專利名稱：一種殺蟲綠僵菌菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種對天牛幼蟲具有高毒力的殺蟲綠僵菌菌株，屬于生物 農藥領域。
背景技術：
真菌是植物害蟲，病菌和害草的主要天敵，在植物病蟲草害防治中起 著重要作用。對真菌類生物農藥的研發國際上已有許多成功的事例。在蟲
生真菌制劑方面，僅綠僵菌和白僵菌制劑國際上已經登記的產品有20多 個，如澳大利亞Biogreen (2003)注冊登記的"Green Guard"，用于防治 草地蝗蟲；美國(2003)公布完成防治蠐螬，薊馬，蜱等的綠僵菌F52顆 粒劑等三種制劑以及孢子母藥(1999)登記注冊；重慶重大生物技術發展 有限公司(2004， 2008)完成殺蝗綠僵菌母藥與油懸浮劑的農藥正式登記 注冊，用于防治東亞飛蝗和草原蝗蟲。
國內對真菌生防制劑的研究始于50年代，其中一些己具有了相當的規
模，如白僵菌防治松毛蟲在我國每年應用面積達幾千萬畝，我國研制的液 固兩相真菌孢子生產技術已經得到國內外同行的認可。國內已形成一批真 菌殺蟲劑研制單位和龍頭企業，掌握了真菌生物制劑研發和規模化生產方 面成熟技術，可以勝任各種類型的真菌農藥的研制與生產，為我國農林害 蟲的綠色防控提供優質產品和應用技術。天牛屬鞘翅目天牛科昆蟲，其生命周期較長，1至3年才能完成1世代; 生活史隱蔽，自然控制作用較弱；寄主范圍很廣，危害多種農作物或林木 花卉，造成重大經濟損失。如我國南方地區的蔗根土天牛，對甘蔗的危害 曰趨嚴重，受害甘蔗一般減產12%—20%，重則達到50%以上，嚴重影響我 國甘蔗生產及制糖業的發展。蔗根土天牛還可危害柑桔木薯，可造成整株 死亡。雙條杉天牛、星天牛、桑天牛等幼蟲則鉆蛀樹干，引起樹勢衰弱， 枝條折斷，危害森林及經濟林木。由于天牛幼蟲蛀食樹干活動隱蔽的特點 或在地下根圍活動的習性，天牛幼蟲的防治難度非常大，至今未找到有效 的防治方法。傳統的化學防治方法是有一定的效果，但其長期大量使用既 嚴重污染環境，危害人體健康，還大量殺傷害蟲天敵，破壞生態環境。因 此天牛防治需要安全有效，不殺傷非目標生物的生物農藥。
發明內容
本發明通過自然感染的僵蟲直接分離和土壤誘集法分離篩選的方法， 獲得了一種抗逆性強的高效殺蟲綠僵菌菌株，利用該菌株生產的殺蟲真菌 制劑，能夠大幅度提高對天牛類害蟲的防治效果。
本發明所述的綠僵菌菌株已在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2007年12月14日，保藏號是 CGMCCN0,2291;具體內容是金龜子綠僵菌大孢變種CQMall7ifeter力^j'咖 ,'卿h'se var.鵬J肌CQMal17， CGMCC NO. 2291。
本發明技術方案是經過采集自然感病天牛僵蟲(或用天牛在寄 根圍土壤誘集感染天牛形成僵蟲)一分離純化菌株一毒力測定獲得高毒力菌株 —鑒定菌株的分類地位一確定菌株的培養條件和培養特性一固體發酵配方 優化一菌株發酵，干孢子粉收集純化獲得。
本發明通過采集自然感染僵蟲和寄主根圍土壤誘集法分離并篩選出一
株對蔗根土天牛幼蟲具有高毒力的金龜子綠僵菌大孢變種(i/e&rh'幻'腿 s/7is，7ise var.鵬》s)菌株CQMal17。室內多批生物活性的測定結果表 明該菌株對鱗翅目的菜青蟲、鞘翅目的蔗根土天牛、雙條杉天牛、桔褐天 牛等天牛幼蟲都有良好的侵染控制作用。該菌株具有生物活性高、生長迅 速、抗雜菌污染、抗逆性強等優良特性。進一步通過優化液固兩相培養基 配方和菌株生長產孢條件，大大提高菌株產孢能力。 一、菌株的鑒定
