmol/LdNTP、 2—4mmol/L硫麟、0.8—1.2Mmo1上游內 弓物、0.8—1.2Mmol/L下游內弓物、0.2—0.3Mmol/L上微卜弓胸、0.2—0.3nmo]/L下微卜弓物和1—1.5 mol/L 甜艦，1U/pLUNG酶；其中10xTheimopol鵬緩沖液含有200mmol/LpH8.8的三茅遂甲基魏甲烷 —鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫麟、20mmol/L硫^^和1X曲feilX—100;其中上游內引物5'-AGGGGTTGGTnnTAGTCACTGTACGCCArnAAGAATCCArC-3';下游內引物5'-AAGACCGCACCAAAGCTAGCTGTnTAmTCCCTAAGTACGG-3'; 上微卜弓l物5'-CGGCTCTGATAAGTGACAT-3'; 下微卜弓l物5'-GCTTGnTGTTrCTGCTTGTr-3';(2) BstDNA聚娜8U/mL;上面臓環介導^W增(LAMP)鵬液敏23ML的最繼賊為2.5 pL l()xTli,pol 沖液、1.0ML10mmol/LdNTP (四種M^^核酸的混^tl)、 1.0ML20Mmol/L上游內引物(FIP)、 l.OpL 20nmol/L下游內引物(BIP)、 0.25ML20nmol/L上嫩卜引物(F3)、 0.25nL20^unol/L下微卜引物(B3)、 0.5nL100mmol/LMgSO4、 12.5nL2M甜^f口4pL滅菌雙蒸冰(ddH20)。(3) 納米硫化鎘(CdS)—微序歹喊己液，其帝恪施如下 將3.84^,乙働碟』5011^濃度為0.6—1.4mmol/L的氯化鎘(Cda2)^液中混合均勻，用0.5mol/LS^化鈉(NaOH)溶液調節混合液的pHlB勺為10.5—11.5，通氮氣驗25—45 min后，在勸 下向 戰混合液中氮氣微下緩侵滴加1.34誦11的硫化鈉拜)溶液25 —40mL。滴加完畢后， 24h，混合^Mmttk^^黃色，即得到納米CdS溶膠。取5.0mLCdS納米溶M心純化，7K艦分散于 2.0mL水中，力口入100 pL40.0—60.0mmol/L Z^S(3—二甲基氨^a二30KfeMfe(EDC)、 100mL40.0 —60.0 mmol/LN—^^fflSt!EI安(NHS)及0.1 mmol/LMf序列(5'-TTTATnTCCCTAAGTACGG-3')， 室溫下 15-20 h， ^a^tlSl0000r/minT^心25—45min，用PBS溶液洗滌多次，再分散于PBS 溶液中，得船有硫徽序列的納米CdS—徽序列硫液，于-2T下保蹄用。(4) 待測糊^M寺菌單鏈目標序列錢電極表面的固定 將金電極在^IR比為3:7的30。/。雙ft7K^濃硫酸的混合溶液中加熱5min，以除去有Dl^質；然后將該金電t細0.05Mm的三氧^Il鋁(MA)懸濁Wfi， g^依次在翻、乙醇、二次蒸餾水中超聲洗滌2_4 min,《臉電極表面^mii面，然后^A8.0—14.0 mmol/L統基乙l^g液中，室溫下 ^且裝10— 15 h，取出后用^M/JC浸泡jm，即得到MS乙醇自組^^,的金電極(SAM/Au)。將^if^i^菌雙鏈目標序列Wr增^ttei00 。c水浴中蕭弗io^Ht，然后在冰浴中'^IJti卩得到待測^ii李9^菌單鏈目標序列，將SAM/Au電極ifA含4.0—6.0mmol/L滿3—二甲基氨M^二MJKSfe鵬(EDC)和 待測糊^1#菌單鏈目標序列啦—(N—嚇代)乙繊(MES)緩沖液中20—3(m呆存15—25h，取 出電豐細^M磷Mfe緩沖液(PBS)沖微min除去未固定的待測^Jt李,菌單鏈目標序列，g卩得到固 定有待測糊^f^菌單鏈目標序列制,電極(ssDNA/S層Au)。(5)Jd^,電at固定的待測i^i^lt菌單鏈目標序列與納米CdS— #列標己液中的標己 微序列的雜頓進行電化翔啶將固定了待測，李,菌單鏈目標序列附,電^^A^I米CdS — W"序列fei己液中，40T水 浴中反應30—50min，自然冷卻，取出后用含0.1%十二^ 酸鈉(SDS)的PBS浸泡并，電極，除 去未雜交的豐斜己W"序列。