專利名稱：一種表達糖苷酶的微生物菌種和其用于生物酶法造紙的技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物酶法造紙技術領域，具體涉及一種表達糖苷酶的微生物菌種及其用于造紙的技術。
背景技術：
由于生物科技的迅猛發展，其他行業受益于其發展成果的優勢也越發明顯，并正在迅速蔓延。造紙行業是眾所周知的主要污染行業，尤其在制漿造紙的過程中會產生大量的化學物污染。根據2008年的統計數據表明:中國的制漿造紙產量達到7980萬噸，成為全球產量第一的紙業大國，國家也花費了大量的資金用于造紙行業的污水、廢氣、固體廢棄物的治理。將現代生物技術用于造紙行業的節能減排、污染治理是今后最有前景的解決方法。傳統造紙是以堿法、亞銨法、亞鈉法和半化學法等分解原料漿中的纖維素為生產工藝，該工藝在制漿技術在制漿蒸煮過程中有大量的黑色制漿廢液產生、排出，是我國江河、湖泊的主要污染源之一，給人們的生活帶來了極大的危害。而我們的酶解法是以可降解的生物酶降解纖維素作為主要生產工藝，以達到綠色環保。
原有的造紙原料主要為木材，小麥等，造成國家自然資源的極大消耗，已經有報道應用農作物如玉米秸桿作為造紙的原料[專利00812212.1由羅伯特.W.赫特；小梅德威克.V.伯德申報專利:采用玉米秸桿和其他非木本纖維材料的制漿工藝]，經查新國外也在近年出現利用香蕉葉進行造紙[PL2005038265020050915、99118241.3和JP2002212888(A)]，但是結果發現很難產業化和應用，因為單一農作物或者單一樹葉無法達到紙張的強度、透氣性和撕裂度等綜合指標的要求。過去，纖維素酶被分為內切型和外切型兩類.內切型被認為是不規則地切斷纖維素分子鏈；而外切型被認為是從分子鏈的非還原末端開始.以纖維二糖為單位將分子鏈依次分解。不過，如檢查一下內切型纖維素酶(EG)和外切型纖維素酶(cBH)將纖維素分解產生的可溶性纖維低糖的分解結構，則上述的分解方式就未必合適。如果只對纖維素分子鏈，就會在纖維素酶分類為內切型和外切型上產生疑問。有文獻[5]還報導了在大麥用CBH處理產生的B — 1，3、1，4 一葡聚糖、以及末葡聚糖水解方式上，也是切斷纖維素分子鏈內部的0-1，4鍵。此外，在纖維低糖的類似基質上.也確認有同樣的情況。因此，如僅檢查纖維素分子鏈的水解方式.剛在所有纖維素酶中，很多都有內切型的性質，在實際意義上，很難說有外切型纖維素酶。金炳鉉使用的試劑級酶(SIGMA)，纖維素酶調查有關的表面的纖維和紙張的物理性能的影響。他的調查為內切-β_1，4葡聚糖酶和外切-β-1，4葡聚糖酶。第一內切-β-1，4葡聚糖酶的表面上的原纖化的纖維出現剝離現象。外切-β -1，4葡聚糖酶的纖維，在結束分解纖維素前形成是細胞核開始耗盡，外切-β-1，4葡聚糖酶與破裂的濃度的增加，拉伸強度變大，表示該信息的度分別為78，34，17。然而，內切-β_1，4葡聚糖酶的出現從0.3到最大的效果，顯示出兩個以上的聚合酶，將在有不利影響時出現互補作用。但是韓國的專利[KR20010028982(A)]顯示盡管他們也使用糖苷酶進行降解紙漿，但還是采用加入糖苷酶試劑的方法，成本較高，而且加入的酶的穩定性不強，保持時間有限，使目前無法真正轉化到產業化中使用。實際上糖苷酶(Glycosidase,EC3.2.1)即糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)，又稱為糖基水解酶，廣泛存在于動物、植物及微生物中。它不僅來源廣泛同時也是酶法合成糖苷類化合物的一類重要工具酶，常見的類型如β_半乳糖苷酶、β_葡萄糖苷酶、α—甘露糖苷酶等。到目前為止，已被報道的大多數糖苷酶屬常溫酶類，由于其熱穩定性較差，對有機溶劑不穩定等缺點而不適合用于酶法合成糖苷類化合物，所以，尋找新型穩定的、耐高溫的酶源逐漸成為人們關注的焦點。嗜熱糖苷酶，因具有良好的熱穩定性，較長的半衰期，水解速度快，可采用熱處理方法，可以純化，操作相對方便，污染危險較小等優點。本發明利用該酶的特點，將該酶通過基因工程方法在微生物中進行表達，以利用微生物在擴增和不斷增長期，不斷生長和分泌表達該酶，從而直接連續降解農作物和樹葉中主要需要降解的纖維素，替代傳統工藝的強堿降解方法，成本低，有長久性應用價值，即環保又降低了紙產品的有害性，真正將生物技術應用到造紙工藝中。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種直接利用分泌嗜熱糖苷酶的工程菌分解造紙漿的方法，包括以下步驟:
I)以農作物秸桿為原料，粉碎，浸泡20-30小時形成原料漿；2)構建并擴增分泌嗜熱糖苷酶的工程菌種子并經一級和二級菌種培養，當第二菌種的OD值為0.4-0.8時，于25°C _37°C下用0.2-0.7mM的IPTG誘導嗜熱糖苷酶的表達；3)將步驟2)所獲得的二級菌種液按體積比1:20_40加入到步驟I)的原料漿中，于室溫下處理漿液過夜；4)撈出漿料、煮沸、清洗、破碎，抄紙并烘烤成型。進一步地，所述分泌嗜熱糖苷酶的工程菌是轉染了表達質粒pET-28b_0602的大腸桿菌，所述表達質粒pET-28b-0602具有如圖2B所示的結構。進一步地，所述農作物秸桿選自配比為1:1_10:1的玉米:小麥秸桿、4:1-9:1的香蕉葉:魚骨樹葉，1:1-5:1的香蕉葉:玉米稻桿、I:1-5:1的香蕉葉:小麥稻桿。本發明的另一個目的是提供了所述分泌嗜熱糖苷酶的工程菌在分解造紙漿中的應用。本發明的又一個目的是提供一種分泌嗜熱糖苷酶的工程菌，所述工程菌是轉染了表達質粒pET-28b-0602的大腸桿菌，所述表達質粒pET-28b_0602具有如圖2B所示的結構。
圖1是以超嗜熱古細菌的基因組為模板擴增嗜熱糖苷酶0602的PCR擴增圖；其中，箭頭指明目的基因的位置。圖2是重組質粒pET-28b_0602的構建過程圖；其中，2A是重組質粒pET-28b-0602的構建過程圖，2B是質粒pET-28b_0602的結構圖。圖3是重組質粒pET-28b_0602PCR鑒定結果圖；其中，泳道1、2、3、4分別為I至4號克隆；M:DL 2K Plus。圖4是鑒定TN0602表達的SDS-PAGE分析圖；其中，泳道1-2是TN0602表達產物的上清液；泳道3是pET_28b表達產物的上清液；泳道4-5是TN0602表達產物的沉淀物；泳道6是pET_28b表達產物的沉淀物；泳道7_8是TN0602全表達產物；泳道9是pET-28b的全表達產物；箭頭指明目的蛋白的位置。圖5是不同誘導溫度下目的蛋白的SDS-PAGE分析結果；其中，泳道1-3分別是誘導溫度為25°C、30°C、37°C下的TN0602表達產物的上清液；泳道4-6分別是誘導溫度為25°C、30°C、37°C下的TN0602表達產物的沉淀物；泳道7_9分別是誘導溫度為25°C、30°C、37°C下的TN0602全表達產物；箭頭指明目的蛋白的位置。圖6是不同濃度IPTG誘導的目的蛋白的SDS-PAGE分析圖；其中，泳道1-5分別是IPTG濃度為0mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM、l.0mM誘導下的TN0602表達產物的上清液；泳道6-9分別是IPTG濃度為0mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM、l.0mM誘導下的TN0602表達產物的沉淀物；泳道10-15分別是是IPTG濃度為0mM、0.2mM、0.4mM、