1.形態鑒定將分離到的CQMall7菌株接種在l/4SDAY平板培養基上， 培養觀察菌落形態特征，產孢特性等。結果顯示在1/4SDA培養基上培養 7d菌落初期白色茸狀，產孢時橄欖綠色，自菌落中心由里向外長出成叢的 綠色分生孢子。分生孢子梗單生或聚集或緊密排列，帚狀分枝或輪生體。 后期培養物菌落呈殼狀。菌株可以在1/4SDA上28 GC生長一周，直徑達 3.5cm; 25 28。C菌落初期白色鶯狀，菌落產孢后暗綠色至深綠色，分生孢 子梗單生或聚集或緊密排列，帚狀分支。由里向外生出中間密集，四周稀 疏的叢狀的暗綠色分生孢子。
菌株形態特征在1/4SDA培養基上，菌絲具分枝分隔，粗1.4-2.lHm。 瓶梗型產孢細胞，大小幅度為2.1-2.9x7.1-7.5 Mm;從瓶梗頂端產生向基成熟的分生孢子鏈；孢子鏈連接點傾斜度小；分生孢子為長橢圓形，單細胞， 兩端鈍圓， 一端較膨大，尺寸在4.3 5.2umX10.9 12.6um。其孢子著生 于分生孢子梗頂端，呈分生孢子鏈排列。分生孢子梗單生或聚集或緊密排 列，帚狀分支，在生長期間，有水珠分散于菌絲間。從以上特征看，菌株 CQMal17應該為金龜子綠僵菌大孢變種Mflm'w;7//ae var.附q/wo 2. CQMall7菌株的ITS序列擴增與序列測定
將CQMal17在1/4 SDAY液體培養基搖瓶培養3天(180rpm， 28°C)，過 濾收集菌絲體，加液氮研磨破碎，以氯化芐法提取菌株CQMall7的總 DNA[lO-ll]。以總DNA為模板，參照Curran擴增綠僵菌ITS1-5. 8S-工TS2 rDNA 區域。所用弓l物為TW81: 5， -gtttccgtagctgaacctgc-3禾口 AB28:5， atatgcUaagUcagcgggt-3，，產生552 bP擴增條帶。PCR反應體 系(25 u L)為:2. 5 u L 10 XTaq酶緩沖液，dNTP各200 u mol. L-1， MgC12 1. 5 畫1丄-1，引物O. 12 ng， Taq酶1.5 U，模板DNA 10 ng lug。擴增反應 在PCR儀上的反應程序95°C 3min， l個循環；94°C 0. 5min， 52°C 0. 5min， 72°C0. 5min， 30個循環；最后72。C5 min。將凝膠電泳產物用凝膠回收試 劑盒純化回收，由上海生工進行雙向脫氧法測序。序列與NCBI數據庫中己 知序列比對，經提取菌絲總DNA擴增，獲得了552 bp的擴增片段，符合預期 長度。回收該片段以雙脫氧測序法測定了CQMall7菌株的ITS序列及 5.8SrRNA基因的序列如下。該序列5'端包含部分18S rRNA基因序列 (1-49)， 3'端包含部分28SrRNA基因序列(520-552)，其余的分別為ITS1 區(50-195) 5. 8S rRNA基因全序列(196-342)以及ITS2區域全序列(343-519)。
TTTTATGCTTTAJCTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGArTCGAGGTCAACnAAA^ AGTTGGGGGTTTTTACGGCAGTGGACCGCGCCGGGCTCCTGTTGCGAGTGTTTTACTA CTGCGCAGAGG AGGGC CACGGCG AG AC CGCC A^C AATTTAAGGGACG GCTGTGCTG GAAAACC AG CCTCG CCGATC CCCAAC ACC AAGTCC AC AGGGG ACTTGAGGGGCGTAA
