專利名稱：一種高產油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構建方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，屬于基因工程菌株構建方法，具體涉及一種高產油酸 的淺白隱球酵母工程菌株的構建方法。
背景技術：
為應對愈演愈烈的石油危機，世界各國都在積極制定和實施新的能源發展戰略， 希望通過各種可能途徑尋找到新的石油替代品，生物柴油便是其中之一。目前，生產生物柴 油的原料主要依賴于油料作物、木本油料人工林、動物脂肪及廢棄油脂等。從油料樹木中提 取油脂，具有占用耕地面積、周期長、成本高等一系列制約因素。發展動物油脂也同樣面臨 一系列制約因素。因此，開辟新的植物源油脂生產途徑，特別是工業化生產途徑對滿足不斷 增長的生物柴油的需求具有重要意義。研究發現，除高等植物和動物能生產油脂外，低等的微生物也能產生油脂，大部分 微生物油脂的脂肪酸組成和一般植物油相似。通常情況下微生物細胞僅含油2 3%，但在 適宜條件下，某些微生物產生并貯存的油脂占其生物總量的20%以上，在已知細菌、酵母、 霉菌和藻類中都發現有產油脂的菌株。酵母是一種繁殖速度很快的生物，利用酵母作為生 物反應器生產脂肪酸，為生物柴油原料生產開辟了一條新的技術途徑。酵母生產油脂時，具 有增殖快，生長周期短，適合工廠化生產，投入較少，收獲穩定，不受季節、氣候等環境條件 影響，且不消耗化學肥料和農藥，因而對環境污染減輕。但目前常見的產油酵母存在產油率 低，油脂成分組成復雜，與生產優質生物柴油的原料要求仍為較大距離。運用分子生物學技術，將植物脂肪酸合成相關基因特別是控制產脂量和脂肪酸品 質的基因導入酵母中，構建優質“基因工程菌株”，使植物脂肪酸合成酶基因在酵母細胞中 的高效表達，增加酵母產油量，提高和控制脂肪酸組成。此種新方式可從根本上解決酵母產 脂菌油質差、產油率低的缺陷，又可充分發揮酵母適合于生物反應器發酵以及林源優質脂 肪酸合成酶的優點。Δ 9硬脂酰-ACP脫飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase，簡稱SAD)是目前研究最 多、最廣泛的Acyl-ACP脫飽和酶。該酶催化的反應是在第9 10碳原子之間形成第一個 雙鍵，是不飽和脂肪酸生物合成途徑的第一步脫飽和，直接調控膜脂與貯脂中飽和與不飽 和脂肪酸的比例，該酶對調節油料作物種子中脂肪酸含量和組分具有非常重要的意義。千 年桐是生產生物柴油的理想樹種之一，將千年桐的SAD基因(VeSAD)構建在酵母表達載體 上并整合到產油酵母中高效表達，使產油酵母的飽和脂肪酸向油酸轉化，從而大大提高油 脂成分中油酸的含量，為酵母產油符合生物柴油的質量要求奠定基礎。
發明內容
本發明要解決上述現有技術的缺點，提供一種高產油酸的淺白隱球酵母工程菌株 的構建方法，提供一種高產油酸的酵母工程菌株，該載體以PCAMBIA2300為基本骨架，含有 千年桐VeSAD基因，可以改變產油酵母脂肪酸成分從而提高油酸含量，從而提高淺白隱球酵母的油脂含量，該菌株的名稱為Cryptococcus albidus VeSAD-I，保存在中國林業科學 研究院亞熱帶林業研究所觀賞植物研究組實驗室。用于本發明工程菌株Cryptococcus albidus pCAM2300_sad中表達千年桐VeSAD 基因的質粒是pCAM2300-sad，構建過程如圖1所示。