專利名稱：用于液體轉移控制的染料組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于液體轉移控制的染料組合物用于組合物比率控制的試劑盒和方 法。更詳細地，采用本發明的方法，可以檢驗包含第一染料的第一組分與包含第二染料的第 二組分的混合比率。
背景技術：
染料已經被用作要求吸量(pipetting)復數種組分的試驗裝置的控制。這些控制 概念基于只存在于一種組分之內的染料并檢測它與其他組分混合后的混合色(secondary colour)0特別是，實時PCR系統要求所有反應組分的精確混合物用于可信的且可比較的定 量，因為實時PCR所要求的樣品材料、引物/探針以及主混合物(master mixes)的量顯著 地影響定量結果。含惰性染料的PCR主混合物被用于最小化吸液誤差，并可獲得商品，諸如Sigma Aldrich 白勺 RedTaq ^ ThermoScientif ic 白勺 AbsoluteBlue (Yanek, M. ，BlOspektrum 13 (5) (2007)519-520)。備選地，可在混合之前標記組分的成分(諸如，例如聚合酶)以獲得吸 液過程的視覺控制。例如Sigma Aldrich的RedTaq包含標記的聚合酶。US 5861251公 開了包含染料的凍干PCR試劑。此外，同樣可提供含有用于可視化的染料的探針材料(W0 2000/014505)。熒光染料諸如R0X和R0X/FAM FRET對被用作校準標準(US 5736333)。目前，沒有本領域已知的對待混合用于某一試驗的超過一種組分提供體積控制的 控制系統。特別是對實時PCR系統而言，控制染料必須為最佳化的，如此，實時PCR的檢測染 料是不受影響的，當然，控制染料的吸附不應與用于監測PCR的檢測通道(channel)重疊， 并且控制染料應在分開的通道中被檢測。如果應使用兩種或更多的控制染料，則這變得更 困難，因為用于PCR監測的譜窗(spectral window)被縮小以避免關于所有控制染料的串 光(cross talk)0本發明提供了用于試驗裝置的封閉系統，其包括檢驗待混合用于所述試驗的至少 兩種組分體積誤差的控制策略。
發明內容
本發明的一個方面是用于組合物比率控制的試劑盒，所述試劑盒包括a)具有第一親和基團的第一染料，所述第一染料可被第一激發光激發而發出輻射 或轉移能量至第二染料，以及b)具有第二親和基團的第二染料，所述第二染料可被第二激發光激發或被來自第 一染料的能量轉移激發，其特征在于，所述第一染料和所述第二染料是如此設置的-所述第一親和基團和所述第二親和基團具有相互結合的親和力，其中所述染料 之間的能量轉移是在所述第一親和基團與所述第二親和基團結合結合后實現的，以及
-所述第一染料和所述第二染料的混合物在被所述第一激發光或所述第二激發光 激發后發出輻射，其中所述輻射是所述第一染料和所述第二染料的組合物比率的量度。本發明通篇使用的術語“能量轉移”用于概述本領域技術人員已知的所有非輻射 能量轉移。所述能量轉移的一個眾所周知的實施方式是熒光共振能量轉移(FRET)。在此， 最初位于其電子激發態的供體生色團，可經過非輻射偶極_偶極耦合轉移能量至受體生色 團(緊密接近的，通常< lOnm)。另一種可能的能量轉移是光誘導電子轉移(PET)。在該過程中，從受激熒光染料的 激發態接受電子，或者供給電子到受激熒光染料的激發態，這導致自由基離子對的形成，接 著，所形成的自由基離子對經由無輻射電荷重組而返回基態。取決于所使用的染料類型，本發明通篇所述第一親和基團和所述第二親和基團的 結合可為可逆的或不可逆的。本發明通篇，由染料混合物在被激發光激發后發出的輻射可為受激染料本身的輻 射或其他染料的輻射，所述其他染料沒有被激發光激發但直接被來自最初受激染料的能量 轉移激發。術語“染料”用于概述所有類型的吸收光分子，因此包括熒光染料、非熒光染料和 猝滅劑分子。猝滅劑分子能夠猝滅熒光染料的熒光，因為它們可被熒光和分散能量例如被熱激 發。非熒光染料(也被稱為暗供體分子(dark donormolecules))為基本上沒有熒光發射 的染料，不同于傳統熒光染料。此外，對熒光發射具有猝滅性質的芳香或雜芳結構也可用于本發明。這些分子結 構能夠經由光誘導電子轉移(PET)過程從熒光染料吸收能量。雜芳結構的實例是例如簡單 分子結構如鳥嘌呤、脫氮鳥嘌呤(參見實施例2)或異鳥苷(iso Guanosin)可被加入到親 和基團中。同樣，吲哚衍生物如蛋白質中的色氨酸或被并入脫氧核苷(desoxyribosid) 衍生物中的硝基吲哚(nitroindol)為眾所周知的具有猝滅性質的化合物。此外， Nitroaromates如2，4_ 二硝基苯基苯胺衍生物可商購獲得作為寡核苷酸(作為亞磷酰胺 (phosphoramidte))標記試劑和蛋白質標記(作為NHS酯)，也能夠猝滅熒光體。因此，本發明的另一方面是用于組合物比率控制的試劑盒，所述試劑盒包括a)具有第一親和基團的熒光染料，所述第一染料可被第一激發光激發而轉移能量 至芳香或雜芳結構，以及b)具有第二親和基團的芳香或雜芳結構，所述芳香或雜芳結構可被來自所述第一 染料的能量轉移激發，如此，所述芳香或雜芳結構阻止所述熒光染料的熒光發射，其特征在于，所述第一染料和所述芳香或雜芳結構是如此設置的-所述第一親和基團和所述第二親和基團具有相互結合的親和力，其中所述染料 和所述芳香或雜芳結構之間的能量轉移是在所述第一親和基團和所述第二親和基團結合 后實現的，以及-所述第一染料和所述芳香或雜芳結構的混合物在被所述第一激發光激發后發出 輻射，其中所述輻射是所述第一染料和所述芳香或雜芳結構的組合物比率的量度。本發明通篇，可將依照本發明的試劑盒的染料加入到需被混合用于隨后反應的組分中，在該情況中，組合物比率控制針對所述組分的組合物。這樣的組分是例如試劑、緩沖 齊U、生物組分或樣品。本發明的再一方面是用于組合物比率控制的試劑盒，其包括a)包含具有第一親和基團的第一染料的第一組分，所述第一染料可被激發光激發 而發出輻射或轉移能量至另一組分，以及
