控制植物的開花時間的svp基因的制作方法

專利名稱：控制植物的開花時間的svp基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及控制植物的開花時間的基因和用該基因控制植物的開花時
間的方法。具體而言，本發明涉及源自擬南芥的控制植物的開花時間的SVP 蛋白、編碼SVP蛋白的基因、含有該基因的重組載體、被所述重組載體轉 化的植物、采用所述基因控制植物的開花時間的方法、以及采用所述SVP 蛋白或SVP蛋白的編碼基因搜尋控制植物的開花時間的蛋白或基因的方法。
背景技術：
植物的開花時間通常受環境條件的影響或由基因所決定。影響植物的開 花時間的因素包括外部環境條件(如光和溫度)和內部條件(如生長信號等)。
對于擬南芥，長期公認其開花時間隨光周期而改變；即在長日照條件下開花 時間加速，而在短日照條件下開花時間被延遲。例如，已知當植物于低溫下 生長時植物的開花時間明顯延遲。據信這種溫度影響是由于整體新陳代謝速 率的減慢。
植物是固著生物，因此暴露在環境中易受到各種各樣的非生物的和生物 的環境的脅迫。其中最常見的是溫度。在植物可忍受的溫度范圍內，很好理 解對低溫(尤其是接近冰點的溫度)的反應。植物進化產生了大量的適應性 機制，以應對低溫的挑戰。在擬南芥中，通過延長低溫脅迫可加速開花，該 處理被稱為春化。開花基因座C (FLC)的后天沉默對春化處理很重要，且這 種沉默是由于春化1(VRN1)基因、春化2 (VRN2基因)、以及春化非敏3 (VIN3) 基因的活性。
突變植物的分析鑒別了在冷馴化中依賴和不依賴于C重復結合因子 (CB鬥的信號傳導途徑，表明了植物采用不同機制以應對低溫(Sharma,P.etal.， 2005所oe扁"27- 1048-1059)。
對于擬南芥而言，在低溫適應期中誘導了很多基因的表達。具體而言， 發生了包括RD29A (也稱為COR78或LTI78)、 KIN1、 KIN2、 COR15A和 COR47 (或RD17)等基因的表達。
人們越來越關注全球氣溫變化的影響，其明顯影響了植物生長的環境溫 度。多組證據表明，近來觀察到的許多植物物種的開花時間的變化和植物呼 吸速率的上升與環境溫度的這些變化密切相關(Fitter, A.R and Fitter, R.S. 2002. Sc/e騰296: 1689-1691; Atkin， O.K. and Tjoelker, M.G. 2003. r，A 尸/"""c/. 8: 343-351)。
在USPNo. 6,225,530中，公開了從擬南芥中分離的控制植物的開花時間 的FT (開花基因座T)基因，由FT基因編碼的多肽和采用FT基因調節植 物的開花時間的方法。
盡管我們對通過低溫來調控植物生長的認識有了很大進步，但目前針對 環境溫度變化的植物反應的分子機制仍知之甚少。

發明內容
在這種情況下，在研究擬南芥中與控制開花時間的新機制相關的基因 時，本發明人發現了短營養階段(short vegetative phase) (SVP)基因能夠調 節擬南芥中的環境溫度信號傳導過程以及SVP介導的對開花基因座T (FT) 基因表達的控制能夠調節生長轉變至開花階段的時間，以應對環境溫度的變 化，從而完成本發明。
因此，本發明的一個目的是提能夠供控制植物的開花時間的SVP蛋白。 本發明的另一目的是提供編碼所述控制植物的開花時間的SVP蛋白的 基因。
本發明的另一目的是提供一種重組載體，其中，該重組載體含有所述控 制植物的開花時間的基因。本發明的另一目的是提供一種植物，其中，該植物轉化有所述載體。 本發明的另一目的是提供一種控制植物的開花時間的方法，其中，該方
法通過使用所述控制植物的開花時間的基因來控制植物的開花時間。
本發明的另一目的是提供采用所述控制植物的開花時間的基因和蛋白
來搜尋可控制植物的開花時間的蛋白或基因的方法。
本發明所分離的SVP基因和由所述基因表達的SVP蛋白，可用于改進
與植物開花相關的植物的光周期并且可用于搜尋在其他植物中負責調控開 花時間的基因。此外，本發明的優勢在于，通過加速植物的開花時間可在短 時間內產生花和種子，或通過延遲植物的開花時間持續誘導營養生長，以改 善有用植物部位(如葉片或莖)的生產率。


圖1顯示了擬南芥中SVP在依賴溫度的開花控制中的作用。M)長日照 條件下開花時間的突變體組在23'C和16卩下的開花時間。以上所列基因型 的數值表示了在16卩和23-C下開花時間的比值(16tV23'C)。誤差線表示標 準偏差。插圖顯示了在23'C和16t:下生長的野生型哥倫比亞(Columbia)(Co1) 植物和wp-^植物。(B)低溫對野生型植物(Col)中SVP表達的影響。通過實 時PCR測定在指定溫度下生長的10天齡幼苗葉片中SK尸、只C、 "J^Fr 的表達。以微管蛋白作為內標。(C)在23。C和16。C下生長的Sr尸.vGt^和 F7:vGtAS植物的IO天齡幼苗的組織化學分析。比例尺500jLmi。 (D)在16°C 和23'C下溫育的洋蔥表皮細胞中的SVP-GFP融合蛋白的細胞核定位 (nuclear localization)。以箭頭指示細胞核。采用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)作為細胞核染劑。比例尺10pm。