本發明解決其技術問題采用的技術方案這種高產油酸的淺白隱球酵母工程菌株 的構建方法，在酵母基因組中含有千年桐VeSAD基因表達盒，該表達盒依次含有CaMV35S啟 動子、千年桐VeSAD序列、終止密碼子，其中所述的酵母是淺白隱球酵母；該方法的步驟如 下(1)、含酶切位點千年桐VeSAD基因cDNA編碼區全長序列獲得根據千年桐VeSAD基因(GenBank登錄號為EU072353)核苷酸序列設計引物，以千 年桐未成熟種子總RNA為模板，經RT-PCR擴增，在VeSAD上游引入Sal I酶切位點，下游引 入Kpn I酶切位點，電泳回收VeSAD基因cDNA片段，克隆到pGEM T-Easy載體，轉化大腸桿 菌DH5 α，測序，命名該載體為pGEM-T-sad ；(2)、VeSAD正義表達載體構建結合表達載體pCAMBIA2300的限制性酶切位點——Kpn I、Sma I,BamH I,Xba I、 Sail, Pst I，選用Sal I, Kpn I兩個位置來作為插入目的片段的酶切位點，設計帶Sal I、 Kpn I酶切位點的引物，以克隆載體質粒pGEM-T-Vesad為模板進行PCR反應；將擴增產物 與表達載體PCAM2300 —起均用Sal I和Kpn I雙酶切；分別回收相應的片段，用T4DNA連 接酶進行連接，轉化E. coli DH 5α感受態細胞；提取質粒進行酶切鑒定，表達載體命名為 pCAM2300-sad；(3)重組農桿菌菌株獲得采用凍溶法將重組表達載體pCAM2300-sad農桿菌菌株EHA105、LBA4404、AGL-I ；(4)淺白隱球酵母工程菌株的獲得采用農桿菌介導法，活化含重組表達載體的農桿菌，與淺白隱球酵母菌液共培養， 轉移到含卡那霉素的篩選培養基上，獲得具有卡那霉素抗性的轉化子，經PCR和Southern 分子鑒定，表明千年桐VeSAD基因已經插入淺白隱球酵母的基因組中。經過油脂成分檢測， 該菌株的油酸占總含油量的50. 21%，比對照提高了 14. 4%。本發明有益的效果是本發明將從千年桐種子總RNA中分離的VeSAD基因構建到 酵母表達載體PCAMBIA2300上，并采用農桿菌介導法將VeSAD基因導入淺白隱球酵母，使植 物脂肪酸合成基因在酵母中高效表達，增加了淺白隱球酵母的產油率，特別是提高了油脂 中油酸的含量，更加適合生物柴油的要求，為生物柴油原料生產提供一種高效產油脂的工 程菌株。
圖1 本發明質粒pCAM2300-sad構建過程示意圖；
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明1實驗材料
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1.1植物材料從中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所樹木園采取千年桐發育中的果實，將種 子剝出在液氮中速凍后-80°C冰箱保存備用。1. 2菌株與質粒淺白隱球酵母(Cryptococcus albidus)購自中國科學院微生物研究所菌種保藏 中心，大腸桿菌E. coli DH5a、根癌農桿菌EHA 105、LBA4404、AGL-I為本實驗室保存。質 粒pCAMBIA2300為本實驗室保存，克隆載體pGEM-T Easy購自Promega公司。1. 3主要生化試劑RNA提取試劑盒購自天澤基因工程有限公司(四川綿陽)；cDNA合成試劑盒、 IPTG、X-gal、購自上海生工生物工程技術有限公司；質粒提取試劑盒、DNA膠純化回收試劑 盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司；大腸桿菌E. coli DH5a感受態細胞、T4 連接酶、限制性內切酶購自寶生物工程(大連)有限公司。引物合成及菌液測序分別由上 海生工生物工程技術有限公司和上海聯合基因公司完成，脂肪酸成分測定由亞熱帶林木培 育重點開放性實驗室完成。1. 4培養基配制LB培養基(g.L—1)蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，調pH至7. O。YPD培養基(組分g·!/1):蛋白胨20，酵母膏10，葡萄糖20，自然pH。SM培養基(選擇培養基)(g · L—1)酵母氮基6. 70，葡萄糖20，調pH至6.0。MM(組分 g · L-1) =K2HPO4 2. 2822，KH2PO4 1. 3609，NaCl 0. 146，MgSO4 · 7H20 0. 49294，CaCl2 0. 077693，FeSO4 · 7H20 0. 0025021，(NH4)2SO4 0. 