T丁CGjTGjTTCACTGAArTCTGCAArTCACATTACTOCGCAnTCGCTGCGTTCTTCiff C G ATG CC AG AAC C AJ=iG W AT CC GTTGTT GAAAGTTTT GATT C AnTTTTTTTAAC C ACT CAG AAGATACTTA[TAAAAAATTCAG AAGGTTTGGG丁CCCCGG CGGGCGCG AAGTC CC
TGATCC CTCCG CAGGTTCACTAAj^CGGAAACA
對所測得的ITS序列與GenBank中已知序列比對，結果表明，與該菌株 ITS序列最為接近的為金龜子綠僵菌大孢變種，其ITS序列同源性為95X， 結合CQMall7菌株的形態學特點，將該菌株鑒定為金龜子綠僵菌大孢變種
(#etar/lz.2^z'膽var.鵬j'〃51)。 二、 CQMall7菌株對天牛幼蟲的殺蟲活性
收集在1/4SDA上培養的成熟分生孢子，用色拉油分散，添加4%的與真 菌活力兼容的乳化劑，配置成終濃度為1X108個孢子/mL的油孢子懸浮液， 接種在蔗根土天牛、雙條杉天牛和桔褐天牛大齡幼蟲。按點滴法每頭試蟲 用微量點滴器點滴藥劑10ul，每組接種30頭，接種后在室溫28t:，濕度
30-50%的條件下飼養，各處理設一空白對照，對照實驗由同濃度的色拉 油和乳化劑代替油孢子懸液接種。每天定時觀察，記錄死亡蟲數，經DPS2000 軟件統計分析得到LT50 (致死中時)，LT90 (致死終時)。
從表1中可以看出CQMal17菌株對蔗根土天牛、桑天牛、雙條杉天牛和 桔褐天牛等幼蟲有明顯的防治效果，6-7d為死亡的高峰期，天牛幼蟲感染真菌致死后蟲體變白并出現鈹紋，3d后長出白色菌絲體，6d后蟲體長滿灰
_ 表1 CQMal17菌株對不同天牛幼蟲的毒力 _
;牛種類 "~ LT50 (P=0.05) LT90 (P=0.05)
蔗根土天4 4.25±0.22
雙條杉天牛 4.45±0.11 6.72±0.24
桔褐天牛 5.02±0.15 7,03±0.13
桑天牛 4.32±0.16 6.56士0.20
綠色孢子，成熟后變為黑褐色孢子堆。
三、CQMall7菌株在基礎培養基上的生長和產孢情況
以CQMal17菌株在各個基礎固體培養基上培養2周生長速率和單位面積 上的產孢量為標準，采用打孔器轉接固定大小的菌絲塊在各個固體培養基 上生長的方法，測定了CQMall7菌株在l/4SDA， PSA，察氏瓊脂培養基等
_6一
表2 CQMall7菌株在基礎培養基上的生長速率和產孢量
培養基生長速率(cm/天)產孢量(孢子/mm2)
1/4SDA2.29±0.012(0.95±0.014)*105
PSA2.42±0.011(0.87土0.013"105
察氏瓊脂培養基2.32±0.005(0.34士0.022) *105
基礎培養基上的生長和產孢情況。
由表2可知，察氏瓊脂培養基上CQMall7菌株能夠正常生長，但是在 2周后其白色菌絲仍占其生長總量的1/2左右，較PSA和1/4SDA上產孢量 少。而后兩者相比，選用產孢量最高的1/4SDA為CQMal17菌株的菌種培養 基。四、 CQMall7菌株培養特性
