專利名稱：：可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法
技術領域：
：本發明涉及寡核苷酸探針制備領域，尤其涉及一種可用于多重連接擴增4支術的長探針的制備方法。
背景技術：
：2002年，荷蘭科學家發明了一種名為多重連接擴增技術(multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)的高通量的基因檢測方法，該技術利用核酸雜交、連接反應和PCR擴增反應，可以在同一反應管內對多達45種不同的核苷酸序列進行檢測和定量分析。該技術僅需20ng/jilDNA,即可通過簡單的雜合、連接、PCR擴增及電泳步驟，在同一反應管中對多個不同的耙基因進行檢測和定量分析。MLPA技術原理示意圖見圖1，該技術主要包括探針與耙序列的雜交、探針的特異化連接、連接探針的擴增和結果的檢測分析。針對每一個待測耙基因序列，均有一對MLPA探針，其由一個短的寡核苷酸片段(短探針)和一個長的寡核苷酸片段(長探針)組成。該技術的特色之一是僅擴增連接完好的探針，而不是擴增樣本扭序列。該技術的擴增環節僅需2條引物，一是引物GPl,另一是引物GP2。在所有短探針的5，端均有一段共同序列，該序列與引物GP1的核酸序列相同；在所有長探針的3，端均有一IS:共同序列，該序列與引物GP2的核酸序列互補。可見，所有連"^采針的PCR擴增用的是同一對引物。若兩探針連接，則擴增可進行；而若兩探針未連接，則擴增無法進行。各長探針在共同序列和與耙序列互補的序列間有不同長度的填充片段，該片段長度不同使連接后的MLPA探針長度不同，故其擴增片段長度亦不同。一般相臨兩產物的長度相差6~8bp，因此可同時檢測基因組的多種不同把基因。擴增后進行結果檢測分析比對，得出結論。至今MLPA技術已應用于多種領域的研究及基因診斷，如單核苷酸多態性(SNP)和基因突變檢測、染色體數目異常、遺傳疾病基因缺失重復、基因曱基化檢測、抑癌基因診斷及mRNA分析等。由于MLPA操作簡便、成本低廉、應用領域廣，這幾年來，已超過有上百篇的研究報告發表。在該方法中涉及到長探針和短探針，其中探針的設計是難點，荷蘭科學家創造性地利用了M13單鏈噬菌體的特性，巧妙地在插入衍生的序列兩端設計了限制性內切酶(RE)識別位點，以便采用雙酶切獲得長探針，克服了目前寡核苷酸合成一般難以達到50mer以上的困難。但該方法至少有2大缺陷1)相對于極其龐大的有分子生物學檢測需要的實驗室來說，能夠培養M13噬菌體的實驗室不多，只能求助于收費高昂的商業化生產，成本極高；2)周期長，設計難度大。
發明內容為解決上述問題，本發明的主要目的在于提供一種可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法，該方法設計容易、操作簡單、所需實驗室設備少。為達到上述目的，本發明采用PCR方法結合親和素》茲珠法制備可用于多重連接擴增4支術的長^:針，本發明所述可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法英文名稱為longoligonucleotidepreparationbymagnetic-beads，縮寫為LOPM。所述可用于多重連接擴增技術的長纟果針的制備方法包括以下步驟1)針對目標核苷酸序列和用于制備長探針的與待檢測靶片段無關的模板核苷^列設計一對PCR擴增引物，分別為通用引物和檢測引物；2)在通用引物的5，端標記生物素；3)以所述與待檢測靶片段無關的模板核苷酸序列為模板進行PCR擴增，獲得生物素標記的雙鏈核苷酸序列；4)將所述生物素標記的雙鏈核苷酸序列與親和素標記的親和素磁珠混合，使生物素標記的雙鏈核苷酸序列與親和素磁射目互吸附；5)使生物素標記的雙鏈核苷酸序列變性，解鏈形成單鏈；6)離心，取上清，獲得非生物素標記的單鏈核苷酸序列。所述檢測引物由兩段核苷酸序列組成，一段根據目標核苷酸序列設計，另一段根據與待檢測靶片段無關的模板核苷酸序列設計。步驟4)所述PCR擴增得到的生物素標記的雙鏈核苷酸序列經先經過純化后再與親和素^茲珠混合。所述每1份重量份生物素標記的雙鏈核苷酸序列與10份重量份的親和素磁珠混合。所述生物素標記的雙鏈核苷酸序列加熱變性或者在堿性條件下變性。