b)包含具有第二親和基團的第二染料的第二組分，所述第二染料可被輻射激發或 來自所述第一染料的能量轉移激發，其特征在于，所述第一組分和所述第二組分將以預定的組合物比率組合，其中所述組合物比率是可經由測量所述染料在被激發光激發后發出的輻射控制 的，以及其中所述第一親和基團和所述第二親和基團被設計為可互相結合，其中所述染料 之間的能量轉移是在所述第一親和基團和所述第二親和基團結合后實現的。依照本發明的這樣的試劑盒概述了所有種類的、含復數種在進行某一生產過程或 分析試驗之前需被混合的組分的試劑盒。當然，這樣的試劑盒具有至少兩種組分，每一種組 分包含某一染料，然而所述組分是例如試劑、緩沖劑或生物化合物。本發明的又一方面是具有取決于光發射的組合物比率的染料組合物，所述染料組 合物包括a)具有第一親和基團的第一染料，所述第一染料可被激發光激發而發出輻射或轉 移能量至另一組分，以及b)具有第二親和基團的第二染料，所述第二染料可被輻射激發或來自所述第一染 料的能量轉移激發，其特征在于，所述第一染料和所述第二染料是如此提供的-所述第一親和基團和所述第二親和基團具有相互結合的親和力，其中所述染料 之間的能量轉移是在所述第一親和基團和所述第二親和基團結合后實現的，以及-染料組合物在被激發光激發后發出的輻射是所述第一染料和所述第二染料的組 合物比率的量度。本發明的再一方面是使用依照本發明的試劑盒檢驗兩種組分組合物比率的方法， 所述方法包括下列步驟a)混合兩種組分，其中第一組分包含具有所述第一親和基團的第一染料，第二組 分包含具有所述第二親和基因的第二染料，b)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第一輻射測量，在該條件下所述第一 染料和所述第二染料未經由所述親和基團結合，c)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第二輻射測量，在該條件下所述第一 染料和所述第二染料經由所述親和基團結合，以及d)比較步驟b)和步驟C)中的兩次輻射測量以檢驗所述兩種組分的組合物比率。上述方法描述了關于混合兩種組分的要點，但本領域的技術人員將理解該方法也 可用于更多組分。例如，可使用包含第三染料的第三組分，所述第三染料需具有與第一染料 和第二染料相比不同的輻射波長。如果需檢驗四種組分的比率，則可使用依照本發明的兩 種試劑盒，如此，第一染料和第二染料具有相互結合的親和力，然而第三染料只具有與第四染料結合的親和力。如果依照本發明方法的該實施方式是順著步驟a)-d)的進展而進行的，則染料需 在混合之后以結合的狀態以及的非結合狀態存在，因此，兩種各個親和基團的結合必然是 可逆的。本發明的又一方面是使用依照本發明的試劑盒檢驗兩種組分的組合物比率的方 法，所述方法包括下列步驟a)混合兩種組分，其中第一組分包含具有所述第一親和基團的第一染料，第二組 分包含具有所述第二親和基團的第二染料，
b)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第一輻射測量，在該條件下所述第一 染料和所述第二染料是結合的，所述第一熒光測量是應用所述第二染料特異性的激發波長 并測量所述第二染料的發射強度而進行的，以及c)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第二輻射測量，在該條件下所述第一 染料和所述第二染料是結合的，所述第二熒光測量是應用所述第一染料特異性的激發波長 并測量所述第二染料的發射強度而進行的，以及d)比較步驟b)和步驟C)中的兩次輻射測量以檢驗所述兩種組分的組合物比率。在依照本發明的該方法中，兩次輻射測量是在染料經由它們的親和基團相互結合 的情況下進行的。當然，在此可能但不必要的是，兩種各個親和基團的結合可為可逆的。如之前所述，芳香或雜芳結構也可用于替代染料，因此，本發明的另一方面是使用 依照本發明的試劑盒檢驗兩種組分組合物比率的方法，所述方法包括下列步驟a)混合兩種組分，其中第一組分包含具有所述第一親和基團的熒光染料，第二組 分包含具有所述第二親和基團的芳香或雜芳結構，b)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第一輻射測量，在該條件下所述熒光 染料和所述芳香或雜芳結構未經由所述親和基團相互結合，所述第一輻射測量是應用所述 熒光染料特異性的激發波長并測量所述熒光染料的發射強度而進行的，c)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第二輻射測量，在該條件下所述熒光 染料和所述芳香或雜芳結構經由所述親和基團相互結合，所述第二輻射測量是應用所述熒 光染料特異性的激發波長并測量所述熒光染料的發射強度而進行的，以及d)比較步驟b)和步驟C)中的兩次輻射測量以檢驗所述兩種組分的組合物比率。發明詳述本發明的一個方面是用于組合物比率控制的試劑盒，所述試劑盒包括a)具有第一親和基團的第一染料，所述第一染料可被第一激發光激發而發出輻射 或轉移能量至第二染料，以及b)具有第二親和基團的第二染料，所述第二染料可被第二激發光激發或來自第一 染料的能量轉移激發，其特征在于，所述第一染料和所述第二染料是如此設置的-所述第一親和基團和所述第二親和基團具有相互結合的親和力，其中所述染料 之間的能量轉移是在所述第一親和基團與所述第二親和基團結合結合后實現的，以及-所述第一染料和所述第二染料的混合物在被所述第一激發光或所述第二激發光 激發發出輻射，其中所述輻射是所述第一染料和所述第二染料的組合物比率的量度。