圖2顯示了 SK尸與FC4、 FM、以及凡C的遺傳相互作用。04)在長 日照條件下sv; -32/^-9、以及svp-W雙突變體在23'C和16°C的開花時 間。以下所列數值表示開花時間的比值(16。C/23。C)。(萬)在10天齡幼苗中和yi^的突變對svp表達的影響。(c)在缺失和獲得/^c等位基因功能的io
天齡幼苗中的svp表達。(z))在svp缺失和獲得功能突變體的io天齡幼苗
中的F丄C表達。(E)包含svp、^7'、以及y c的各種突變組合的突變體，在23 。C和16。C下的開花時間。Sr尸/WF丄C和sv; 為'F丄C分別表示野生型哥倫比 亞植物和wp-W植物。以下所列數值表示開花時間的比值(16。C/23。C)。
圖3顯示了SVP作為Fr阻遏物的作用。(力)在23。C和16。C下野生型(Co1) 和^v/ -W植物中Fr的表達時程。在6天、8天、10天、12天以及14天齡 幼苗中監測的Fr表達水平。(S)野生型(Col)和svp-32植物的10天齡幼苗在 23。C時的/ F7::Gt/S表達模式。比例尺500 pm。 (C) svp-32 >70、 svp-32 35&:Fr、以及yW0^W-2雙突變體在23T:和16"C下的開花時間。以下所列 數值表示開花時間比值(16。C/23。C)。
圖4顯示了 SVP蛋白與Fr啟動子中vCArG III的結合。(」)采用以 和FZC-/^4結構轉染的原生質體的染色質免疫沉淀試驗。表示了通 過PCR分析在1.8-kb的Fr啟動子和不同片段中鑒定的六個CArG基序
(vCArGI-VI)變種的位置。四倍系列稀釋的輸入DNA作為半定量標準。 輸入，總輸入染色質DNA; HA，使用HA抗體選擇的DNA; Myc，使用 Myc抗體選擇的DNA。 (S) SVP-HA蛋白對Fr啟動子活性的影響。顯示了 試驗所用的報告基因和效應基因的圖示。CArG基序的變種為灰色陰影，并 以小寫字母表示CArG基序所引入的突變。m3F7:丄t/C表示含有突變vCArG III的F7:'.丄C/C結構。
具體實施例方式
為實現上述目的，本發明提供了稱為鬼「,養/^虔fSr"的蛋白，該蛋白 源自擬南芥且由SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列組成，并且能控制植物的 開花時間。
本發明所述的能夠控制植物的開花時間的蛋白的范圍包括從擬南芥中分離的具有如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的蛋白和該蛋白的功能等效物。 術語"功能等效物"是指由于氨基酸殘基的增加、取代或缺失，而使所述功 能等效物具有與SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列具有至少70%，優選至少 80%，更優選至少90%，還更優選至少95%的同源性的氨基酸序列，從而 表示所述功能等效物是具有與SEQIDNO: 2所代表蛋白實質相同的生理活 性的蛋白。
術語"實質相同的生理活性"是指若在植物中被過度表達，所述活性可 延遲植物開花。更具體而言，可以是能夠實現通過控制植物的開花時間來應 對環境溫度變化的活性。優選地，本發明所述的控制植物的開花時間的SVP 蛋白具有如SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列。本發明所述的SVP蛋白可以 通過從天然來源(如植物細胞)中提取或通過使編碼SVP蛋白的重組核苷 酸表達或通過化學合成方法獲得。
本發明還提供了編碼所述控制植物的開花時間的SVP蛋白的基因。本 發明所述的控制植物的開花時間的基因包括編碼SVP蛋白的基因組DNA和 cDNA。優選地，本發明所述的基因可含有如SEQ ID NO: 1所表示的核苷 酸序列。而且，本發明所述的基因可以與能夠促進植物開花的FT (開花基 因座T)基因的CArG基序直接相連，以抑制FT基因的表達，從而控制植 物的開花時間。
所述核苷酸序列的變體也包括在本發明范圍之內。具體而言，所述基因 可含有與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少70% ，優選至少80°% ， 更優選至少90%，還更優選至少95%的同源性的核苷酸序列。所述特定的 多聚核苷酸的"序列同源性％"是通過比較在待比較區域中具有優化排列的 兩個核苷酸序列而確定的。在這點上，在待比較區域中的一部分多聚核苷酸 序列與參照序列(無任何增加或缺失)相比可含有與兩個序列的優化排列相 關的增加或缺失(即缺口)。