同樣以CQMall7菌株在變化固體培養基上培養2周時的生長速率和單位 面積上的產孢量為標準，以1/4SDA為基礎固體培養基，通過變換其培養時 的溫度(15°C， 22°C， 25°C， 28°C， 3CTC， 37°C),培養基的pH (4.0， 5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0， 10.0)，得出CQMal17菌株在25。C和pH6. 0條件下 生長和產孢最佳。測定CQMall7菌株的最佳培養條件。在此基礎上，分別 變換碳源(同量的D-山梨醇，葡萄糖，乳糖，麥芽糖，淀粉代替蔗糖)， 氮源(同量的硝酸銨，尿素，L-精氨酸，L-甘氨酸代替蛋白胨)和添加0. 1% (質 量/體積)的微量元素(K+、 Fe3+、 Cu2+、 Zn2+、 Mn2+、 Mg2+或Ca"的單因素水 平，測定CQMall7培養最適合的單因子營養條件；并進行3因素3水平的 正交實驗，得出以可溶性淀粉10g，蛋白胨2.5g，酵母膏5g， 1g的K+，瓊 脂粉18g，溶入1L蒸餾水中，調節pH至6.0的固體培養基為最佳固體培 養基，可以使CQMa117菌株在生長速率基本不變的情況下，單位面積的產 孢量提高40%左右。
五、 CQMall7菌株固體發酵物料的優化
液體培養CQMa117菌絲體作為發酵種子，接種到不同的物料培養基中， 各個物料配方為..麥麩+米粉，麥麩+面粉，麥麩+玉米粉的混合物(每個混
合物的比例分別為99: 1; 97: 3; 95: 5的質量比)，并進行添加各種液體
培養基(1/2SDA， 1/4SDA， 1/8SDA液體培養基，同量的無菌水)，以及分 別加入K+， Ca2+， Fe3+的無機鹽溶液(濃度分別為0.1%， 0.5%， 0.01%)， 并對篩選出的各個較好培養條件進行正交實驗，以產孢量為檢驗標準，最后確定CQMal17的固體物料發酵的優化條件是97%的麥麩+3%的面粉為基 礎物料配方，添加0. 05-0. 1%的IT或Fe+3無機鹽的減量SDA為營養液。 實驗數據一、CQMal17菌株的殺蟲譜
將在1/4SDA平板上28。C條件下培養10天的綠僵菌CQMal17孢子收集 后，放入干燥器中干燥至含水量5%，用色拉油分散CQMall7孢子，使其終 濃度為lX107spOreS/ml，分別接種大小基本一致的菜青蟲、甘蔗土天牛、 桑天牛、玉米螟幼蟲，用細毛刷蘸取一定量的油劑孢子接種于蟲體胸部， 每種蟲接種30頭，
接種后放入20cmX20cmX10cm的飼養磁盤中添加其天然飼料正常詞 養，調節室溫至3(TC、濕度40 50%，光暗周期16h/8h。各種蟲設一用食 用油代替綠僵菌孢子接種的空白對照。每天定時觀察，更換各蟲新鮮飼料， 記錄死亡蟲數，經DPS2000軟件統計分析得到LT50、 LT90。
表3 CQMal02對不同昆蟲的毒力
蟲名LT50 (P=0.05)LT90 (P=0. 05)
菜青蟲3, 66±0. 124. 88±0. 19
蔗根土天牛4. 25±0. 225. 87±0, 27
桑天牛3. 32±0. 154. 23±0. 13
玉米螟3. 45±0. 114. 72 ±0. 24
從表3可以看出CQMall7對菜青蟲、甘蔗土天牛、桑天牛、玉米螟等 幾種農業害蟲都具有侵染活性，具有明顯的防治效果。
實驗數據二、 CQMall7菌株固體發酵產孢率