下面描述了許多優選的親和基團，它們均適用于依照本發明的試劑盒。如圖1所 說明的，含其親和基團的染料均被設計為染料經由親和基團而相互直接結合。當然，本申請 通篇，親和基團的相互結合必須被理解為相互直接的或特異性的結合，因此，親和基團經由 第三分子的間接結合不是本發明的一部分。依照本發明的優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述第一親和基團是生物素基 團，所述第二親和基團是抗生蛋白鏈菌素(sti^ptavidin)基團。依照本發明的另一優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述第一親和基團是地高 辛配基(digoxigenin)基團，所述第二親和基團是抗-地高辛配基抗體。依照本發明的再一優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述第一親和基團是凝集 素(Iectine)，所述第二親和基團是糖。依照本發明的另一優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述第一親和基團是抗 體，所述第二親和基團是半抗原。
依照本發明的又一優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述第一親和基團是第一 寡核苷酸，所述第二親和基團是與所述第一寡核苷酸互補的第二寡核苷酸。優選使用寡核苷酸作為親和基團，因為易于通過調節溶液溫度至高于或低于各個 雜交體(hybrid)的解鏈溫度而在這些分子的結合狀態和非結合狀態之間切換。本發明通篇，術語寡核苷酸被用于包括DNA、RNA以及寡核苷酸類似物，因而，唯一 的要求(prerequest)是這樣的類似物仍然能夠相互形成穩定的雙鏈體(duplex)。這樣的 寡核苷酸類似物可容許(compromise)不同的修飾(modifications)。一類類似物是在核苷堿基(nucleobase)上有取代基的天然核苷酸dA、dG、dC、dT、 dU的衍生物。實例是5-取代的嘧啶，諸如5-甲基-dC、5_氨基烯丙基-dU或-dC、5_(氨乙基_3_丙烯 基亞胺)-dU、5-丙炔基-dU或-dC、5鹵代-dU和dC，N4取代的胞苷，例如N4-乙基_dC，N取代的嘌呤，例如N6-乙基-dA、N2-乙基_dG，8取代的嘌呤，例如8- [ (6-氨基)_己-1-基]-8-氨基_dG或dA，8鹵代_dA或_dG、 8-烷基dG或dA，或2取代的dA，諸如2氨基-dA。一類類似物是在核糖部分有取代基的天然核苷酸dA、dG、dC、dT、dU的衍生物。實 例是2，甲氧基、2，氟代、2，甲基硒基dU，2，烯丙氧基、4，甲基dU、dT、dU、dA、dG。另一類是這樣的類似物，其中其他核苷堿基(非標準的)而不是標準堿基A、G、C、 T、u連接于脫氧核糖部分或連接于標準堿基連接于糖類似物的地方，或兩種的組合，其中其 他核糖堿基而不是標準堿基連接于糖類似物。非標準糖連接于脫氧核糖的實例是5_硝基吲哚_脫氧核糖、3硝基吡咯_脫 氧核糖、7-脫氮-dG 和-dA、-dl、-dX、7-脫氮-8-氮雜-dG 和 dA、_dl、-dX、8-氮 雜-dA、-dG、-dl、-dX、d 間型霉素(Formycin)、假-dU。假-異-dC、4_ 硫-dT、6_ 硫-dG、 2-硫-dT、異-dG、5-甲基-異-dC、5，6- 二氫 ~5~ 氮雜-dC、亞乙烯基-dA、pyrollo-dC。糖類似物選自木糖、2，，4，橋連核糖(bridged Ribose)如2' -0,4' -C亞甲基(稱作LNA的低聚物)或2' -0,4' -C乙烯(稱作ENA的低聚物)、L-2脫氧核糖、己糖醇 (稱作HNA的低聚物)、環己烯(稱作CeNA的低聚物)、阿卓糖醇(稱作ANA的低聚糖)、三 環核糖類似物(C3'和C5'原子通過乙烯橋連接稠和成環丙烷環)(稱作三環DNA的低聚 物)、丙三醇(glycerin)(稱作GNA的低聚物)、吡喃型葡萄糖(稱作同源DNA的低聚物)、 carbaribose (具有環戊烷代替四氫呋喃亞單位)和嗎啉(稱作嗎啉代DNA的低聚物)。這樣的核苷酸類似物可進一步地衍生，例如7-炔丙基-7-脫氮G或5-氨基烯丙 基-己糖醇_U、2’ -氟-d(L)-核糖。另一類類似物是寡核苷酸，其中核苷酸間的磷酸橋被修飾為如硫代磷酸酯 (phosphorthioate)-,甲基膦酸酯-或氨基磷酸酯寡核苷酸。另一類寡核苷酸容許含肽鍵的主鏈，眾所周知的實例為PNA。PNA的主鏈由通過肽 鍵連接的重復N- (2-氨乙基)-甘氨酸單位組成。如果使用依照本發明的取決于染料混合物光發射的比率檢驗用于隨后PCR擴增 的組分比率，則特別優選使用L-核苷酸用作親和基團。這樣的具有L-構型的糖代替D-構 型的天然核苷酸的L-核苷酸，仍然提供了它們的雜交性質，但聚合酶不再識別這些分子。 當然，這樣的L-核苷酸仍可用作親和基團，而不潛在地影響PCR反應。 上述對L-核苷酸而言相同的正交影響可使用GNAs、同源DNA和容許正交堿基對的 寡核苷酸(如異dG和異dC)而達到。依照本發明的一種更優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述寡核苷酸由L-核 苷酸組成。本發明通篇，可使用染料的復數種組合，下面描述了一些不限制本發明范圍的適 宜組合。所述第一染料(I)和所述第二染料(II)的不同組合在圖1中進行了說明，其中圖 Ia包括需要所述染料以非結合狀態(左)以及結合狀態(右)存在的實施方式，其中圖Ib 包括需要所述染料只以結合狀態存在的實施方式。依照本發明的優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述第一染料是熒光染料，所 述第二染料是猝滅劑分子，所述猝滅劑分子在結合親和基團后被來自所述熒光染料的能量 轉移激活，如此，所述猝滅劑分子阻止所述熒光染料的熒光發射。該猝滅實施方式的一種特別情況是所謂的自猝滅裝置，其中所述熒光染料和所 述猝滅劑分子是相同的分子，一個熒光染料被另一個猝滅。