所述步驟6)的離心條件為4'C，10，OOOrpm，離心30sec。本發明所述MLPA長探針的制備方法與采用M13噬菌體制備MLPA長探針的方法相比，具有以下優點l)PCR擴增引物設計簡單，主要考慮引物的Tm值和長度等一般性引物設計問題，只需要通過結合目標核苷酸序列，針對用于制備長探針的與待檢測靶片段無關的模板核苷酸序列(UT,UnrelatedTemplate)設計一對引物，即可進行PCR擴增，進而獲得MLPA長探針；2)利用簡單的PCR擴增和親和素磁珠結合過程即可獲得MLPA長探針，操作步驟簡單容易，避免了進行噬菌體感染等獲取長探針的耗時長且復雜的操作過程，同時大大降低了進行MLPA技術應用的門檻，使得普通的實驗室也能順利地進行該項實驗；3)本申請所述LOPM法制備長探針無需進行耗時費力且繁瑣的雙酶切過程，操作變得簡單容易；4)采用本申請所述LOPM法制備長探針，對于長探針的設計具有更大的靈活性，長探4十的序列來源廣泛，可以來自于目標核苷酸序列對應的陰性模板、實驗室常見的質粒模板等，甚至包括人工設計合成的基因序列，對于作為長探針所需要考慮的GC含量、長度及序列特異性、Tm值等也能容易地實現；5)采用本LOPM法制備長探針能使所獲得的長探針的填充序列(stuffersequence)保持一致，或者可以采用人工設計序列的方法保證其特異性，可大大降低多重連接擴增產物序列的復雜性，從而能有效的降低基因芯片法檢測時的非特異性雜交，從而提高檢測的特異性和準確性，并保證檢測的重復性。圖1是MLPA技術原理圖2是本發明所述可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法流程圖3是MLPA電泳檢測結果圖。具體實施例方式下面結合圖2和具體實施例進一步詳細it明本發明所述可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法，具體為用多重連接擴增技術檢測質并立pcDNA3.1上新霉素抗性基因(Neomycinresistancegene,NE0)的長探針的制備方法包括以下步驟1)與待檢測靶片段無關的模板核苷^列(UT)選擇，并根據UT和目標核苷^列設計引物；2)人工合成引物，且在通用引物(GP2)的5，端標記生物素；在檢測引物(GSS2+CP)的3'端磷酸化3)PCR擴增；4)PCR產物與親和素磁珠混合；5)PCR產物變性解鏈；6)分離非生物素標記的單鏈核苷酸序列，即得到用于多重連接擴增技術的長探針，所述長探針為GSS2+UT(UT包含了CP和GP2)。實施例l選擇UT模板并設計合成引物選擇質粒pET-49b(購自Novagen)為與待檢測靶片段無關的模板核苷酸序列(UT)，并根據新霉素抗性基因和pET-49b的核苷^f列設計并人工合成通用引物和檢測引物；所述檢測引物命名為CP+GSS2,其核苷^列具體為5'—|cctgcccattcgaccaccaagcgaXX1gctcatacaaatgctcttca--3，其中線框內序列為GSS2,其根據新霉素抗性基因核苷酸序列設計;下劃線部分序列為CP，其根據pET-49b核苷酸序列設計，5'端磷酸化；所述通用引物命名為GP2,其核苷酸序列為5，—taatacgactcactataggg—3'其5'端標記生物素。GP是GeneralPrimer的縮寫；CP是Co,nPrimer的縮寫；GSS是GeneSpecificSequence的縮寫。實施例2PCR擴增以質粒pET-49b為模板，用引物CP+GSS2和GP2進行PCR擴增,1)PCR反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2)PCR反應程序95°C5min;941:30sec，50'C30sec，72°C40sec,35cycles;72'C10min;IOChold。實施例3PCR產物純化及與親和素磁珠混合將實施例2PCR擴增得到的產物進行純化，包括以下步驟1)向PCR產物中加入1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，混勻；2)再加入2.5倍體積的95%的冰乙醇，混勻；3)-20。