用150pL1.0mol/LHNO3溶解金電極表面的納米CdS4—8min，將所得溶液 移至2.0mL含2.5x104 —3.0xl04mol/L汞離T(Hg^的氨一氯化銨(NH3 —NH4Cl)緩J4^液中。以玻 碳電極為工作電極，NH3—NH4Cl為Eyt 質，細同位鍍汞陽極溶出法測定釋放出的Cd,子，在-1.01 V 處出現的陽極溶出峰電流即為測量信號，進行同位旨陽極溶出伏安^^的電化學工1條的 如下、Kf只時間250—350s， 、Kf只電位-l.l -1.3V，電位增量0.003 —0.005V，振幅0.04—0.06V，脈沖寬 度0.04—0.08 s，采樣繊0.02s，脈沖周期02s。艦戰方法檢測糊李船寺氏謝,法，依次包括下列步,—(3):(1) 待檢樣品細菌DNA的提取樣品核酸^H取方法不限定，只要倉^f呆iai取的DNA光密度的比值(OD26(y280)1.6—2.0并且mg^lj 10—lOOng/pL即得到待測樣品中細菌DNA糊飄。(2) 利用戰縱腿行輞^lt氏薪幅特異性基因(actA)環介導離擴增鵬A ^W23pL LAMP鵬液的腿管中加入lpL待檢樣品DNA微，于恒溫50 。C總3 min 后于95 。C 3 —5 min，立即置于冰上1 —3 min;B. ;feJd^鵬管中力口入lMLBstDNA聚娜；C. 于直溫60—65 。C腿45 —90 min;D. 將皿調到80—95°C， M^3—5min后中ihSM導到環介導^M擴增H^的M^1f菌雙鏈 目標序列WT增，，取出待用。(3) 待測糊^lft寺菌單鏈目標序列錢電極表面的固定 將J^M導糊李腑寺S^鏈目標序列的擴增J3^ 100 。C水浴中蕭弗10溯，然后在冰浴中'腿,尋到待測糊^tt菌單鏈目標序列(目標ssDNA)，將S層Au電極臥含4.0—6.0 mmol/LEDC 和目標ssDNA的MES緩沖液中20—30 T保存15—25 h，取出電棚媳PBS沖洗5 min除去為固定 的目標ssDNA，即得到固定有目標ssDNA飾,電極(ssDNA/SAM/Au)。(4) ，的納米CdS-^"序列標己液中糊新BMf序列與固^bS電極上的目標ssDNA雜交 得到納賴祝微—目標觀鏈DNA:將固定了目標ssDNA的j,電tM5cAW"序列felB液中，40 ^ 7K浴中鵬30—50min，自^tiP， 取出后用含0.1% SDS的PBS浸泡并沖冼電極，除去未雜交的目標ssDNA，即得到納^iH己徽一目標雙鏈DNA。(5)標己徽一目標觀鏈DNA的電化^i定 用150 nL 1.0 mol/LHN03溶解金電極表面上的納^l^i己徽一 目標雙鏈DNA上的的納米CdS 4—8 min，將戶屑f^繊至2.0mL含2.5x104—3.0xl()4mol/LHg^的NH3—NH4C1緩74^液中。以繊電極 為工作電極，NH3-NH4Cl為iJ 質，細同位線陽極溶出法測定釋放出的CcP^子。在-l.OlV處出現 的陽極溶出峰電流即為測量信號，此信號即為電化^^測^ii^lt菌的依據，進行同位鍍榮陽極溶出 伏安齒頓的電化學工作站的織體如下實^^i口下繊時間250—350s，繊電位-l."l,3V， 電位增量0.003"0.005V，振幅0.則.06V，脈沖繊0.04"0.08 s，采樣繊0.02s，脈沖周期0.23。
具體實施方式