將大米在含有1-10% NaN03、 0.01-0. 1% F"、 2_10%微量元素溶液、1-10% 酵母粉的液體中浸泡2h后裝入兩頭透氣的聚丙烯袋中(大米第二次利用 時，按大米營養液為2: 1的比例加入l-10%NaN03、 0.01-0. l%Fe3+、 2-10%微量元素溶液、1_10%酵母粉的營養液，拌勻后裝袋)，121°C、0. IO—O. 15MPa 濕熱滅菌30min，自然冷卻后按10-15: 1比例接入在2/4 SDA液體基中培 養3天的綠僵菌CQMal17菌液并拌勻，置于27士rC的發酵室中發酵10-12 天后出袋干燥(30°C-34°C)至濕度《5%。干燥后隨機抽取IO袋培養料， 每袋混勻后各取5g左右的樣品，放入裝有20mL 0. 05°/QTween-80的50ml三 角瓶中，充分混勻后用血球計數板測定濃度。按iooxios個/g與大米第一 次用后損失15%換算出固體發酵產孢率。設用清水處理(不加營養液)的 大米為對照。表4 CQMall7菌株固體發酵產孢率大米第-一次利用產孢率(％)大米第二次利用產孢率(％)大米總產孢率(％)處理2. 09 ±0. 461. 42±0. 333.45 ±0.76對照0. 46* ±0. 05o氺氺0.鄰±0. 05*:菌絲生長旺盛不能進入微循環產孢；**:大米未進行第二次利用從上表4可以看出大米第一次利用時，CQMall7在經過處理的大米 上發酵能進入微循環產孢，產孢率為2.09%左右，而在未處理的大米上菌 絲生長旺盛不能進入微循環產孢，產孢率僅為0. 46%，比對照提高4.5倍;大米經第二次利用總產孢率達到3%以上，比不加營養液的產孢量提 高了 7. 5倍，比大米利用一次的產孢率提高了 60%左右。
具體實施方式
實施例1:田間采集自然感病天牛僵蟲一直接分離純化菌株一接種天牛幼蟲測定殺蟲毒力一獲得高毒力菌株CQMal17—菌株形態、孢子形態、 鑒定一提取菌株DNA，以真菌ITS序列通用引物擴增菌株DNA，將獲得的擴增序列測序并在GENEBANK中比對一確定菌株CQMA117為金龜子綠僵菌大孢 變種。設置不同溫度，培養基pH，在不同條件下培養菌株CQMA117確定最佳 培養條件25"C和p朋.0，加入可溶性淀粉10g，蛋白胨2.5g，酵母膏5g， lg的K+，瓊脂粉18g，溶入1L蒸餾水中，調節pH至6.0的固體培養基為 最佳固體培養基。以麥麩為主要培養物料，按97%的麥麩+3%的面粉為基礎 物料配方，添加0. 05-0. 1°/。的IT或Fe+3無機鹽的1/4SDA為營養液對菌株進 行固體發酵，其一次產孢量可達3%以上。
權利要求
1.一種殺蟲綠僵菌菌株，其特征是該菌株是金龜子綠僵菌大孢變種(Metarizium anisopliae var.major)CQMa117株，其保藏號為CGMCC NO.2291。
全文摘要
本發明是一種殺蟲綠僵菌菌株，屬于綠僵菌屬，種名為金龜子綠僵菌大孢變種Metarhizium anisopliae CQMa117，保藏號CGMCC NO.2291。在優化的液固兩相培養條件下與同類菌株相比具有抗污染力強、生長勢旺、殺蟲毒力高、對土天牛、蠐螬等地下害蟲具有侵染力、對非靶標生物無害等優良特性。
文檔編號C12N1/14GK101654658SQ200910103950
公開日2010年2月24日 申請日期2009年5月26日 優先權日2009年5月26日
發明者彭國雄, 殷幼平, 王中康, 寧 謝 申請人:重慶大學