這種自猝滅經由染料_染料 相互作用而發生，所述染料-染料相互作用是通過使熒光分子緊密接近例如通過增加染 料濃度超過某一限度而誘導的。大多數的熒光染料提供這種自猝滅性質，特別是若丹明 (Rhodamines) >Bora diazaindacenes (禾爾{乍 Bodipy- )、！胃(Cyanines)、― jfe—g^tl惡 嗪類。因此，依照本發明的另一優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述熒光染料和所 述猝滅劑分子是相同的分子。在本發明的該實施方式中，熒光染料將被具有適宜波長(ExX1)的激發光激發，并 將監測所述熒光染料(Em λ》的熒光發射(圖la/ii)。如果熒光染料和猝滅劑分子未相互 結合，則將監測熒光發射(EmX1),該發射的強度是熒光染料量的量度。如果熒光染料和猝 滅劑分子相互結合，則熒光發射將被猝滅劑分子猝滅。當然，熒光發射(EmX1)將被降低， 強度降低是猝滅劑分子的量的量度。
依照本發明的另一優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述第一染料是第一熒光 染料，所述第二染料是第二熒光染料，所述第二熒光染料在較所述第一熒光染料更長的波 長處有最大激發，其中所述第二熒光染料可在結合親和基團后被來自所述熒光染料的能量 轉移激發，如此，所述第二熒光染料發射熒光的波長不同于所述第一熒光染料的波長。在該實施方式中，使用了兩種具有不同激發波長的熒光染料。在結合的親和基團 的情況中，使用第一熒光染料的特異性激發(Ex λ ρ幾乎不直接激發第二熒光染料)，發生 能量轉移至第二熒光染料，如此，第二熒光染料的特異性熒光發射(EmX11)變得可檢測(圖 la/i)。另一方面，基于ExX1的激發、采用非結合親和基團，沒有特異性于第二熒光染料的 熒光發射(EmX11)變得可檢測，但只有使用Ex λ π作為激發，EmλII才變得可檢測。當然， 該熒光發射將成為第一熒光染料和第二熒光染料比率的量度。依照本發明的另一優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述第一染料是非熒光染 料，所述第二染料是熒光染料，所述熒光染料可在結合親和基團后被來自所述非熒光染料 的能量轉移激發，如此，所述熒光染料發出熒光。該實施方式與之前所述采用兩種熒光染料的實施方式相似，只是被其特異性激發 (ExA1) 激發的非熒光染料其自身基本上不發出特異性的熒光發射。本發明通篇所用的術 語一非熒光染料類似于US2007/0077588中的描述，即非熒光染料是基本上沒有熒光發射 的染料，不同于經由熒光發出其大部分能量的傳統熒光染料。只有在結合的親和基團的情 況中，第二熒光特異性的熒光發射(EmX11)才變得可檢測，如果在使用其特異性的激發波 長(Εχ λ ρ幾乎沒有第二熒光染料的直接激發)特異性激發第一非熒光染料后，發生能量轉 移至第二熒光而發出第二熒光染料特異性的熒光發射伍！！^…圖化八^)。在非結合的親 和基團的情況中，在Ex λ χ激發后，沒有第二熒光染料特異性的熒光發射變得可檢測，但只 有使用Ex λ π作為激發，Em λ π才變得可檢測。當然，該熒光發射將成為非熒光染料和熒光 染料比率的量度。這樣的非熒光染料也可被指定為暗供體分子。如之前所述，依照本發明的試劑盒的染料可被加入到需要被混合用于隨后反應的 組分中，在這種情況中，組合物比率控制是指所述反應組分的組合物。當然，所述反應組分 可能是依照本發明的試劑盒的一部分。依照本發明的一種優選試劑盒進一步包括第一反應組分。為了使用所述試劑盒的染料用于所述反應組分和樣品(不是該試劑盒一部分)的 組合物比率控制，必需向所述樣品中加入一種染料，其他染料需要在所述反應組分的范圍 之內。本發明通篇，含染料的反應組分可以至少兩種不同的方式提供。在依照本發明的一種更優選試劑盒中，所述第一反應組分包括所述第一染料。在依照本發明的另一更優選試劑盒中，所述第一染料可在使用所述第一反應組分 之前加入到所述第一反應組分中。依照本發明的另一優選試劑盒進一步包括第二反應組分，所述第二反應組分任選 地包括所述第二染料。本領域的技術人員將理解，包括染料和反應組分的許多不同試劑盒落于本發明的 范圍之內，下面列出了幾種那些試劑盒作為實例。依照本發明的一種優選試劑盒是PCR試劑盒，其中所述第一反應組分是包括所述 第一染料的主混合物，所述第二反應組分是包括待加入到樣品中的所述第二染料的緩沖溶液，所述樣品包括待擴增的靶。備選地，第一反應組分或第二反應組分可為所述PCR要求的 檢測混合物。依照本發明的另一優選試劑盒是樣品配制試劑盒，其中所述第一反應組分是包括 所述第一染料的裂解/結合緩沖液，所述第二反應組分是包括所述第二染料的磁性小珠溶 液。備選地，第一反應組分或第二反應組分是包括待加入到樣品溶液中的所述第二染料的 緩沖溶液。依照本發明的另一優選試劑盒是免疫試驗試劑盒，其中所述第一反應組分是包括 所述第一染料的特異性抗體，所述第二反應組分是包括所述第二染料的用于檢測的抗體綴 合物。備選地，第一反應組分或第二反應組分是包括待加入到樣品溶液中的所述第二染料 的緩沖溶液。如之前所述，某些分子結構(如芳香或雜芳結構)也可用作本發明的猝滅化合物， 只要它們具有猝滅熒光發射的性質(參見實施例2)。因此，依照本發明的另一實施方式是用于組合物比率控制的試劑盒，所述試劑盒 包括a)具有第一親和基團的熒光染料，所述第一染料可被第一激發光激發而轉移能量 至芳香或 雜芳結構，以及b)具有第二親和基團的芳香或雜芳結構，所述芳香或雜芳結構可被來自第一染料 的能量轉移激發，如此，所述芳香或雜芳結構阻止所述熒光染料的熒光發射，其特征在于，所述第一染料和所述芳香或雜芳結構是如此設置的-所述第一親和基團和所述第二親和基團具有相互結合的親和力，其中所述染料 和所述芳香或雜芳結構之間的能量轉移是在所述第一親和基團和所述第二親和基團結合 后實現的，以及-所述第一染料和所述芳香或雜芳結構的混合物在所述第一激發光激發后而發出 輻射，其中所述輻射是所述第一染料和所述芳香或雜芳結構的組合物比率的量度。