52856，C6H2O6 1. 9817。IM (誘導培養基)在匪液體培養基的基礎上加入40mM MES,調pH到5. 3，然后加入5%的甘油(W/V)，115°C滅菌30min。固體培養基滅菌前加入瓊脂0. 8_1 %。YEPD培養基(種子培養基)(g · L—1):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，自然pH。發酵培養基(g· Γ1)葡萄糖 80，(NH4)2SO4 3. 0，MgSO4 · 7H20 3. 0，ΚΗ2Ρ042· 0， ρΗ5· 5-6. 02實驗方法2. 1千年桐發育中種子總RNA提取(1)液氮研磨破碎細胞，取約IOOmg左右的細粉至新離心管中；(2)加入ImL溶液A振蕩混合30s ； (3)加入0. 3mL溶液B和0. 2mL氯仿，振蕩混勻；(4)室溫離心13000g，5min,取上清(約0. 8mL)移至新離心管中；(5)加入0. 5mL溶液C和0. 2mL氯仿，振蕩混勻；(6)室溫離心13000g，3min，取上清(約950mL)移至新管中；(7)加1/2體積的溶液D，振蕩混勻；(8)室溫離心13000g，5min，形成白色沉淀；(9)加ImL 75%乙醇振蕩混勻，離心13000g, 3min，棄上清；(10)重復步驟9，吹干后溶于30uL DEPC處理的純水中。(11)取2uL在1. 0%的瓊脂糖凝膠中快速電泳檢測總RNA的完整性。于_80°C保
5存待用。溶液A-D是試劑盒中的產品，A 裂解緩沖液，B 第一次分相液，C 第二次分相液， D =RNA沉淀液。2. 2反轉錄運用(上海生工)AMV第一鏈cDNA合成試劑盒，以總RNA為模板，合成cDNA第一 鏈。具體方法如下(1)冰浴中加總 RNA3uL下游特異性引物IuL無RNA酶去離子水3uL總體積7uL(2)混勻離心 3 5s，70°C 5min,冰浴 30s(3)冰浴加入5 X Reaction Buffer 4uLRNA 酶抑制劑(20U/uL) IuLdNTP (IOmM)2uL(4)混勻離心，37°C 5min,加入 luLM-MLV RT (20U/uL)，混勻。(5) 37°C 6Omin ；最后 70°C保溫 IOmin02. 3PCR擴增VeSAD基因含酶切位點cDNA編碼區全長根據在GenBank上登錄的VeSAD基因核苷酸和氨基酸序列設計兼并引物，引物序 列如下Vesad FP :GAT GTC GAC ATG GCA CTC AAG CTVesad RP :GAC GGT ACC TAA CAG CTG CAC TT其中Vesad FP含酶切位點Sal I,Vesad RP含酶切位點Kpn I，以2. 2合成的cDNA 為模板，PCR擴增千年桐VeSAD基因cDNA編碼區。擴增條件為94°C預變性4min，94°C 30S、 58°C 30S、72°C lmin，30個循環，72°C延伸lOmin。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢 測。2. 4擴增產物的克隆和測序2. 4. IPCR產物的回收將VeSAD cDNA用B型小量DNA片斷快速膠回收試劑盒(博大泰克)進行特異性 擴增產物的回收純化，操作步驟如下(1)在1. 0%的瓊脂糖凝膠中電泳，使擴增產物分離形成特異帶；(2)切下目的條帶置離心管中；(3)加700uL溶膠液，55°C溶膠，其間偶爾搖動；裝柱，12000rpm,離心30s ；去掉廢 液；(4)加入500uL漂洗液(wash buffer)漂洗，12000rpm離心30s。重復漂洗一次。 倒掉廢液后再于12000rpm離心2min ；(5)加入45uL的洗脫緩沖液(Elution buffer)或水，室溫放置2min，12000rpm離 心。管底溶液即為回收的目的片斷。