0.7mM、l.0mM誘導下的TN0602全表達產物；箭頭指明目的蛋白的位置。圖7是目的粗菌液不同熱處理時間的SDS-PAGE分析圖；其中，泳道1、3、5、7、9 分別是熱處理時間為 2min、5min、10min、20min 的 TN0602表達產物的上清液；泳道2、4、6、8、10分別是熱處理時間為2min、5min、10min、20min的TN0602粗菌液沉淀物；箭頭指明目的蛋白的位置。圖8是純化的TN0602的SDS-PAGE分析圖；其中，泳道I是含有目的蛋白的粗溶菌液；泳道2是熱處理的粗溶菌液的上清液；泳道3是穿透液；泳道4、5、6、7、8、9、10是咪唑濃度分別為0、20mM、50mM、75mM、100mM、150mM、200mM的目的蛋白洗脫液；箭頭指明目的蛋白的位置。圖9是最適反應溫度測定圖。圖10是最適PH測定圖；其中，圖1OA是對oNPG最適反應PH的測定結果；圖1OB是對乳糖最適反應PH的測定結果。圖11是TN0602在不同溫度下的熱穩定性分析圖。圖12是TN0602的PH穩定性分析圖。圖13 是 TN0602 的 Lineweaker-Burk 圖。圖14是以玉米桿為原料使用生物酶試劑法制造紙漿的工藝流程圖。圖15是以玉米桿為原料使用微生物發酵產生的生物本酶試劑制造紙漿的工藝流程圖。
具體實施例方式以下通過實施例進一步詳細說明本發明的優點和特點，不應理解為是對本發明的限制，所使用的實驗設備和材料如無特殊說明，均為普通市售。實施例1以農作物和 樹葉作為造紙原料漿的配比篩選
本實施例采用生物堿乙醇鈉，原料為玉米秸桿、小麥秸桿、香蕉樹葉，并進行不同原料的配比實驗。原料漿配比篩選的目的是為后續的酶法造紙進行探索，減少造紙污染。具體配比方案分別如下表I至表4所示。玉米秸桿:小麥的配比從1:1到10:1 ;香蕉葉:魚骨樹葉從4:1到9:1 ;香蕉葉:玉米稻桿從1:1到5:1，香蕉葉:小麥從1:1到5:1o表1:兩種農作物配比進行生物酶法造紙實驗
權利要求
1.一種直接利用分泌嗜熱糖苷酶的工程菌分解造紙漿的方法，包括以下步驟: O以農作物秸桿為原料，粉碎，浸泡20-30小時形成原料漿； 2)構建并擴增分泌嗜熱糖苷酶的工程菌種子并經一級和二級菌種培養，當二級菌種液的OD值為0.4-0.8時，于25°C _37°C下用0.2-0.7mM的IPTG誘導嗜熱糖苷酶的表達； 3)將步驟2)所獲得的二級菌種液按體積比1:20-40加入到步驟I)的原料漿中，于室溫下處理漿液過夜； 4 )撈出漿料、煮沸、清洗、破碎，抄紙并烘烤成型。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述分泌嗜熱糖苷酶的工程菌是轉染了表達質粒pET-28b-0602的大腸桿菌，所述表達質粒pET-28b_0602具有如圖2B所示的結構。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述農作物秸桿選自配比為1:1_10:1的玉米:小麥稻桿、4:1-9:1的香蕉葉:魚骨樹葉，I:1-5:1的香蕉葉:玉米稻桿、I:1-5:1的香蕉葉:小麥稻桿。
4.如權利要2所述的方法，其中所述分泌嗜熱糖苷酶的工程菌在分解造紙漿中的應用。
5.一種分泌嗜熱糖苷酶的工程菌，所述工程菌是轉染了表達質粒pET-28b-0602的大腸桿菌，所述表達質粒p ET-28b-0602具有如圖2B所示的結構。
全文摘要
本發明提供了一種利用分泌嗜熱糖苷酶的工程菌分解造紙漿的方法，包括以下步驟1)以農作物秸稈為原料，粉碎，浸泡20-30小時形成原料漿；2)擴增分泌嗜熱糖苷酶的工程菌種子并經一級和二級菌種培養，當第二菌種的OD值為0.4-0.8時，于25℃-37℃下用0.2-0.7mM的IPTG誘導嗜熱糖苷酶的表達；3)將步驟2)所獲得的二級菌種液按體積比120-40加入到步驟1)的原料漿中，于室溫下處理漿液過夜；4)撈出漿料、煮沸、清洗、破碎，抄紙并烘烤成型。本發明的分泌糖苷酶微生物分解造紙原料漿的效果與常用的酶試劑相當，而且成本大大降低。
文檔編號D21C5/00GK103215836SQ20131008422
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月15日 優先權日2013年3月15日
發明者王妍, 吳澤旋, 陳莫, 喇文軍, 李云, 高仁鈞, 解桂秋, 孔繁思, 程金 申請人:深圳職業技術學院, 深圳市孚沃德生物技術有限公司