本發明還提供了含有本發明所述的控制植物的開花時間的基因的重組載體。所述重組載體優選是重組的植物表達載體。
術語"重組"是指能夠復制異源核苷酸，或能夠表達所述核苷酸、肽、 異源肽、或由異源核苷酸編碼的蛋白的細胞。重組細胞能以正義或反義的形 式表達在天然狀態的細胞中未發現的基因或基因片段。此外，倘若通過人工 手段將所述基因修飾或重轉入細胞，所述重組細胞可表達天然狀態發現的基 因。
本文中術語"載體"是指遞送至細胞的DNA片段和核苷酸分子。載體 可復制DNA并在宿主細胞中獨立復制。術語"遞送系統"和"載體"通常 可交替使用。術語"表達載體"是指含有所需編碼序列和在特定宿主微生物 中表達連鎖編碼序列所必需的其他適當核苷酸序列的重組DNA分子。可用 于真核細胞的啟動子、增強子、終止信號和多腺苷酸化信號都是公共熟知的。
植物表達載體的優選實例是Ti-質粒載體，當載體存在于適當宿主中(如 根癌農桿菌)時所述Ti-質粒載體可以將自身的一部分(即所謂的T區)轉 入植物細胞。其他類型的Ti-質粒載體(參見EP0116 718 Bl)目前通常用于 將雜交基因轉入到可以產生新植物的原生質體，這是通過適當地將植物細胞 或雜交DNA插入至植物基因組而實現的。Ti-質粒載體的具體優選形式是EP 0 120 516 Bl和USPNo.4，940，838中公開的所謂二元載體。可用于將本發明 DNA導入宿主植物的其他載體可選自雙鏈植物病毒(例如CaMV)、單鏈植 物病毒、以及源自雙粒病毒等的病毒載體(例如非完整植物病毒載體)。特 別在植物宿主不能被適當的轉化時，采用所述載體很有優勢。
所述表達載體可含有至少一個選擇標記。所述選擇標記是具有可通過普 通化學方法實現選擇的特性的核苷酸序列。可用于區分轉化細胞和非轉化細 胞的任何種類的基因都可作為選擇標記。實例包括除草劑(如草甘膦和草 酊膦)抗性基因；抗生素(如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素和氯霉素) 抗性基因，但不限于此。
對于本發明一個實施方式所述的植物表達載體，啟動子可以是CaMV35S、肌動蛋白、泛素、pEMU、 MAS或組蛋白啟動子中的任意一個，但不 限于此。.術語"啟動子"是指能夠結合RNA聚合酶以啟動轉錄且對應于結 構基因上游DNA區域的DNA分子。術語"植物啟動子"表示可啟動植物 細胞轉錄的啟動子。術語"組成型啟動子"表示在大部分環境條件和生長狀 態或細胞分化狀態下都有活性的啟動子。因為可采用多種機制在不同階段選 擇轉化體，本發明優選組成型啟動子。因此，本發明并不限制選擇組成型啟
動子的可能性。
對于上文描述的終止子，本發明可采用任何常規的終止子。實例包括-胭脂堿合酶(NOS)、水稻a-淀粉酶RAmyl A終止子、菜豆堿終止子、以及 根癌農桿菌Optopine基因的終止子等，但不限于此。關于終止子的必要性， 公知該區域能增強植物細胞轉錄的可靠性和效率。因此，在本發明中非常優 選使用終止子。
本發明還提供了被本發明所述重組載體轉化的植物。植物轉化是指任何 能夠將DNA遞送到植物中的方法。這種轉化方法不必要具有再生期和/或組 織培養期。對于雙子葉植物和單子葉植物而言，植物種的轉化都非常普通。 原則上，可采用任何轉化方法將本發明的雜交DNA轉化到適宜的祖細胞中。 可以在以下方法中選擇合適的轉化方法用于原生質體的鈣/聚乙二醇方法
(Krens, RA. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987， Plant Mol. Biol. 8,363-373);用于原生質體的電穿孔方法(Sh illito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3， 1099-1102);用于植物組成部分的微注射方法(Crossway A. et al.， 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185);用于多種植物組成部分的粒子轟擊 方法(DNA或RNA包被)(Klein T.M, et al., 1987， Nature 327， 70);或通過 植物侵入或完全成熟花粉或小孢子的轉化由根癌農桿菌介導基因轉移的
(非完整)病毒感染方法(EP 0 301 316)等。本發明優選的方法包括農桿 菌介導的DNA轉移。尤其是，優選采用EP A 120 516和USPNo.4,940,838 公開的所謂二元載體技術用于本發明。術語"植物組織"包括分化的或未分化的植物組織，包括根、莖、葉、 花粉、種子、癌組織和具有多種形狀的用于培養的細胞，即單細胞、原生質 體、芽和愈傷組織，但不限于此。植物組織可以是位于植物中的植物組織或 為器官培養、組織培養或細胞培養狀態下的植物組織。
本發明還提供了使用本發明的能夠控制植物的開花時間的基因來控制 植物的開花時間的方法。更具體而言，本發明提供了控制植物的開花時間的