依照本發明的一種優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述第一親和基團是第一 寡核苷酸，所述第二親和基團是與所述第一寡核苷酸互補的第二寡核苷酸。依照本發明的另一優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述寡核苷酸由L-核苷 酸組成。依照本發明的再一優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中所述雜芳結構是包括鳥嘌 呤、脫氮鳥嘌呤、異鳥嘌呤或7脫氮異鳥嘌呤的結構。依照本發明的一種更優選試劑盒是這 樣一種試劑盒，其中所述雜芳結構是含鳥嘌呤或7_脫氮鳥嘌呤作為核苷堿基的結構。依照 本發明的一種還更優選試劑盒是這樣一種試劑盒，其中超過一種的核苷酸是與同源低聚寡 核苷酸例如(dG) 3 (在寡核苷酸序列文本中也寫作GGG)或(7-脫氮dG) 3組合的。備選地， 硝基吲哚脫氧核糖核苷(眾所周知的通用堿基)或其同源低聚物可用作猝滅化合物。本發明的再一方面是使用依照本發明的試劑盒檢驗兩種組分的組合物比率的方 法，所述方法包括下列步驟a)混合兩種組分，其中第一組分包含具有所述第一親和基團的第一染料，第二組 分包含具有所述第二親和基團的第二染料，b)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第一輻射測量，在該條件下所述第一染料和所述第二染料未經由所述親和基團結合，c)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第二輻射測量，在該條件下所述第一 染料和所述第二染料經由所述親和基團結合，以及d)比較步驟b)和步驟C)中的兩次輻射測量以檢驗所述兩種組分的組合物比率。為了進行檢驗依照本發明的兩種組分組合物比率方法的該實施方式，有必要測量 兩種染料以結合狀態以及非結合狀態存在的輻射，如果所述方法的步驟是順著上面步驟 a)-d)的進展而進行的，則必要的是兩種親和基團的結合是可逆的。取決于所使用的親和基 團，本領域的技術人員將知道允許或阻止該結合的操作。如之前所述關于本發明試劑盒的實施方式，親和基團均被設計為經由它們的親和 基團的特異性結合而實現染料相互之間的直接結合(參見圖1)。此外，本領域的技術人員 將理解，親和基團相互之間的這種特異性結合對進行本發明的方法而言是必要的，因為否 貝U，染料的某一部分可能結合于組分的其他成分，如此，它們將不可再用于比率控制測量， 這將產生假結果。當然，本發明的親和基團被如此設計以至于沒有組分的其他成分的干擾， 但只有相互之間的特異性結合發生。因此，本領域的技術人員將理解，所述第一染料和所述 第二染料必須經由所述親和基團而相互特異地結合，如果達到正確的條件。在依照本發明 的另一優選方法中，步驟b)中所述第一輻射測量是在組合物參數下進行的，如此阻止了所 述第 一親和基團和所述第二親和基團之間的結合。本發明通篇，可調節的組合物參數為例如溫度、PH或組合物的摩爾濃度。在使用 寡核苷酸作為親和基團的優選實施方式中，該結合可通過調節組合物溫度而被觸發，如此 溫度高于或低于各個雜交體的解鏈溫度。備選地，上面步驟a)_d)的進展可被如此改進以至于第一輻射測量是在混合兩種 組分之前進行的。該實施方式具有這樣的優點，即也可使用具有不可逆結合的親和基團。在依照本發明的一種優選方法中，步驟b)中所述第一輻射測量是采用所述第一 組分在步驟a)中混合兩種組分之前進行的。取決于用于本發明的染料，可使用激發波長和發射波長的幾種不同組合。在依照本發明的再一優選方法中，步驟b)中所述第一輻射測量是應用所述第一 染料特異性的激發波長并測量所述第一染料的發射強度而進行的。可采用只有第一染料以非結合狀態存在或兩種染料均以非結合狀態進行該第一 輻射測量。對使用非熒光染料的實施方式而言，沒有基于激發的可檢測的發射強度。在依照本發明的一種更優選方法中，沒有所述第一染料的發射強度是可測量的， 如果所述第一染料是非熒光染料。備選地，可采用第二熒光染料特異性的激發和發射波長進行第一輻射測量，如果 兩種染料均以非結合狀態存在。依照本發明的一種優選方法是這樣一種方法，其中步驟b)中所述第一輻射測量 是應用所述第二染料特異性的激發波長并測量所述第二染料的發射強度而進行的。此外，有可能采用第一染料特異性的激發波長和第二染料特異性的發射波長進行 第一輻射測量，如果兩種染料均以非結合狀態存在。取決于第一輻射測量，第二輻射測量是優選改造(adapted)的，如此，在兩次測量 中測量的是相同的發射波長。
依照本發明的另一優選方法是這樣一種方法，其中步驟c)中所述第二輻射測量 是應用所述第一染料特異性的激發波長并測量所述第二染料的發射強度而進行的。依照本法的再一優選方法是這樣一種方法，其中步驟c)中所述第二輻射測量是 應用所述第二染料特異性的激發波長并測量所述第二染料的發射強度而進行的。當然，如果第二輻射測量是基于第二染料特異性的波長的，則優選第一輻射測量 也基于第二染料特異性的相同波長。該實施方式的染料組合例如染料/染料組合(參見圖 la/i)或非熒光染料/染料組合(參見圖la/iii)。依照本發明的又一優選方法是這樣一種方法，其中步驟c)中所述第二輻射測量 是應用所述第一染料特異性的激發波長并測量所述第一染料的發射強度而進行的。當然，如果第一輻射測量是基于第一染料特異性的激發波長的，則優選第二輻射 測量也基于第一染料特異性的相同波長。該實施方式的染料組合例如染料/猝滅劑組合 (參見圖la/ii)。