C，放置2-3小時,14,OOOrpm離心5min,去上清；4)加70%乙醇清洗，14,OOOrpm離心5min，去上清，干燥；5)加適量去離子水溶解。制備親和素》茲珠1)重懸親和素磁珠，根據親和素磁珠結合能力計算所需的親和素磁珠量(每1tigPCR產物即生物素標記的雙鏈核普酸序列與10ug親和素標記的親和素磁珠混合)，將所需的適量親和素》茲珠轉移至一新離心管中；2)親和素》茲珠洗滌以去除防腐劑將含有親和素磁珠的離心管于磁力架上靜置l~2min，去上清；將離心管A^茲力架上移開，沿著親和素》茲珠所收集的離心管內壁加入洗滌液(洗滌液體積等于或大于所取親和素磁珠的原始體積)，充分重懸親和素磁珠洗滌；重復以上步驟，一共洗滌3次。PCR產物與親和素磁珠混合，利用生物素和親和素的吸附作用使磁珠與生物素標記的核苷酸序列吸附在一起1)用2xB&Wbuffer(lOmMTris-HCl(pH7.5),lmMEDTA,2MNaCl)重懸親和素磁珠，使親和素磁珠終濃度為5jlig/n1(2倍的原始體積)；2)加入等體積的溶于H20的生物素標記PCR擴增產物將2xB&Wbuffer中的NaCl濃度從2M稀釋至1M，使其達到最佳結合效果；3)輕微旋轉離心管，室溫孵育15min;4)將離心管至于磁力架上2~3min，分離包3皮生物素標記PCR產物的親和素磁珠；5)用1xB&WBuffer洗滌親和素^^珠2~3次；6)緩沖液重懸親和素磁珠至10iig/pl。實施例4PCR產物變性解鏈，分離非生物素標記的單鏈核苷酸序列將PCR產物，加熱至IO(TC5min，立刻至水上冷卻3min，使雙鏈核苷酸序列變性解鏈；或者加10mol/LNaOH使NaOH最終濃度為0.lmol/L，室溫放置10min，使雙鏈核苷酸序列變性解鏈；將上述變性解鏈的核苷酸序列4'C，10，OOOrpm，離心30sec，吸取上清至一新的離心管中備用，即得到用于多重連接擴增技術的長探針。實驗例將上述實施例得到的用于多重連接擴增技術的長探針用于MLPA1、人工合成短探針，短探針命名為GP1+GSS1,其核苷酸序列為5，—CTAGTTATTGCTCAGCGGTG)TGCATACGCTTGATCCGGCTAl-3，其中下劃線部分序列為GP1;線框內序列為GSS1，GSS1才艮據新霉素抗性基因核苷酸序列設計。2、探針與耙序列雜交、探針的特異化連接1)取5jLi1DM模板即含有NEO基因的質粒pcDNA3.1(購自Invitrogen)于200jal離心管中,95。C變性5min,加熱蓋；2)加入1.5ji1鹽溶液(1.5MKC1,300mMTris-HClpH8.5，lmMEDTA);3)加入1.5ju1探針混合物(1~4fmo1短探針和長探針)；4)95'C加熱lmin，置于60。C孵育16小時；5)將上述混合物用稀釋液(2.6mMMgC12,5mMTris-HClpH8.5，0.013%non-ionicdetergents,0.2mMNAD)稀釋至40jul(含1U連接酶)，541C孵育15min;(如果用T4連接酶進行連接將4)和5)合并為95。C加熱lmin，置于16。C孵育16小時)6)98"C加熱5min使連接酶失活。3、PCR擴增連接產物將10|i1連接產物、30n1PCRbuffer和10n1混合溶液(含10p鵬lPCRprimers,2'5nmo1dNTPs，2.5UTaqpolymerase)于60。C充分混合，于PCR儀上進行擴增反應；PCR引物為GP1:5，—CTAGTTATTGCTCAGCGGTG—3，GP2:5，—TAATACGACTCACTATAGGG—3，。反應程序95。C30sec，60°C30sec，lmin，35cycles。4、結果檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，結果見圖3，以含有NEO基因的質粒pcDNA3.1為才莫板的PCR擴增可得大小為258bp的產物，以水為模板的陰性對照沒有PCR擴增產物，因此證明利用本發明所述方法制備的長探針可用于MLPA。本發明所述方法制備的長探針在用基因芯片法(固相芯片法和液相芯片法)進行結果檢測時，更能顯示出現有方法制備長探針所無可比擬的優勢。眾所周之，芯片法檢測具有高通量、自動化、信息量大等優勢，但是其對探針特異性的要求很高，設計起來耗時且艱難。