方法，其特征在于，所述植物的開花時間被植物中SVP基因的過度表達所 延遲或被植物中SVP基因表達的抑制所加速。
對于在植物中實施過度表達SVP基因的方法，SVP基因可被導入到帶 有SVP基因的植物或不帶SVP基因的植物中。關于這點，術語"基因過度 表達"是指SVP基因以高于野生型植物的正常水平被表達。對于將SVP基 因導入植物，在啟動子的調節下，含有SVP基因的表達載體可用于轉化植
物。對此，啟動子無特殊限定只要能夠實現所插入基因在植物中的過度表達
即可。這種啟動子的非限制性實例包括CaMV的35SRNA和19SRNA啟 動子；源于元參花葉病毒(FMV)的完整轉錄啟動子和TMV的外殼蛋白啟動 子。此外，為了實現SVP基因在單子葉植物或木本植物中的過度表達，可 使用泛素啟動子。
對于抑制SVP基因在植物中的表達的方法，可采用本領域已知的多種 方法。術語"基因表達的抑制"包括抑制基因轉錄以及抑制其翻譯成蛋白。 此外，抑制不僅包括基因表達的完全終止也包括表達的降低。
為抑制特定內源基因在植物中的表達，使用反義分子是最普遍的。反義 分子抑制靶基因表達的機制，存在如下幾種方式通過形成三鏈抑制轉錄的 啟動，通過在RNA聚合酶形成開環的位點形成雜交鏈的抑制，與負責進行 翻譯的RNA形成雜交鏈的抑制，在內含子和外顯子之間的連接位置上形成 雜交鏈的剪接抑制，在形成Splisome的位點上形成雜交鏈的剪接抑制，通過 與mRNA形成雜交鏈來抑制由細胞核向細胞質的運輸，以及通過在翻譯啟動子的結合位點上形成雜交鏈來抑制翻譯啟動等。所述方法抑制轉錄、剪接或翻譯過程，最終都能夠抑制靶基因的表達。
本發明所用的反義分子可基于各種機制來抑制耙基因的表達。示例性的
反義分子包括形成三鏈的寡核苷酸、核酶、RNAi、以及反義分子等。形成三鏈的寡核苷酸環繞DNA以形成三鏈，從而抑制了轉錄的啟動(Maheretal" Antisense Res.禾口 Dev., 1(3):227, 1991; Helene， C., Anticancer Drug Design,6(6):569， 1991)。核酶是可特異性消化單鏈RNA的RNA分子。核酶可被人工改造，以使其能夠識別包含在RNA分子內的特定核苷酸序列，并進行位點特異性的消化(Cech, J. Amer. Med, Assn" 260:3030， 1998)。因此，該方法的主要優勢在于特異性地針對特定的核苷酸序列，能夠特異性地鈍化含有特定序列的mRNA分子。RNAi方法是使用對核苷酸序列有特異性作用的具有發卡形狀的小RNA分子來抑制轉錄水平或轉錄后水平(Mette et al.， EMBO J.，19: 5194-5201, 2000)。反義核苷酸是其中至少一部分序列與特定mRNA分子互補的DNA或RNA分子(Weintraub, Scientific American, 262:40， 1990)。反義核苷酸與細胞所含的相應mRNA雜交以形成雙鏈分子。從而，抑制了mRNA的翻譯(Marcus誦Sakura,Anal.Biochem., 172:289, 1988)。
本發明所述的控制植物的開花時間的方法可通過抑制SVP基因的表達而加速園藝植物的開花時間，以用于在短期內產生花和種子，或通過過度表達SVP基因而延遲作物的開花時間以實現營養生長的持續誘導，以用于增加可從農作物中獲取的有用植物部分的生產率。
所述植物可以是包括水稻、小麥、大麥、玉米、大豆、馬鈴薯、紅豆、燕麥和粟在內的食用作物；包括擬南芥、大白菜(Chinese cabbage)、蘿卜、辣椒、草莓、番茄、西瓜、黃瓜、巻心菜(cabbage)、甜瓜、西葫盧、韭菜、洋蔥和胡蘿卜在內的蔬菜作物；包括人參、煙草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、野生芝麻、花生和油菜籽在內的特用作物；包括蘋果、梨、棗、桃、獼猴桃、葡萄、桔子、柿子、李子、杏和香蕉在內的水果；包括玫瑰、劍蘭、大丁草、康乃馨、菊花、百合、和郁金香在內的花卉；和包括黑麥草、紅三葉草、鴨茅、紫花苜蓿、高酥油草、以及多年生黑麥草在內的飼料作物。
本發明還提供了通過上述的本發明方法制備的具有受控的開花時間的轉化植物。