本發明的又一方面是檢驗依照本發明的兩種組分的組合物比率的方法，所述方法 包括下列步驟a)混合兩種組分，其中第一組分包含具有所述第一親和基團的第一染料，第二組 分包含具有所述第二親和基團的第二染料，b)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第一輻射測量，在該條件下所述第一 染料和所述第二染料是結合的，所述第一熒光測量是應用所述第二染料特異性的激發波長 并測量所述第二染料的發射強度而進行的，以及c)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第二輻射測量，在該條件下所述第一 染料和所述第二染料是結合的，所述第二熒光測量是應用所述第一染料特異性的激發波長 并測量所述第二染料的發射強度而進行的，以及d)比較步驟b)和步驟c)中的兩次輻射測量以檢驗所述兩種組分的組合物比率。在檢驗依照本發明的兩種組分組合物比率方法的該實施方式中，兩次輻射測量是 采用親和基團以結合狀態存在而進行的(參見圖lb)。因為能量轉移只在一個方向上發生， 有可能甚至在結合狀態下，測量獨立于其它染料的染料中的一種。在依照本發明的一種更優選方法中，具有所述第一親和基團的所述第一染料和具 有所述第二親和基團的所述第二染料之間的所述結合是可逆的。因為對兩次輻射測量而言，染料均以結合狀態存在，因此，有可能但不是必要的， 即兩種親和基團之間的結合是不可逆的。本發明的再一方面是使用依照本發明的試劑盒檢驗兩種組分的組合物比率的方 法，所述方法包括下列步驟a)混合兩種組分，其中第一組分包含具有所述第一親和基團的熒光染料，第二組 分包含具有所述第二親和基團的芳香或雜芳結構，b)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第一輻射測量，在該條件下所述熒光 染料和所述芳香或雜芳結構未經由所述親和基團相互結合，所述第一輻射測量是應用所述 熒光染料特異性的激發波長并測量所述熒光染料的發射強度而進行的，c)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第二輻射測量，在該條件下所述熒光 染料和所述芳香或雜芳結構經由所述親和基團相互結合，所述第二輻射測量是應用所述熒光染料特異性的激發波長并測量所述熒光染料的發射強度而進行的，以及d)比較步驟b)和步驟c)中的兩次輻射測量以檢驗所述兩種組分的組合物比率。依照本發明的一種優選方法是這樣一種方法，其中步驟b)中所述第一輻射測量 是采用所述第一組分在步驟a)中混合兩種組分之前進行的。依照本發明的另一優選方法是這樣一種方法，其中步驟b)中所述第一輻射測量 是在組合物參數下進行的，如此阻止了所述第一親和基團和所述第二親和基團之間的結
口 o
圖1基于a)非結合以及結合測量和b)均以結合狀態存在的兩次測量的本發明的 不同實施方式。圖2兩種組分不同組合物的擴增曲線。圖3基于兩種用于兩種組分不同組合物控制的試驗性能。圖4不同猝滅劑分子的比較。圖5在使用非熒光染料和熒光染料的實施方式中非熒光染料的量變化。圖6在使用非熒光染料和熒光染料的實施方式中熒光染料的量變化。圖7使用DIG/抗-DIG作為非熒光染料和熒光染料的親和基團的本發明實施方 式。
具體實施例方式實施例1配有含兩種控制組分的兩種組分溶液的PCR裝置組分混合物A) 2-倍濃縮的主混合物由下列組成- ‘實時就緒的 DNA Master、探針(Realtime ready DNA Master, Probes)’, 用于實時PCR的試劑混合物(羅氏應用科學部(Roche AppliedScience)，分類號(cat no.) 05502381001)，包括4 y M依照Seq ID No. 3在5，-端末端標記有長波熒光染料(JA286， 羅氏應用科學部；最大激發在686nm，最大發射在703nm)的寡核苷酸。JA286染料的結構-lng/ u 1 人 cDNA (qPCR 人參照 cDNA，Clontech,分類號 639654)B) 2-倍濃縮的檢測混合物，其對于來自人cDNA的GAPDH基因是特異性的，其含有
-依照Seq ID No. 1 和 2 的人 GAPDH 引物各 1 U M-0. 8 ii M 人 GAPDH UPL 探針(通用探針實驗室(Universal ProbeLibrary)，探針 #60，羅氏應用科學部，分類號04688589001)-4iiM依照Seq ID No. 4在3’-端末端標記有非熒光猝滅劑Dabsyl (羅氏應用科 學部，W0 2007/059816，通過使用商購Dabsyl CPG而合成的)的寡核苷酸。依照Seq ID No. 3和4的兩種寡核苷酸是互補的。多孔PCR板的裝置為了證明反應混合物兩種組分溶液的不同比率在控制測量中的影響，使用 Nanodrop快速液體處理機器人(Innovadyne，部分編號(Part No.) 12043 (射流模塊 (Fluidics Module))和11245 (階段模塊(Stage Module)))將主混合物A和檢測混合物B 的不同組合分配至1536孔PCR板(羅氏應用科學部，分類號05358639001)中。 將每一種組合分配于代表技術重復(implicate)的1536孔板的96個位置中。PCR方案和控制測量在配有所提供的分析軟件(羅氏應用科學部)的LightCycler 1536儀器上進行 實時擴增和吸液控制測量。實時PCR 使用濾波器(filter)組合465 (激發)/510 (發射)進行擴增。
