專利名稱：一種消減黃連自毒物質的微生物菌種篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物篩選方法，更具體的說涉及一種消減黃連自毒物質的微生物菌種 篩選方法。
背景技術：
黃連為我國大宗中藥材品種之一，據記載，黃連的人工栽培歷史已有600余年，黃連連作 障礙形成及加重的原因復雜多樣，各因素相互關聯相互影響，是植物-土壤系統內多種因素綜 合作用的結果，包括土壤的傳染性病害、理化性狀劣變、植物化感物質等引起的自毒作用。 現己認為植物化感自毒是導致植物連作障礙的主要因子之一。
植物化感作用是指一種活體植物(供體，Donor)產生并以揮發(Volatilization)、淋溶 (Leaching)、分泌(Excretion)和分解(Decomposition)等方式向環境釋放次生代謝物而影響 鄰近伴生植物(雜草等受體，Receiver)生長發育的化學生態學現象。受體和供體為同種植物 時產生抑制作用的現象，為植物的化感自毒作用(Allelopathic autotoxicity)，即植物自身 的分泌物，其莖、葉的淋溶物及殘體分解產物所產生的有毒物質累積較多抑制根系生長，降 低根系活性，改變土壤微生物區系的作用，這種作用有助于病原菌的繁殖，藥用植物的連作 障礙更為主要成因可能是自毒物質對植株產生的生理生化效應，自毒物質可能直接影響植株 的光合效率、根系活力、保護酶活性、 激素分泌及與其生長發育相關的信號物質的產生與轉 運以及控制次生代謝途徑相關蛋白和酶的表達，從而影響植物的生長發育和次生物質的積累， 導致產量和品質下降；同時自毒物質對土壤微生物群落具有趨化作用，造成有害病原菌增加 和有益菌減少，導致病蟲害頻繁發生。雖然，生態控制，建立合理的輪作制度，構建復合群 體，可以減緩藥用植物連作障礙的影響。但是目前，還沒有一種消除植物自毒作用的有效方 法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種消減黃連自毒物質的微生物菌種篩選方法，具體步驟如下
1) 樣品采集用無菌土樣袋采集4 5年植齡，長勢健壯黃連的根際土壤；
2) 增菌培養將根際土壤放入20。C 25r培養箱中培養5 7天，無菌水制成1%的懸浮
液；
3) 菌種篩選將懸浮液采用劃線接種PDA培養基平板中，并培養，培養溫度18T: 25 °C，培養時間5 7天；挑取不同形態的微生物菌絲純化培養，將純化的菌落移接于PDA斜面
3培養基中，1 5'C冰箱保存待用；
4)、消減效果評價采用PDA培養基平板培養，實驗組接種純化菌種，對照組不接菌，18
'C 25t:條件下培養7 8天，取樣進行HPLC檢測，選取消減效果最好的菌株，放大培養。
步驟4) HPLC檢測條件為用打孔器取10g菌餅，加入甲醇50ml，超聲提取30min，補足重量，過濾檢測。色譜柱為C化柱，4.6X250mm， 5 u m;流動相為乙腈50鵬ol/L磷酸二氫鉀溶液=50:50,加15腿ol/L十二烷基硫酸鈉，再以磷酸調節pH為4. 0，柱溫30。C，流速O. 6ml/min，檢測波長345 nm。
PDA培養基平板或PDA斜面培養基的配方為水1000ml， 200g馬鈴薯，10 20g葡萄糖，17-20g瓊脂，10 15g黃連根莖粉末。
本發明的有益技術效果是:利用微生物消減黃連的自毒物質為減輕或克服黃連的連作障礙提供了一種新技術，具有成本低，適應性強，有效期長，消減率高等優點。將篩選出的菌株接種于連作地黃連根際，能明顯促進黃連生長，降低病蟲害的發生率；而對于黃連藥材主要成分小檗堿、黃連堿、巴馬汀等的含量無影響。
具體實施例方式