通過本領域公知方法可獲得具有受控的開花時間的植物，例如有性繁殖方法或無性繁殖方法。更具體而言，通過有性繁殖方法獲得本發明植物是首先通過花授粉產生種子然后用其進行繁殖而實現的。此外，也可通過無性繁殖方法獲得，其首先以包括本發明SVP基因的重組載體轉化植物，然后誘導愈傷組織，按常規方法形成根并移植于土壤。換句話說，將已被包括SVP基因的重組載體轉化的植物部分置于本領域己知的適宜培養基中在適宜條件下培養以誘導形成愈傷組織，然后在形成植物芽之后立即將其轉移至不含激素培養基進行培養。大約2周后，將芽轉移至新培養基以誘導形成根。一旦根被誘導，將其移植至土壤中以獲得具有受控的開花時間的植物。根據本發明，轉化植物不僅包括整株植物還包括由其獲得的組織、細胞和種子。此外，本發明還提供了使用SVP蛋白或該蛋白的編碼基因進行分析以搜尋控制開花時間的蛋白或基因的方法，其中，所述分析選自由以下方法所組成的組中DNA芯片法、蛋白芯片法、聚合酶鏈式反應(PCR)、 RNA印跡分析(Northern blot analysis)、 DNA印跡分析(Southern blot analysis)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)和二維(2D)凝膠電泳分析。此外，通過確定出能夠與本發明基因結合的物質或可抑制或活化SVP基因表達的物質，本發明所述方法可以作為研究感興趣植物的開花機制的工具。更具體而言，可采用多種方法進行研究，包括DNA芯片法、蛋白芯片法、聚合酶鏈式反應(PCR)、RNA印跡分析、DNA印跡分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)和二維(2D)凝膠電泳分析等。
將參照以下實施例更為具體地描述本發明。但是，其僅是具體舉例說明本發明而本發明范圍并不受這些實施例的限制。實施例
材料與方法
植物材料、生長條件、以及對開花時間的測定
除非特別指明，本研究所用的所有突變都是基于哥倫比亞(Col)本底(Columbia background ) 。 sv/ -3/ (SALK—0265 51)和sv/ 扁32 (SALK—07293 0 )都是6T戶的T-DNA插入株，是從擬南芥生物資源中心(ABRC)所獲取的(Alonso, J.M. et al., 2003. M腳301: 653-657)。為確認這些等位基因的T-DNA插入位點，我們對以左邊界引物和基因特異性引物擴增的PCR產物進行了測序。之前已經公開了從H. Sommer獲得的過度表達SW3的植物
(Masiero, S. et al.， 2004. Dev 膨"f 131: 5981-5990)。在23。C或16。C下，并提供120 )imol m'2s"光強度的長日照(LD)條件[16/8 h (光/暗)]下，植物在土壤或MS培養基中生長。通過PCR的基因分型來確認雙突變體的純合性。植物的開花時間以至少12株植物的初生葉總數表示。
表達分析
控制開花時間的基因的表達水平可通過由半定量反轉錄酶介導的PCR或實時PCR來確定。采用Trizol試劑(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)提取總RNA，并使用1嗎合成互補DNA。引物序列和擴增條件都是符合要求可用的。采用ABI PRISM 7900HT序列檢測系統(Applied Biosystems， Foster City,Calif.)進行實時PCR分析，以微管蛋白的表達水平作為標準。對于組織化學的GUS分析，我們構建了 SFP::Gt^翻譯融合體。使用JH2929(5,-GTGGTCGACACTTTTTATTTTACTCTGG-3， ) ( SEQ ID NO: 3)和JH2985 (5，-GGATCCGCACCACCATACGGTAAGCTGC-3， )( SEQ ID NO: 4 )擴增出4.9-kb的SKP基因組區域，然后將其與GUS報告基因融合在一起。從K. Goto獲得Fr':Gt^植物。cDNA-GFP嵌合結構作為報告基因以檢測SVP的定位模式。為了制備35S啟動子驅動的^ST尸cDNA-GFP結構，將GFP序列與嵌合質粒的C末端在結構內融合。采用粒子轟擊系統(PDS-1000/He; Bio-Rad， Hercules, Calif.)，將包被DNA的鉤粒遞送至洋蔥表皮細胞中。在23。C或16。C下溫育24小時后，在熒光顯微鏡(CarlZeiss)下觀察亞細胞的定位模式(localization pattern)。染色質免疫沉淀(ChIP)分析
按(Tang, W.和Perry, S.E. 2003. /說'o/. C7^附.278: 28154-28159)的描述并經稍微修正進行ChIP試驗。以融合于HA標簽的SF尸cDNA或融合于HA標簽的/^CcDNA轉染擬南芥原生質體，然后在室溫下溫育24小時。使用原生質體提取物通過蛋白質印跡來測定SVP-HA和FLC-HA蛋白的表達。甲醛固定后，通過超聲波處理剪切，并分離原生質體的染色質。使用鼠抗-HA抗體(Santa Cruz Biotech, Santa Cruz， Calif.)或抗-Myc 9B11抗體(Cell SignalingTechnology, Beverly, Mass.)對基因組片段進行免疫沉淀。跨越啟動子內六個CArG基序(vCArG)和Fr第一內含子中的CArG基序的五個序列片段，從免疫沉淀的基因組DNA中被擴增出來。使用針對HA或Myc的抗體，從免疫沉淀中純化的DNA在35個循環后的PCR產物是可見的。將由以非選擇性的輸入DNA和Myc抗體所選擇的DNA分別作為陽性和陰性對照的PCR模板。通過SVP-HA和FLC-HA蛋白在光成像板(Fujifilm BAS 2500; Fuji,Tokyo, Japan)上進行CArG基序豐度的定量分析。