下列^li例進一與兌明本發明，但不應當作) **發明的限制。織例l按下艦方制作納米硫化鎘(CdS)—微序列硫瓶 (1)納米CdS X^tl"序列的硫 將184ML,乙働n到50mL濃度為L0mmoJ/L的CdCl2溶液中混合均勻，用0.5mol/LNaOH溶 液調節混合液的PH1B勺為11，通氮氣驗30min后，在勸^^和氮氣W下向i^混合液中緩漫滴 加134mmol/L的Na2S溶液30mL。滴加完畢后，^^24h，混合^ 1& ^色。i^^鄉恪 的CdS量子點具有良好的穩定性，艦餅TMH個月不姓沉淀。取5.0 mL CdS納米溶麟心純化，7K鵬分散于2.0 mL水中，加入10050.0 mmol/L EDC、 100 50.0 mmol/LNHS及0.1 mmol/LW"序列，室溫下,18h， 10000 r/minT^心30 min，用PBS溶液洗滌多次，再分散于PBS溶液中，得到納米CdS-W"序列標己液，于-2。C下保存。按照以T^ilW行織(1) 樣品DNA的提取^ffl GBT 19495.3-2004方 iil取藤中樣品的DNA。(2) 進行糊李鵬氏薪中屬特異性基因(actA)環介導離擴增鵬A. 碟有23 mL LAMP ^gjS液A的^SiS管中加入lpL待檢賺DNA，和0.5pL的UNG酶，于直 船條上50。C體3min， 95。C艘5min，立即置于冰上lmin;B. 在S^管中加入1 ^LBstDNA聚合酶B;C. 于恒i&K浴上65 'C腿1小時；D. 將7K浴調到80。C，閱左3min后中ihS^取出反應管，即得到環介導^T增^的，李斯 特菌雙鏈目標序列的擴增 ，將其駄4。C恒溫待用。(3) 待測糊^#菌單鏈目標序列錢電極表面的固定 將將金電極在^^只比為3:7的30。/o雙ft7jCf口濃硫酸的混合溶液中力口熱5min，以除去有m^質；然Jg將金電豐細0.05拜的"203懸濁 ^， ^^依次在,、乙醇、二^^tg7K鵬2min，般電極表 面^5t滑鏡面，然后MAlO.OmmoI/L織乙H^液中，室溫下m^且裝12h，取出后用^fcK浸泡沖 洗，即得到織乙醇自^a〈,的金電極(S層Au)。將環介導^T增鵬的糊^f^艦鏈目標序列的擴增產物在ioo 。c水浴中煮沸10分鐘，然后在冰浴中'Kii7軸i]得到待測^ii李鵬菌單鏈目標序列(目標ssDNA)，將SAM/Au電極^A含5.0 mmol/LEDC和目標ssDNA的MES緩沖液中25 ^保 存18h，取出電卞翻^ftPBS沖洗5min除去未固定的目標ssDNA，即得到ssDNA/SAM/Au。(4) 納米CdS^^十序列feia液中的feifi^^序列與固定^hM電t肚的目標ssDNA雜交得到納米 *^^#-目標繊。亂.將固定了目標ssDNA飾,電t^CATO"序列fei己液中，40 T7jC浴中鵬40min，自然7細，取 出后用含0.1% SDS的PBS浸泡并沖冼電極，除去未雜交的目標ssDNA，即得到納*^^ "-目標雙 鏈DNA。(5) 納^l射己W"-目標觀鏈DNA的電化^i定用150pL 1.0mol/LHNO3溶解金電極表面上固定的納米fei己W"—目標觀鏈DNA上的納米CdS 5 min，將戶屑f^繊至2.0mLNH3-NH4Cl緩沖溶液中(含2,7xl04mol/LHg2,。以繊電極為工作電極， NH3-NH4Cl為Eilf質，^ffi同位M^陽極溶出法測定釋放出的a產離子，以-1.01V處的陽極溶出峰為測 量信號，此信號即為電化^^測，李,菌的依據，進行同位 陽極溶出伏安^{，的電化學工作 站的^[體如下^^如下^3R時間300s，沉積電位-L2V，電位增量0.004V,振幅0.05V，脈 沖繊0.063，采樣寬度0,02s，脈沖周期0,2s。鄉例2按下列方法檢測肉食品中^^有糊 #氏菌 (1)納米硫化鎘CdS-撤序列硫液的配制將3.84 pL統基乙酸加到50 mL濃度為1.0 mmol/L的CdCl2溶液中混合均勻，用0.5 mol/LNaOH溶 液調節混合液的pHiB勺為11 ，通氮氣驗30 min后，在勸i^TF向±^混合液中緩慢滴加1.34 mmo!/L 的N32S溶液30mL(氮氣微)。滴加完畢后，繼^^24h，混合^M郝也^m色。i^^鄉恪的CdS量子點具有良好的穩定性，m餅T^an個月不姓沉淀。取5.0 mL CdS納米溶麟A鄰化，水瓶分散于2.0 mL水中，加入100 50.0 mmol/L EDC、 100 pL 50.0 mmo!/LNHS及0.1 mmol/L^f序列，室溫下,18h，該/5^鵬10000 r/minT^心30 min，用 PBS溶液洗滌多次，再分散于PBS溶液中，得到納米CdS-W"序列fei己液，于-2T下保存。