芯片法待檢測產物的一般長度大于100bp，甚至可達1000bp以上，如果同時檢測幾十甚至更多種產物，則待檢產物與探針之間的非特異性雜交幾乎是不可避免的，這也是導致芯片法存在直至今天也無法克服的準確性差、重復性差的根本原因。而采用本申請所述的LOPM法制備長探針能使所獲得的長探針的填充序列(stuffersequence)保持一致，或者可以采用人工設計序列的方法保證其特異性，這就大大降低了多重連接擴增產物序列的復雜性(complexity),因此，采用本申請所述的LOPM法制備長探針能更好的保證采用芯片法檢測時探針和引物的特異性，并極大的降低檢測體系中序列的復雜性，從而能有效的降低芯片法檢測時的非特異性雜交，從而提高檢測的特異性和準確性，并保證檢測的重復性。L0PM-MLPA擴增結果能用多種檢測方法進行檢測，可以根據檢測目標進行相應的選擇，選擇的范圍廣，瓊脂糖皿電泳、毛細管電泳、固相芯片法、液相芯片法、變性高效液相色i普(DenaturingHigh-PerformanceLiquidChromatography,DHPLC)都能用于LOPM-MLPA擴增結果的檢測。通過檢測平臺的選擇，能夠進一步的提高檢測的特異性、靈敏度。權利要求1、可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法，包括以下步驟1)針對目標核苷酸序列和用于制備長探針的與待檢測靶片段無關的模板核苷酸序列設計一對PCR擴增引物，分別為通用引物和檢測引物；2)在通用引物的5’端標記生物素；3)以所述與待檢測靶片段無關的模板核苷酸序列為模板進行PCR擴增，獲得生物素標記的雙鏈核苷酸序列；4)將所述生物素標記的雙鏈核苷酸序列與親和素磁珠混合；5)使生物素標記的雙鏈核苷酸序列變性，解鏈形成單鏈；6)離心，取上清，獲得非生物素標記的單鏈核苷酸序列。2、根據權利要求1所述的可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法，其特征在于所述檢測引物由兩段核苷酸序列組成，一段根據目標核苷酸序列設計，另一段根據與待檢測靶片段無關的模板核苷酸序列設計。3、根據權利要求1所述的可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法，其特征在于步驟4)所述PCR擴增得到的生物素標記的雙鏈核苷酸序列經先經過純化后再與親和素磁珠混合。4、根據權利要求1所述的可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法，其特征在于所述每1份重量份生物素標記的雙鏈核苷酸序列與IO份重量份的親和素磁珠混合。5、根據權利要求1所述的可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法，其特征在于步驟5)所述生物素標記的雙鏈核苷酸序列加熱變性或者在堿性條件下變性。6、根據權利要求1所述的可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法，其特征在于所述步驟6)的離心條件為4'C,轉速10，000rpm，離心30sec。全文摘要本發明公開了一種可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法，包括以下步驟1)與待檢測靶片段無關的模板核苷酸序列選擇，并根據UT和目標核苷酸序列設計引物；2)人工合成引物；3)PCR擴增；4)PCR產物與親和素磁珠混合；5)PCR產物變性解鏈；6)分離非生物素標記的單鏈核苷酸序列，即得到可用于多重連接擴增技術的長探針。本發明所述MLPA長探針的制備方法利用簡單的PCR擴增和親和素磁珠結合過程即可獲得MLPA長探針，操作步驟簡單容易，避免了進行噬菌體感染等獲取長探針的耗時長且復雜的操作過程，大大降低了進行MLPA技術應用的門檻，使得普通的實驗室也能順利地進行該項實驗。文檔編號C12Q1/68GK101613756SQ20091010897公開日2009年12月30日申請日期2009年7月24日優先權日2009年7月24日發明者汪朝暉申請人:深圳博睿祥暉生物技術有限公司