熒光素酶報告基因分析
為制備F7:.丄f/C結構，我們使用JH3096(5，-TGAACACTAACATGATTGAATGACA-3 ，) (SEQIDNO:5)和JH2865 (5，-GATCTTGAACAAACAGGTGGT-3，) (SEQIDNO:6)擴增了 1.8-kb的Fr啟動子片段，并將其與熒光素酶融合。這個在Fr啟動子內含有突變的vCArG基序的熒光酶報告基因結構被用作報告基因，以檢查vCArG基序對SVP與Fr啟動子特異性結合的影響。利用QuickChangeIIXL定點突變試劑盒(Stratagene, La Jolla, Calif.)按照供應商的說明，通過定點突變制備得到含有突變vCArG基序的F7 .丄C/C 結構。通過測序，確定了突變已被引入到這些結構的vCArG基序中。具有 或不具有MADS結構域的SVP (分別是35S::SVP-HA和35S::SVP AM-HA) 作為效應基因。報告基因和效應基因被共轉染至原生質體中。以15S::GOS 結構作為內標。以GUS活性來標準化熒光素的活性。
結果
作為確定植物中感知和轉導環境溫度信號的機制的第一步，我們測試了 已知的控制開花時間的基因的突變體對生長環境溫度變化的敏感度。在受試 的開花時間的突變體中，^p有損傷確實對這種變化不敏感。在16'C下，大 部分開花時間的突變體的開花被明顯延遲，其開花時間的比值((16°C/23°C) 在1.1-2.0范圍內(圖1的A)，除W-7之外。但是，s甲-37禾口sv/ -32突變體， 5T尸的T-DNA等位基因，在23'C和16'C下的開花時間幾乎相同(圖1的A)。 ^p突變體早開花，尤其是在16。C下，表明了SPT活性的降低顯著減弱了植 物對低溫的反應，且5T尸活性的缺乏會導致低溫效應的損失。反之，SF尸過 度表達植物晚開花，尤其是在23'C下，表明了 5T戶過度表達可模擬低溫效 應。降低的Fr表達可能是造成W&:Sri3植物晚開花表現型的原因。"5V:5T戶 植物的溫度反應較弱可由不同的Fr表達所解釋，如植物在23°C 的Fr表達高于16t:的表達。由于AGL24 (最接近的SVP同源體)功能的 缺失不會誘導溫度的非敏性，5T尸可能在環境溫度感知中起非冗余作用(non redundant role) (Yu， H. et al., 2002.尸rac. A^/.爿cad 99: 16336-16341 )。
通過實時PCR分析野生型植物在不同溫度下的SF戶表達模式的特征化， 表明了在16r下葉片中的SF尸的表達被輕微地增強(圖1的B)。相反，16 °。時葉片中的Fr的表達被強烈地抑制。組織化學卩-葡糖醛酸糖苷酶(GUS) 分析檢測了整個擴大葉片中的^T和Fr的表達，但SPT的表達上升，而 FT的表達下降(圖1的C)。因為SK尸的上調控對解釋/T表達的急劇下降可能是不重要的，低溫下SFP的轉錄后調節或改變SVP的蛋白與蛋白的禾目
互作用也可能是造成Fr轉錄降低的原因。考慮到將作為開花阻遏物， 這些數據表明了低溫下葉片中存在其他的開花抑制因素。亞細胞定位分析顯
示了在16"C和23'C下SVP-綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白位于細胞核中(圖 1的D)。綜合而言，這些結果表明了 S^T表達是弱溫度依賴型的，類似于 其他種類的溫敏基因。
通過需要擬南芥的FC4和的遺傳途徑(溫敏途徑)感知了環境溫 度。對svp突變體與/c"和>e突變體的遺傳相互作用進行分析，以確定5TT 是否以與FC4和F^;相同的遺傳途徑來運作。長日照條件下，在/ca-9和 突變體中觀察到的晚開花表現型主要被功能的缺失所掩蔽(圖 2A)，證明了 svp對/ca和>e突變體具有上位效應(epistatic)。
此外，甚至在缺乏功能的情況下下還能夠持續由/ca和>e突變體 所誘導的溫度不敏感性，這表明在溫敏途徑的FC4和^T五下游發揮作 用，且5T尸調控溫度的信號傳導。與此一致，在/^和/^突變體中SF尸的 表達被提高(圖2的B)，而在其他自主途徑突變體中則不是這樣，y/A:和》a 突變體是溫度敏感的(圖1的A)。然而，^T表達既不由春化所調節也不 由長日照途徑的關鍵調節因子CCWS7^VS (CO)所調節。觀察到w;^2突變 體和野生型植物的響應與赤霉素(GA)處理或不同光照條件的響應類似，這支 持了 SFP主要在溫敏途徑內起作用的假設。