控制測量使用濾波器組合618 (激發)/660(發射)進行兩次單個的采集。 對反應板的每一孔計算高溫采集和低溫采集的比率。結果對于兩種組分溶液其中之一 50%降低的部分，擴增曲線仍然是可評價的，但PCR 性能開始下降(參見圖2)。對于省略了的組分，結果是陰性的。控制測量的比率清楚地表明缺乏組分。兩種組分溶液其中之一降低的越多，所計 算的比率越低(參見圖3)。通過對比率設定截止值(例如對該實驗而言為2的數值)，具 有導致無效結果的模擬吸量誤差的所有孔將顯示低于截止值的比率，且這些孔在結果中被 標記。對于降低的反應體積但正確的組分部分，PCR結果和控制比率均未受影響。實施例2用于第二控制組分的不同猝滅劑分子的用法為了驗證上述具有多種染料或猝滅劑分子的控制概念的性能，不同的可獲得的猝 滅劑分子顯示了溫度依賴性的熒光信號的變化。反應混合物由下列組成-‘實時就緒的DNA Master、探針，(羅氏應用科學部，分類號05502381001)，包括 2 U M依照Seq ID No. 3在5’ -端末端標記有長波熒光染料(JA286，羅氏應用科學部；最大 激發在686nm，最大發射在703nm，參見實施例1)的寡核苷酸。-2uM依照Seq ID No. 4在3’ -端末端標記有下列備選猝滅劑之一的寡核苷酸 Dabsyl Dabcyl BHQ-2.3x 額外的 dG 3x 脫氮 dG JA286 (用于染料自猝滅) 無猝滅劑控制^^將7種混合物吸量各10 ill置于384孔PCR板(羅氏應用科學部，分類號 04729749001)中，在LightCycler 480儀器(羅氏應用科學部，分類號05015243001)上采用上升的溫度梯度測量熒光。濾波器組合618 (激發)/660 (發射)。 結果對于所有測試的猝滅劑，當超過寡核苷酸的解鏈溫度且第一染料組分與第二猝滅 劑組分的結合被停止時，觀察到熒光的大量增加(參見圖4)。因此，所有這些猝滅劑將適用 于具有在不同溫度以結合狀態和非結合狀態兩次測量的控制概念。實施例3用于第二控制組分的非熒光染料的用法在該方法中，控制測量是在恒溫和相同的熒光檢測波長但用兩種不同的激發波長 下進行的。第一組分中的染料可采用直接激發測量。當第二組分中的非熒光染料(參見US 2007/0077588)經由親和基團與第一染料結合時，采用非熒光染料的激發在第一染料沒有 直接激發的短波長下測量該組合。但由于來自受激非熒光染料的能量轉移至緊密接近的第 一染料，從而發生第一染料的熒光發射。細分混合物A) 2-倍濃縮的組分A由下列組成-‘實時就緒的DNA Master、探針，，用于實時PCR的試劑混合物(羅氏應用科學 部，分類號05502381001)，包括4 iiM依照Seq ID No. 3在5，-端末端標記有長波熒光染料 (JA286，羅氏應用科學部；最大激發在686nm，最大發射在703nm，參見實施例1)的寡核苷酸。B) 2-倍濃縮的組分B包含-4iiM依照Seq ID No. 4在3’ -端末端標記有非熒光染料(4 ’ ,5' - 二甲氧 基-5-羧基二乙酸熒光素(5-DmF))的寡核苷酸。依照Seq ID No. 3和4的兩種寡核苷酸是互補的。多孔PCR板的裝置為了證明反應混合物兩種組分溶液的不同量在控制測量中的影響，吸量不同量的 組分A和組分B置于384孔PCR板(羅氏應用科學部，分類號04729749001)的孔中。
將每一種組分分配于代表技術重復的1536孔板的96個位置中。方案在LightCycler 480儀器(羅氏應用科學部，分類號05015243001)上和恒溫下測
量熒光。濾波器組合618 (激發)/660 (發射)和498/660。 MS來自第一染料(618/660)直接激發的信號證明與組分A的不同量相關，來自經由 非熒光染料(498/660)激發的信號證明與組分B的部分在恒定量組分A的存在下相關(參 見圖5和6)。實施例4dig/抗-dig作為兩種組分的親和基團的用法為了證明上述具有多種親和基團的控制概念的性能，使用地高辛配基(DIG)和抗 地高辛配基抗體(抗-DIG)用作染料JA286和非熒光染料(參見實例3)的親和基團。對 測量而言，在非熒光染料的吸收波長下激發溶液，在受體染料的發射波長下檢測熒光。
組分混合物A) 2-倍濃縮的組分A包含4uM標記有長波長熒光染料JA286 (羅氏應用科學部，最大激發在686nm，最大發 射在 703nm，參見實施例 1)的 DIG，于 10mM Tris pH 8. 3 和 3mM MgCl2 中。B) 2-倍濃縮的組分B包含-4 yM標記有非熒光染料(羅氏應用科學部)的抗-DIG抗體(羅氏應用科學部)， 于 10mM Tris pH 8. 3 和 3mM MgCl2 中。多孔PCR板的裝置為了證明兩種組分溶液其中之一缺乏在控制測量中的影響，吸量不同量的組分A 和組分B置于384孔PCR板(羅氏應用科學部，分類號04729749001)的孔中。 將每一種組合分配于代表技術重復的384孔板的10個位置中。方案在LightCycler 480儀器(羅氏應用科學部，分類號05015243001)上和恒溫下測
量熒光。濾波器組合498 (激發)/660 (發射)。 如果兩種組分存在于混合物中，由于來自受激供體的能量轉移至受體染料，因此 熒光染料是可測量的，所述熒光信號顯著高于當兩種組分中的一種被省略時可測量的背景 信號(參見圖7)。
權利要求
用于組合物比率控制的試劑盒，所述試劑盒包括a)具有第一親和基團的第一染料，所述第一染料可被第一激發光激發而發出輻射或轉移能量至第二染料，以及b)具有第二親和基團的第二染料，所述第二染料可被第二激發光激發或被來自第一染料的能量轉移激發，其特征在于，所述第一染料和所述第二染料是如此設置的-所述第一親和基團和所述第二親和基團具有相互結合的親和力，其中所述染料之間的能量轉移是在所述第一親和基團與所述第二親和基團結合后實現的，以及-所述第一染料和所述第二染料的混合物在被所述第一激發光或所述第二激發光激發后發出輻射，其中所述輻射是所述第一染料和所述第二染料的組合物比率的量度。
2.根據權利要求1的試劑盒，其中所述第一親和基團為第一寡核苷酸，所述第二親和 基團是與所述第一寡核苷酸互補的第二寡核苷酸。
3.根據權利要求1或2的試劑盒，其中所述第一染料為熒光染料，所述第二染料為猝滅 劑分子，所述猝滅劑分子可在結合親和基團之后被來自所述熒光染料的能量轉移激發，如 此，所述猝滅劑分子阻止所述熒光染料的熒光發射。