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2. 4. 2回收產物的連接和轉化回收產物連接到pGEM T-Easy載體上，按照Promega公司pGEM_T Easy連接試劑 盒說明書進行操作。轉化按照寶生物E. coli DH 5α感受態轉化方法進行。(1)將回收純化的PCR產物連接到pGEM-T Easy載體上，在離心管中分別加入下列 成分回收產物4uL ；T載體IuL ；2 X T4 Buffer 5uL ；T4DNA連接酶(3U/uL) IuL ；輕輕混勻后 離心收集到管底，16°C過夜連接。(2)從-80°C冰箱中取IOOuL感受態細胞，室溫下解凍后立即置冰上；(3)加入5uL連接產物，混勻，冰浴30min ；(4) 42°C水浴熱擊90s，迅速置于冰上冷卻3 5min ；(5)向管中加入ImL LB液體培養基(不含Amp)，混勻后37°C振蕩培養lh，使菌恢 復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Amp1O ；(6)將上述菌液搖勻后取200uL加入40uL X-gal及4uL IPTG混合均勻，涂布于含 Amp的篩選平板上。37°C倒置過夜培養。(7)白色菌落為重組子。2. 4. 3 質粒 DNA 提取將5mL含Amp (50mg/L)LB液體培養基加入到50mL小三角瓶中，挑取白色單菌落 37 振蕩過夜。質粒提取按照博大泰克公司試劑盒描述的方法進行。(1)取l-3mL在LB培養基中過夜培養的菌液，12000rpm離心30s，棄盡上清。(2)用250uL已加入RNaseA的溶液I均勻懸浮細菌沉淀，室溫放置5min ；(3)加入250uL溶液II，溫和上下翻轉4_6次混勻，使菌體充分裂解；(4)加入350uL溶液III，上下翻轉6-8次混勻，12000rpm離心IOmin ；(5)吸取離心上清并轉移到DNA制備管中，12000rpm離心Imin ；(6)將制備管放回離心管，加入500uL的Buffer Wl，12000rpm離心Imin ；棄濾液；(7)將制備管放回離心管，加入700uL的Buffer W2，12000rpm離心Imin ；棄濾液； 重復洗滌一次。(8)將制備管移入新的離心管中，在膜正中央加40-60UL水，室溫靜置Imin ； 12000rpm離心lmin。將收獲的重組質粒于_20°C保存。2. 4. 4質粒的酶切鑒定根據pGEM T-Easy載體的圖譜，選用EcoR I限制性內切酶對提取的質粒進行鑒 定。將酶切鑒定的陽性克隆對應的菌液，送往上海聯合基因集團公司聯眾基因科技研究院 測序部進行測序。命名該載體為pGEM-T-SKSAD，在添加Amp的液體LB培養基中繁殖含該載 體的大腸桿菌E. coli DH 5α然后提取質粒就能大量生產該載體。2. 5含VeSAD基因的表達載體構建將pGEM-T-SKSAD與表達載體pCAM2300用Sal I和Kpn I雙酶切。分別回收相應 的片段，用T4 DNA連接酶進行連接，轉化E. coli DH 5α感受態細胞。將菌液涂布在含Kan 的LB平板上，37°C倒置培養過夜。堿法提取質粒DNA，雙酶切質粒來驗證目的片段插入是否 正確，結果如圖2。表達載體命名為pCAM2300-sad，全長9933bp，其特征在于所含VeSAD基因 能在植物、真菌中表達，在添加Kan的液體LB培養基中繁殖含該載體的大腸桿菌E. coliDH 5α然后提取質粒就能大量生產該載體。
2.6表達載體轉化農桿菌采用凍融法，將表達載體pCAM2300-sad導入根癌農桿菌EHA105、LBA4404、AGL-I中。(1)取200uL EHA 105感受態細胞，加入IOuL表達載體質粒，冰浴30min ；(2)液氮中速凍5min，迅速置于37°C水浴5min ；(3)冰浴5min后，加入800uL LB液體培養基，180rpm 28°C培養3h后涂布在含有 相應抗生素的LB固體平板上，28°C培養1-2天。(4)挑選單菌落于含有相應抗生素的LB液體培養基中過夜培養，堿法提取農桿菌 質粒DNA。(5)以相應的菌液和質粒DNA為模板，進行PCR鑒定，判斷目的片段是否插入到表 達載體上。PCR反應條件參照2. 3。