檢測了svp突變體與y/c突變體的遺傳相互作用，以試圖確定SF尸是否 與F丄C相互作用，因為F丄C是在自主途徑中介導春化效應的重要調節因子， 且F丄C和S^T都在FC4和FF五的下游起作用(圖2的A，圖2的B)。結 果表示，在溫敏途徑中，在轉錄水平上SK戶不依賴于FZT而起作用存在 i^/或凡C功能性等位基因時，^T的表達無變化(圖2的C)且F丄C的 表達仍然不受SPT活性增強或降低的影響(圖2的D)。基于這些結果，我 們構想5TT很可能是迄今未鑒定到的調控FC4和FK￡的溫度依賴作用的阻遏物。表現為至少一定程度上在F￡C下游起作用，以通過調整開花時 間來應對環境溫度。
通過^p-w的突變加速了々/y/c、 /^/y c、以及F^/尸zc突變體的開花
(圖2的E)。相反地，由戶/y7c和i^/y c突變體展示的溫度響應性在缺乏 SKP功能時消失了，從而表明了Sr尸主要在溫敏途徑中發揮作用。有趣的是， 在開花時，F/ /^XC植物在23。C和16。C下具有相似的葉片數(葉片64比67)， 這種現象還發現在/cfl和戶e突變體中，該/c"和突變體中甚至在缺乏功 能性時fXC的水平也被提高。i^/FZC植物的這種開花時間表現型的可 能解釋是在FW凡C突變體中F丄C的開花抑制活性被大幅提高，因此可進
一步掩蔽i6t:下的開花抑制作用。與假設一致，在與/c單突變體所表現的
水平相似的/i^/7c和/c^/7c雙突變體中，溫度響應得到了恢復。尤其讓人關 注的是，通過sv,32突變大幅度地抑制了i^/Fi:C植物的超晚期開花(severe late flowering),這表明了F丄C需要SPT以抑制開花。考慮到已知的在蛋白 復合物中MADS-Box蛋白在物理上的相互作用，這種通過^p-W突變的抑 制的可能解釋模式是溫度信號傳導期間復合物中SVP和FLC蛋白可能相互 作用。近來有關在體內FLC是多聚體蛋白復合物的成分以及SVP與某些 MADS-Box蛋白具有相互作用的發現支持了這種想法。
SrP作為開花阻遏物(floral repressor)的作用的結論引發了一個重要的 問題哪個開花時間基因(flowering time gene)使5T尸在環境溫度信號轉導 中發揮其負面影響？對^p突變體中己知開花時間基因的表達水平的分析顯 示，在23'C和16t:時sv/ -32突變體中花綜合基因(floral integrator) Fr的 表達水平基本上都提高了 (圖3的A)。在一系列確定的生長階段，w，32 突變體中觀察到類似的Fr上調。這些現象表明了溫敏信號途徑至少在一定 程度上通過Fr而起作用。
為確定受sr戶影響的Fr表達的反向調節而進行的報告基因試驗顯示，
在wP-32突變體的葉片和脈管根組織中pF7:，:(7t^的表達明顯異常(圖3的B)。這表明了野生型植物葉片的基本組織中^T的穩定抑制需要5TP。考慮 至U Fr是主要的CO輸出(Schmid， M. et al.， 2003. Z)eve/o; weW 130: 6001-6012)而Fr的mRNA是引發開花的長距離信號傳導機制的重要組成， 在突變體中觀察到的早開花表現型可作如下解釋5T尸活性的缺乏誘 導了FrmRNA在可運輸至苗端的葉片中的積累，從而引發了花的發育。與 W尸下游的Fr作用一致，Fr功能的缺乏部分抑制了^p-32突變體的早開花， Fr的組成型表達掩蔽了 ^p-32突變體中的表現型(圖3的C)，而在MS.v5T尸 植物中7^的表達明顯降低。重要的是，^; -^/^ 0雙突變體表現出如同^-/0 突變體的弱溫度響應(開花時間的比值=1.6對1.5，分別地)，盡管wp-W 單突變體表現出溫度不敏感性。在/ca和>ey/c突變體中觀察到類似的溫 度敏感性突變體的表現型掩蔽。關于s甲-W々-M突變體為什么比單
突變體更具響應性的一種可能的解釋模式是由于增強的Fr活性^/>32突變 體表現為溫度不敏感性表現型，其開花促進效應在16C更明顯。當雙突變體 缺乏Fr功能時，在16'c不發生Fr的開花促進效應，因此，溫度敏感性可
恢復至類似于在々-70單突變體中觀察到的水平。雖然svp-^々-70突變體為
較弱的溫度敏感性的現象表明了 5T尸的環境溫度信號傳導機制要求Fr和其
他下游靶點。一個可能的候選靶點是COA^7^VS7過^^^^這漸^^/(SOC/)， 因為突變輔助降低了 突變體的溫度敏感性(>70 ^c7-2雙突變 體開花時間比值=1.2)(圖3的C)，盡管^W-2單突變體對溫度變化有反 應。與Fr和SOC7的這種冗余作用相符，和^"-2單突變體都未完全 抑制^p-32植物的早開花表現型(圖3的C)。而是svp-32突變體的早開花 很大程度上被/ -/(^0^-2雙突變所掩蔽。
SVP是MADS-Box蛋白的成員，其通過它的DNA結合基序發揮轉錄調 節因子的作用。這樣，可能出現通過直接與尸r序列結合實現SVP蛋白對 Fr表達的反向調節。1.8-kb的Fr啟動子區域含有六個CArG基序(vCArG) 變種(圖4的A)和MADS-Box蛋白的共有結合序列以及Fr的第一內含子含有直接結合FLC的CArG基序的發現，支持了這種假設。采用擬南芥原生 質體進行染色質免疫沉淀(ChIP)試驗以評估這個假設。采用HA抗體的染 色質免疫沉淀，我們檢測了來自含有vCArG III/IV、 vCArG V、以及CArG VII 片段的擴增產物(圖4的A)，表明了在體內SVP和FLC與這些基序結合。