按照以下禾聘進行娜(1) 樣品DNA的提取鵬商業DNA提取微U^I取樣品的DNA，保UE^取的DNA OD260/280倉^^超ij 1.8即可，濃(2) 進行actA基因環介導^T增鵬a ;S^t23MLLAMPHiS液A的鵬管中力口入lML待檢微dna，和0-5mL的UNG酵，于直 M7K浴上50。C方燈3min， 95。C腿5min，立即置于冰上lmin;B. 在鵬管中加入lMLBstDNA聚娜B;C. 于度船K浴上65。C體lh;D. 將水浴調到80°C ， g 3 min后中ihS^得到環介導^T增^Z的^!ii李皿菌雙鏈目標序列 的擴增，，取出待用。(3) 待測糊李^)t菌單鏈目標序列錢電極表面的固定將金電極在^^只比為3:7的30y。雙ft7KS^硫酸做昆合溶液中加熱5min，以除去有tl^質；然后將 金電豐細0.05阿的^203懸濁M^， ^^依次在翻、乙醇、二7^^餾7]<^聲211^1， {臉電極表面 Jt)t滑鏡面，然后臥10.0mmol/L統基乙H^液中，室溫下M)^且裝12h，取出后用^A7K浸泡沖冼， 即辭臓乙醇自組纖,的金電極(S層Au)。將環介導^W增鵬的糊李鵬菌雙鏈目標序 列的擴增;^t^ 100 。CtK浴中蕭弗10倂中，然后在冰浴中'|^1辨卩得到待測^|^#菌單鏈目標序列 (目標ssDNA)，將SAM/Au電極^tA含5.0mmol/LEDC和目標ssDNA序列的MES緩沖液中25 保 存18h，取出電t細大量PBS沖洗5min除去未固定的目標ssDNA，即得到ssDNA/SAM/Au。(4) 納米CdS- W"序列fei己液中的iH己W"序列與固定^h^電feii的目標ssDNA雜交得到納 賴祝微-目標觀鏈DNA:將固定了目標ssDNA的f斷布電豐誠j[A^f序列iH己液中，40 ^7K浴中破40min，自然7賴P，取 出后用含0.1% SDS的PBS浸泡并沖冼電極，除去未雜交的目標ssDNA，即得到納*#1己 -目標雙 鏈DNA。(5) 納^t射己^f-目標頂鏈DNA的電化對啶用150ML1.0mol/LHNO3溶解金電極表面上的納米fei己徽-目標雙鏈DNA上的納米CdS5min， 將所ff^鵬至2.0 mL NH3-NH4C1緩M^液中(含2.7x104 mol/L Hg^)。以繊電極為工作電極， NH3-NH4C1為電解質，^ffl同位,陽極溶出法測定釋放出的Crt子，以-1.01V處的陽極溶出峰為測 量信號，此信號即為電化^^測， #菌的依據，進行同位 陽極溶出伏安^^的電化學工作 站的織體如下^f只時間300s， ^S只電位-L2V，電位增量0.004 V，振幅0.05V，脈沖敏0.06s， 采樣離0.02s，脈沖周期(X2s。蹄,列表 <110>青島禾根大學<120>環介導^T增-納米硫化鎘硫電化雜測糊^ lt菌航法<160>4<210>1<211>44<212>DNA<213> AI^列<221> prim—bind<22>(1)...(44)<400>1aggggti^t tttttagtea c^tacgcca tttaagaatc cate 44 <210>2<211>43 <212>DNA <213> AIJ^列 <221> prim—bind <222>(1)...(43) <W0>2aagaccgcac caaagctagc tgttttattt tccctaagta egg 43<211>19 <212>DNA <213> AZ^列 <221> prim—bind <222>(1)"19)cggctolgataaglgacat 19〈11>21<212>DNA<213> AX)^列<221>prim—bind〈2》(1)…(21),〉4gcttgtHgtttotgcttgtt 21<210>5〈11>20<212>DNA<213> AXi^列<221>prim—bind〈2》(1)…(20)<400>5Tttattttcc ctaagtacgg 20