利用微生物消減黃連的自毒物質為減輕或克服黃連的連作障礙提供了一種新技術，本發明提供一種消減黃連自毒物質，并適應黃連生產的微生物篩選菌種的篩選技術，具體體步驟如下
1) 、樣品采集用無菌土樣袋采集4 5年植齡，長勢健壯黃連的根際土壤。
2) 、增菌培養將土樣放入20。C 25。C培養箱中培養5 7天。
3) 、菌種分離篩選采用PDA加黃連粉末培養基平板，每100ml培養基加入l g黃連根莖粉末；稱取lg根際土壤加入99mL無菌水制成P/。的懸浮液。對懸浮液采用劃線培養，培養溫度18'C 25'C，培養時間5 7天。挑取不同形態的微生物菌絲純化培養，將純化的菌落移接于PDA斜面培養基中，4'C冰箱保存待用。
4) 、消減效果評價采用PDA加黃連粉末培養基，每100ml培養基加入l g黃連根莖粉末，實驗組接種純化菌種，對照組不接菌，18匸 25i:條件下培養7 8天。進行HPLC檢測。檢測條件為用打孔器取10g菌餅，加入甲醇50ml，超聲提取30min,補足重量，過濾檢測；色譜柱為C18， 4.6X250mm， 5um;流動相為乙腈50mmol/L磷酸二氫鉀溶液=50:50,力口15mmol/L十二烷基硫酸鈉，再以磷酸調節pH為4. 0;柱溫3(TC，流速0. 6ml/min，檢測波長345 nm。
按上述方法獲得l株對黃連生物堿有明顯消減作用的菌株，在PDA培養基上可分產生大量的黃色分泌物，平板實驗表明其對黃連根莖提取物生物堿的消減率可達50%以上。將該菌株接種于連作地黃連根際，能明顯促進黃連生長，降低病蟲害的發生率，而對于黃連 藥材主要成分小檗堿、黃連堿、巴馬汀等的含量無影響。
權利要求
1、一種消減黃連自毒物質的微生物菌種篩選方法，其特征在于具體步驟如下1)樣品采集用無菌土樣袋采集4～5年植齡，長勢健壯黃連的根際土壤；2)增菌培養將根際土壤放入20℃～25℃培養箱中培養5～7天，無菌水制成1％的懸浮液；3)菌種篩選將懸浮液采用劃線接種PDA培養基平板中，并培養，培養溫度18℃～25℃，培養時間5～7天；挑取不同形態的微生物菌絲純化培養，將純化的菌落移接于PDA斜面培養基中，1～5℃冰箱保存待用；4)、消減效果評價采用PDA培養基平板培養，實驗組接種純化菌種，對照組不接菌，18℃～25℃條件下培養7～8天，取樣進行HPLC檢測，選取消減效果最好的菌株，放大培養。
2、根據權利要求l所述的消減黃連自毒物質的微生物菌種篩選方法，其特征在于步驟4) HPLC檢測條件為用打孔器取10g菌餅，加入甲醇50ml，超聲提取30min，補足重量，過濾檢測。 色譜柱為Cw柱，4.6X250mm， 5 u m;流動相為乙腈50mmol/L磷酸二氫鉀溶液^50:50，加 15咖ol/L十二垸基硫酸鈉，再以磷酸調節pH為4.0，柱溫30。C，流速O. 6ml/min，檢測波長345
3、根據權利要求l所述的消減黃連自毒物質的微生物菌種篩選方法，其特征在于PDA 培養基平板或PDA斜面培養基的配方為水1000ml， 200g馬鈴薯，10 20g葡萄糖，17-20g 瓊脂，10 15g黃連根莖粉末。
全文摘要
本發明公開了一種消減黃連自毒物質的微生物菌種篩選方法，菌種篩選的具體方案包括樣品采集，增菌培養，菌種篩選，消減效果評價。利用微生物消減黃連的自毒物質為減輕或克服黃連的連作障礙提供了一種新技術，具有成本低，適應性強，有效期長，消減率高等優點。將篩選出的菌株接種于連作地黃連根際，能明顯促進黃連生長，降低病蟲害的發生率；而對于黃連藥材主要成分含量無影響。
文檔編號C12Q1/04GK101659981SQ20091019088
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月17日 優先權日2009年9月17日
發明者偉 曾, 瞿顯友, 抒 舒, 銀福軍 申請人:重慶市中藥研究院