經電泳檢測表明3個農桿菌均已導入表達載體質粒pCAM2300_sad。2.7農桿菌轉化淺白隱球酵母將含有質粒pCAM2300-sad的根癌農桿菌在LB平板培養基(含50 μ g/mL卡那霉 素，50 μ g/mL利福平)上劃線活化，挑取農桿菌單克隆接種于IOmL液體LB培養基中(含 50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL利福平)，28°C，180r/min振蕩培養18h，離心收集菌體，用IM 培養基重懸(含50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL利福平)，稀釋至0D600至0. 15左右，繼續 培養5-6h至0D600為0. 4-0. 6 ；接種淺白隱球酵母于IOmL YPD培養基中，28°C，180r/min 振蕩培養18h后，按1 5稀釋到YPD新鮮培養基中，培養5-6h。分別離心收集酵母和根癌 農桿菌菌體，用無菌水清洗一次，用IM培養基重懸菌體，農桿菌濃度稀釋至0D600為0. 5左 右(約1010個細胞/mL)，酵母稀釋至0D660為0.7左右(約108個細胞/mL)，各取50 μ L 加入IOmL IM培養基(含AS 200ymol/L)中，25°C，180r/min培養過夜后，取100 μ L培養 液涂布鋪有微孔濾膜的IM(含AS 200ymol/L)平板上，25°C倒置遮光培養2d。2. 8轉化子的篩選將微孔濾膜轉接到SM I培養基(含100 μ g · mL—1卡那霉素，200 μ g · mL—1頭孢呋 辛那)上培養3-5d，將初篩得到的轉化子和野生型淺白隱球酵母同時在SMII培養基平板 (含150μ g · mL—1卡那霉素，300 μ g · mL—1頭孢呋辛那)上劃線，倒置培養3_5d，觀察其生 長情況，能夠正常生長的可以初步認為是陽性轉化子。2. 9轉化子基因組DNA的提取及PCR鑒定采用玻璃珠法提取陽性轉化子基因組DNA，以DNA為模板，以Vesad FP和VesadRP 為引物，進行PCR擴增，反應條件參照2. 3。PCR擴增產物采用0.8% (W/V)的瓊脂糖凝膠電 泳檢測。2. 10 轉化子的 PCR-Southern 鑒定PCR擴增同2. 3，回收純化VeSAD擴增產物，以未轉化的野生菌作為陰性對照，表達 載體質粒pCAM2300-sad作為陽性對照，進行瓊脂糖凝膠電泳。按Roche公司的DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit II 操作步驟探針標記、轉膜、雜交，最后 進行顯影分析。雜交結果表明千年桐VeVeSAD基因已整合到淺白隱球酵母基因組中。2. 11轉基因產油脂酵母的發酵培養挑取保存于斜面的酵母細胞，于PDA斜面培養基上28°C活化培養2d，用接種環挑
8取活化后的酵母細胞分別接入到50ml的液體種子培養基中，于28°C，180r/min振蕩培養 24h。然后將種子液按10%的比例接種到裝有發酵培養基的250ml三角瓶中，三角瓶裝液量 均為為100ml，在28°C，180r/min振蕩培養144h。2. 12油脂提取及脂肪酸成分測定油脂提取利用酸熱法提取油脂，脂肪甲酯化采用氫氧化鉀_甲醇室溫酯化法，油 脂脂肪酸組成及相對含量的氣相色譜分析在Agilent 6890N氣相色譜儀上測定。測定結果表明，轉千年桐VeSAD基因的少根根霉菌株的油酸含量明顯高于未轉化 的野生型菌株，油酸含量為50. 21%，比對照提高了 14. 4%。除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形 成的技術方案，均落在本發明要求的保護范圍。
權利要求