權利要求
1.一種環介導等溫擴增-納米硫化鎘標記電化學檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于該方法包括以下步驟首先用環介導等溫擴增反應得到擴增反應物--待測單增李斯特菌的雙鏈目標序列、將該雙鏈目標序列在水浴中熱解成單鏈目標序列后在金電極表面自組裝固定，即得到待測單增李斯特菌的單鏈目標序列修飾電極、然后將納米硫化鎘對來源于單增李斯特菌的探針序列進行標記得到標記探針序列，將該標記探針序列與目標序列修飾電極上的目標序列進行分子雜交，并以同位鍍汞陽極溶出法進行電化學測定，所得電化學信號即為電化學檢測單增李斯特菌的依據，且環介導等溫擴增反應中含有(1)和(2)溶液(1)環介導等溫擴增反應液包括10×Thermopol反應緩沖液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸鎂、0.8-1.2μmol上游內引物、0.8-1.2μmol/L下游內引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜堿，1U/μL UNG酶；其中10×Thermopol反應緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X-100；其中所述上游內引物5-AGGGGTTGGTTTTTTAGTCACTGTACGCCATTTAAGAA TCCATC-3；下游內引物5-AAGACCGCACCAAAGCTAGCTGTTTTATTTTCCCTAAGTACGG-3；上游外引物5-CGGCTCTGATAAGTGACAT-3；下游外引物5-GCTTGTTTGTTTCTGCTTGTT-3(2)Bst DNA聚合酶8U/μL。
2. 如權利要求1中所述的環介導等溫擴增-納米硫化鎘標記電化學檢測單增李斯 特菌的方法，其特征是上述的dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為 dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。3. 如權利要求1中所述的環介導等溫擴增-納米硫化鎘標記電化學檢測單增李斯特菌的方法，其特征是上述的環介導等溫擴增反應依次包括下列步驟(1) 待檢樣品DNA的提取提取樣品核酸，即提取待檢樣品DNA作為環介導等溫擴增反應的模板，其中提 取樣品DNA的光密度值OD26o,28o在1.6-2.0范圍內，濃度在10-100 ng&L之內；(2) 進行環介導等溫擴增反應A. 在裝有23 ^LLAMP反應液的反應管中加入1 上述的待檢樣品模板DNA， 恒溫50 。C放置3 min后于恒溫95 。C放置3 —5min，立即置于冰上l一3 min;B. 在反應管中加入1 ^LBstDNA聚合酶；C. 于恒溫60 — 65 。C放置45 — 90 min;D. 將溫度調到80 — 95 °C，反應3 — 5 min后中止反應得到環介導等溫擴增反應 的單增李斯特菌雙鏈目標序列的擴增產物，取出待用。4. 如權利要求1中所述的環介導等溫擴增-納米硫化鎘標記電化學檢測單增李斯 特菌的方法，其特征是上述的環介導等溫擴增反應的單增李斯特菌雙鏈目標序列的擴 增產物雙鏈目標序列在水浴中熱解成待測單增李斯特菌單鏈目標序列后，在金電極表 面自組裝固定得到待測單增李斯特菌目標序列修飾電極的步驟如下首先將金電極在體積比為3:7的30%雙氧水和濃硫酸的混合溶液中加熱5 min，以 除去有機雜質；然后將該金電極用0.05 pm的三氧化二鋁懸濁液拋光，接著依次在丙 酮、乙醇、二次蒸餾水中超聲洗滌1-4 min，使金電極表面成光滑鏡面，然后浸入8.0-14.0 mmol/L巰基乙醇溶液中，室溫下避光組裝10-15 h，取出后用大量水浸泡沖洗，即得 到巰基乙醇自組裝膜修飾的金電極；然后將單增李斯特菌雙鏈目標序列的擴增產物在 100'C水浴中煮沸10分鐘，然后在冰浴中快速冷卻得到待測單增李斯特菌單鏈目標序 列；再將上述巰基乙醇自組裝膜修飾的金電極浸入含4.0-6.0 mmol/L乙基(3-二甲基氨 丙酸)碳二亞胺鹽酸鹽和單鏈目標序列的2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液中20-30 'C保存 15-25 h，并取出用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液沖洗5 min除去未固定的待測單增李斯特 菌單鏈目標序列，即得到固定有待測單增李斯特菌單鏈目標序列的修飾電極。