通過SVP-HA可更有效地沉淀vCArG III/IV和vCArG V基序。通過 FLC-HA蛋白可高度地富集存在于Fr第一內含子中的CArG VII基序，這與 之前的發現一致。SVP-HA蛋白也可沉淀該基序，但SVP的結合親和力表現 得比FLC的更弱。因此可能是SVP優選與Fr啟動子vCArG基序結合而FLC 優選與Fr第一內含子中的CArG VII結合。對于觀察到vCArG III/IV和V 基序有效結合，我們通過在以SVP-HA蛋白和Fr-啟動子驅動的熒光素酶 (LUC)報告基因轉染的原生質體中進行瞬時表達試驗證實在體內SVP蛋 白與這些基序的直接結合(圖4的B)。
大量SVP蛋白(35S::SVP-HA)導致了 F7Mt/C活性的降低。當所用 的SVP蛋白不具有其MADS結構域(35S::SVPAM-HA)時，這種降低就消 失，由此表明了熒光素酶活性的降低是由SVP通過MADS結構域與尸r啟 動子的結合所誘導的。為檢測SVP-HA抑制含有突變vCArG基序的Fr啟動 子活性的能力的試驗表明了 SVP-HA不能降低含有突變vCArG III
(w3F7:'丄f/c)的F7:丄f/c的表達。這結果表明了對Fr表達的svp-介導反向
調節需要vCArG III。
權利要求
1、一種控制植物的開花時間的SVP蛋白，該SVP蛋白源自擬南芥，該SVP蛋白具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2、 如權利要求1所述的控制植物的開花時間的SVP蛋白，其特征在于， 該SVP蛋白根據環境溫度的變化來控制植物的開花時間。
3、 編碼權利要求1所述的控制植物的開花時間的SVP蛋白的基因。
4、 如權利要求3所述的編碼控制植物的開花時間的SVP蛋白的基因， 其特征在于，該基因具有SEQIDNO: l所示的核苷酸序列。
5、 如權利要求3所述的編碼控制植物的開花時間的SVP蛋白的基因， 其特征在于，所述開花時間是基于開花基因座T的序列與CArG基序的結合， 并通過抑制能夠加速開花的開花基因座T的基因的表達來控制的。
6、 一種重組載體，其中，該重組載體含有如權利要求3所述的編碼控 制植物的開花時間的SVP蛋白的基因。
7、 一種植物，其中，該植物轉化有權利要求6所述的重組載體。
8、 一種控制植物的開花時間的方法，其中，該方法通過使用如權利要 求3所述的編碼控制植物的開花時間的SVP蛋白的基因來控制植物的開花 時間。
9、 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述開花時間通過在植物 中過度表達SVP基因而被延遲。
10、 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述開花時間通過抑制植 物的SVP基因的表達而被加速。
11、 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物選自由以下植物 所組成的組中包括水稻、小麥、大麥、玉米、大豆、馬鈴薯、紅豆、燕麥 和粟在內的食用作物；包括擬南芥、大白菜、蘿卜、辣椒、草莓、番茄、西 瓜、黃瓜、巻心菜、甜瓜、西葫蘆、韭菜、洋蔥和胡蘿卜在內的蔬菜作物； 包括人參、煙草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、野生芝麻、花生和油菜籽在內 的特用作物；包括蘋果、梨、棗、桃、獼猴桃、葡萄、桔子、柿子、李子、 杏和香蕉在內的水果；包括玫瑰、劍蘭、大丁草、康乃馨、菊花、百合和郁 金香在內的花卉；和包括黑麥草、紅三葉草、鴨茅、紫花苜蓿、高酥油草和 多年生黑麥草在內的飼料作物。
12、 一種轉化植物，其中，該轉化植物通過權利要求8-11中的任意一 項所述的方法來控制開花時間。
13、 一種搜尋控制植物的開花時間的蛋白或基因的方法，其中，該方法 通過使用權利要求1中的SVP蛋白或該SVP蛋白的編碼基因進行分析，該 分析選自由DNA芯片法、蛋白芯片法、聚合酶鏈式反應、RNA印跡分析、 DNA印跡分析、酶聯免疫吸附分析和二維凝膠電泳分析所組成的組中。
全文摘要
本發明涉及源自擬南芥的控制植物的開花時間的SVP蛋白、編碼SVP蛋白的基因、含有所述基因的重組載體、被所述重組載體轉化的植物、使用所述基因控制植物的開花時間的方法、以及使用所述SVP蛋白或其編碼基因搜尋控制植物的開花時間的蛋白或基因的方法。
文檔編號C12N15/29GK101663398SQ200880004329
公開日2010年3月3日 申請日期2008年1月24日 優先權日2007年2月6日
發明者劉圣殿, 安芝薰, 崔良燾, 樸秀玹, 李政煥, 李鐘燮, 黃日斗 申請人:首爾大學校產學協力團