一種高產油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構建方法，其特征是在酵母基因組中含有千年桐VeSAD基因表達盒，該表達盒依次含有CaMV35S啟動子、千年桐VeSAD序列、終止密碼子，其中所述的酵母是淺白隱球酵母；該方法的步驟如下(1)、含酶切位點千年桐VeSAD基因cDNA編碼區全長序列獲得根據千年桐VeSAD基因核苷酸序列設計引物，以千年桐未成熟種子總RNA為模板，經RT PCR擴增，在VeSAD上游引入Sal I酶切位點，下游引入Kpn I酶切位點，電泳回收VeSAD基因cDNA片段，克隆到pGEM T Easy載體，轉化大腸桿菌DH5α，測序，命名該載體為pGEM T sad；(2)、VeSAD正義表達載體構建結合表達載體pCAMBIA2300的限制性酶切位點——Kpn I、Sma I、BamH I、Xba I、SalI、Pst I，選用Sal I、Kpn I兩個位置來作為插入目的片段的酶切位點，設計帶Sal I、Kpn I酶切位點的引物，以克隆載體質粒pGEM T Vesad為模板進行PCR反應；將擴增產物與表達載體pCAM2300一起均用Sal I和Kpn I雙酶切；分別回收相應的片段，用T4DNA連接酶進行連接，轉化E.coli DH 5α感受態細胞；提取質粒進行酶切鑒定，表達載體命名為pCAM2300 sad；(3)重組農桿菌菌株獲得采用凍溶法將重組表達載體pCAM2300 sad農桿菌菌株EHA105、LBA4404、AGL 1；(4)淺白隱球酵母工程菌株的獲得采用農桿菌介導法，活化含重組表達載體的農桿菌，與淺白隱球酵母菌液共培養，轉移到含卡那霉素的篩選培養基上，獲得具有卡那霉素抗性的轉化子，經PCR和Southern分子鑒定，表明千年桐VeSAD基因已經插入淺白隱球酵母的基因組中。
2.根據權利要求1所述的高產油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構建方法，其特征是 PCR擴增VeSAD基因含酶切位點cDNA編碼區全長，根據在GenBank上登錄的VeSAD基因核 苷酸和氨基酸序列設計兼并引物，引物序列如下Vesad FP :GAT GTC GAC ATG GCA CTC AAG CTVesad RP :GAC GGT ACC TAA CAG CTG CAC TT其中Vesad FP含酶切位點Sal I，Vesad RP含酶切位點Kpn I，以cDNA為模板，PCR 擴增千年桐VeSAD基因cDNA編碼區，擴增條件為94°C預變性4min，94°C 30S、58°C 30S、 72°C lmin,30個循環，72°C延伸lOmin ；擴增產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
3.根據權利要求1所述的高產油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構建方法，其特征是 所述的產油酵母表達載體pCAM2300-sad含有千年桐VeSAD基因。
全文摘要
本發明涉及一種高產油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構建方法，提供一種高產油酸的酵母工程菌株，該載體以pCAMBIA2300為基本骨架，含有千年桐VeSAD基因，可以改變產油酵母脂肪酸成分從而提高油酸含量，該方法的步驟如下(1)含酶切位點千年桐VeSAD基因cDNA編碼區全長序列獲得；(2)VeSAD正義表達載體構建；(3)重組農桿菌菌株獲得；(4)淺白隱球酵母工程菌株的獲得。本發明有益的效果是本發明將從千年桐種子總RNA中分離的VeSAD基因構建到酵母表達載體pCAMBIA2300上，并采用農桿菌介導法將VeSAD基因導入淺白隱球酵母，使植物脂肪酸合成基因在酵母中高效表達，增加了淺白隱球酵母的產油率，特別是提高了油脂中油酸的含量。
文檔編號C12N1/19GK101892250SQ20101016201
公開日2010年11月24日 申請日期2010年4月8日 優先權日2010年4月8日
發明者吳開云, 李紀元, 李辛雷, 田敏, 范正琪, 陳東亮 申請人:中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所