5. 如權利要求1中所述的環介導等溫擴增-納米硫化鎘標記電化學檢測單增李斯 特菌的方法，其特征是上述的納米硫化鎘對來源于單增李斯特菌的探針序列進行標記 得到納米硫化鎘-探針序列標記液的制備步驟如下將3.84 巰基乙酸加到50 mL濃度為0.6-1.4 mmol/L的氯化鎘溶液中混合均勻，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調節混合液的pH值為10.5-11.5，通氮氣除氧25-45 min后， 在磁力攪拌和氮氣保護下向上述混合液中緩慢滴加1.34 mmol/L的硫化鈉溶液25-40 mL，滴加完畢后，繼續攪拌24h，混合液逐漸地變成黃色得到納米硫化鎘溶膠，并取 5.0 mL納米CdS溶膠離心純化，水洗后分散于2.0 mL水中，加入100 40.0-60.0 mmol/L乙基(3-二甲基氨丙酸)碳二亞胺鹽酸鹽、100 40.0-60.0 mmol/L N-羥基琥珀 酰亞胺及0.1 mmol/L探針序列5-TTTATTTTCCCTAAGTACGG-3，室溫下攪拌15-20 h， 該反應物在10000 r/min下離心25-45 min，用磷酸緩沖溶液洗滌多次，再分散于磷酸 緩沖溶液中得到含有標記探針序列的納米硫化鎘-探針序列標記液，于-2 'C下保存待 用。6.如權利要求1中所述的環介導等溫擴增-納米硫化鎘標記電化學檢測單增李斯 特菌的方法，其特征是上述的納米硫化鎘-探針序列標記液中的標記探針序列與修飾電 極上的單增李斯特菌單鏈目標序列進行分子雜交并進行同位鍍汞陽極溶出法的電化 學測定的步驟如下將上述的固定有待測單增李斯特菌單鏈目標序列修飾電極放入納米硫化鎘-探針序列標記液中，40 。C水浴中反應30-50 min，自然冷卻，取出后用含0.1%十二垸基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖溶液浸泡并沖洗，除去未雜交的標記探針序列；再用150 pL 1.0mol/L硝酸溶解該電極表面上的納米硫化鎘4-8 min，將所得溶液移至2.0 mL含2.5xl(T4-3.0xlO-4mol/L汞離子的氨-氯化銨緩沖溶液中，以玻碳電極為工作電極，氨-氯化銨緩沖溶液為電解質，采用同位鍍汞陽極溶出法測定出上述溶液中的鎘離子，所 得的電化學信號即為電化學檢測出單增李斯特菌的依據。
全文摘要
本發明涉及一種環介導等溫擴增-納米硫化鎘標記電化學檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于該方法包括以下步驟環介導等溫擴增反應得到擴增反應物-待測單增李斯特菌的雙鏈目標序列、將該雙鏈目標序列在水浴中熱解成單鏈目標序列后在金電極表面自組裝固定，即得到待測單增李斯特菌的目標序列修飾電極、然后將納米硫化鎘對來源于單增李斯特菌的探針序列進行標記得到標記探針序列，將該標記探針序列與目標序列修飾電極上的目標序列進行分子雜交并進行同位鍍汞陽極溶出法的電化學測定，檢測出與檢測單增李斯特氏菌種屬特異性基因(actA)相應的鎘離子。本發明優點是快速、特異性強、靈敏度高而且使用方便。
文檔編號C12Q1/04GK101260424SQ20081009398
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月25日 優先權日2008年4月25日
發明者偉 孫, 奎 焦, 鵬 覃, 鐘江華, 高宏偉 申請人:青島科技大學