4.根據權利要求3的試劑盒，其中所述熒光染料和所述猝滅劑分子為相同的分子。
5.根據權利要求1或2的試劑盒，其中所述第一染料為第一熒光染料，所述第二染料為 第二熒光染料，所述第二熒光染料在較所述第一熒光染料更長的波長處有最大激發，其中 所述第二熒光染料可在結合親和基團后被來自所述熒光染料的能量轉移激發，如此，所述 第二熒光染料發射波長不同于所述第一熒光染料波長的熒光。
6.根據權利要求1或2的試劑盒，其中所述第一染料為非熒光染料，所述第二染料為熒 光染料，所述熒光染料可在結合親和基團后被來自所述非熒光染料的能量轉移激發，如此， 所述熒光染料發射熒光。
7.根據權利要求1-6任一項的試劑盒，其進一步包括第一反應組分。
8.用于組合物比率控制的試劑盒，所述試劑盒包括a)具有第一親和基團的熒光染料，所述第一染料可被第一激發光激發而轉移能量至芳 香或雜芳結構，以及b)具有第二親和基團的芳香或雜芳結構，所述芳香或雜芳結構可被來自所述第一染料 的能量轉移激發，如此，所述芳香或雜芳結構阻止所述熒光染料的熒光發射，其特征在于，所述第一染料和所述芳香或雜芳結構是如此設置的_所述第一親和基團和所述第二親和基團具有相互結合的親和力，其中所述染料和所 述芳香或雜芳結構之間的能量轉移是在所述第一親和基團和所述第二親和基團結合后實 現的，以及-所述第一染料和所述芳香或雜芳結構的混合物在被所述第一激發光激發后發出輻 射，其中所述輻射是所述第一染料和所述芳香或雜芳結構的組合物比率的量度。
9.使用依照權利要求1-7任一項的試劑盒檢驗兩種組分組合物比率的方法，所述方法 包括下列步驟a)混合兩種組分，其中第一組分包含具有所述第一親和基團的第一染料，第二組分包 含具有所述第二親和基團的第二染料，b)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第一輻射測量，在該條件下所述第一染料 和所述第二染料未經由所述親和基團相互結合，c)在用激發光激發后，在這樣條件下進行第二輻射測量，在該條件下所述第一染料和 所述第二染料經由所述親和基團相互結合，以及d)比較步驟b)和步驟c)中的兩次輻射測量以檢驗所述兩種組分的組合物比率。
10.根據權利要求9的方法，其中步驟b)中所述第一輻射測量是應用所述第一組分在 步驟a)中混合兩種組分之前進行的。
11.根據權利要求9或10的方法，其中步驟b)中所述第一輻射測量是應用所述第一染 料特異性的激發波長并測量所述第一染料的發射強度而進行的。
12.根據權利要求9的方法，其中步驟b)中所述第一輻射測量是應用所述第二染料特 異性的激發波長并測量所述第二染料的發射強度而進行的。
13.根據權利要求9-12任一項的方法，其中步驟c)中所述第二輻射測量是應用所述第 一染料特異性的激發波長并測量所述第二染料的發射強度而進行的。
14.根據權利要求9-12任一項的方法，其中步驟c)中所述第二輻射測量是應用所述第 一染料特異性的激發波長并測量所述第一染料的發射強度而進行的。
15.使用依照權利要求5-7任一項的的試劑盒檢驗兩種組分組合物比率的方法，所述 方法包括下列步驟a)混合兩種組分，其中第一組分包含具有所述第一親和基團的第一染料，第二組分包 含具有所述第二親和基團的第二染料，b)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第一輻射測量，在該條件下所述第一染料 和所述第二染料是結合的，所述第一熒光測量是應用所述第二染料特異性的激發波長并測 量所述第二染料的發射強度而進行的，以及c)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第二輻射測量，在該條件下所述第一染料 和所述第二染料是結合的，所述第二熒光測量是應用所述第一染料特異性的激發波長并測 量所述第二染料的發射強度而進行的，以及d)比較步驟b)和步驟c)中的兩次輻射測量以檢驗所述兩種組分的組合物比率。
16.根據權利要求15的方法，其中具有所述第一親和基團的所述第一染料和具有所述 第二親和基團的所述第二染料之間的所述結合是不可逆的。
17.使用依照權利要求8的試劑盒檢驗兩種組分組合物比率的方法，所述方法包括下 列步驟a)混合兩種組分，其中第一組分包含具有所述第一親和基團的熒光染料，第二組分包 含具有所述第二親和基團的芳香或雜芳結構，b)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第一輻射測量，在該條件下所述熒光染料 和所述芳香或雜芳結構未經由所述親和基團相互結合，所述第一輻射測量是應用所述熒光 染料特異性的激發波長并測量所述熒光染料的發射強度而進行的，c)在用激發光激發后，在這樣的條件下進行第二輻射測量，在該條件下所述熒光染料 和所述芳香或雜芳結構經由所述親和基團相互結合，所述第二輻射測量是應用所述熒光染 料特異性的激發波長并測量所述熒光染料的發射強度而進行的，以及d)比較步驟b)和步驟c)中的兩次輻射測量以檢驗所述兩種組分的組合物比率。
18.根據權利要求17的方法，其中步驟b)中所述第一輻射測量是采用所述第一組分在 步驟a)中混合兩種組分之前進行的。
全文摘要
用于液體轉移控制的染料組合物。本發明提供了用于組合物比率控制的試劑盒和方法，其基于被設計為相互之間能夠進行能量轉移的染料。更詳細地，采用本發明的方法，可以檢驗包含第一染料的第一組分與包含第二染料的第二組分的混合比率。
文檔編號C12Q1/68GK101858834SQ20101016189
公開日2010年10月13日 申請日期2010年4月8日 優先權日2009年4月9日
發明者C·韋爾克, D·海因德爾, H·-P·約塞爾, W·安肯鮑爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司