專利名稱：糖核苷酸的酶法制備的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物藥物技術領域，具體地說，涉及包括⑶P-Fuc、CMP-Sia、 UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc在內的糖核苷酸的酶法制備方法。
背景技術：
糖類是生物體內最基本的組成部分之一，糖結構的表達異常是腫瘤表型的標志之一。結構均一性糖鏈的獲得是破解它們生物功能謎題的先決條件。人們開發了多種合成復雜糖結構的方法和工藝。這個前沿領域的發展彳等為糖鏈功能的測定，糖鏈結構-功能關系的解析，生物合成途徑的闡明，以及基于糖的抗菌抗癌疫苗的生產奠定基礎。體外糖合成有兩種常用策略化學合成和酶法(包括化學-酶法)合成。復雜糖鏈目前依然是有機化學合成中具有挑戰性的化合物。實踐檢驗，酶法合成被證明是化學合成的有效替代途徑。與化學方法相此，酶法合成在更為有效進行高度空間和立體化學特異性的糖基化反應方面具有明顯的優勢。用于糖合成的酶主要是糖基轉移酶。而糖基轉移酶催化的反應需要糖核苷酸作為糖基供體。如下圖所示，其中R代表不同的核苷。
權利要求
1.糖核苷酸的酶法制備，包括三類糖核苷酸，分別是⑶P-Fuc、CMP-Sia、UDP-GlcNAc/ UDP-GalNAc，由下述步驟組成(1).酶表達載體的構建克隆出⑶P-Fuc合成酶(FKP)、氮乙酰六糖胺激酶(NahK)、GlcNAc-I-Puridyltransf erase (GlmU)、CMP-Sia合成酶(NmCSS)，經酶切后插入大腸桿菌載體，分別命名為v_FKP、 v-NahK, v-GlmU, v-NmCSS ；(2).酶的過量表達與純化4専上述表達載體分別轉化入大腸桿菌形成表達特異酶的工程菌株。彳奪陽性克隆工程菌株接種于LB培養基中，37°C培養10-12小時后轉接入新的LB培養基中，37°C繼續培養 2-4小時，搖床轉速為200-250轉/分鐘；當方發酵液濃度達到OD6tltl = 0. 6-0. 8時，加入 IPTG誘導蛋白表達20小時，溫度為16°C，搖床轉速為200-250轉/分鐘；菌體通過離心收集，經過細胞破碎后使用親和層析純化目的蛋白；(3).糖核苷酸⑶P-Fuc的酶法制備與純化以等物質的量的L-巖藻糖、ATP、GTP為底物，反應液中加入終濃度為20mM的氯化鎂和每克反應10個單位的焦磷酸水解酶，反應在GDP-Fuc合成酶FKP的作用下進行，使用薄板層析檢測反應的進度；待反應完成后，彳芬反應液與活性炭混合，使用10體積的水和20體積的10%的乙醇洗滌，然后使用含有5%氨水的35%乙醇洗脫；洗脫液經濃縮并真空抽去氨水和乙醇后進行離子交換純化，最后使用氯化鈉溶液洗脫；得到的溶液使用活性炭除鹽。(4).糖核苷酸CMP-Sia的酶法制備與純化以等物質的量的唾液酸、CTP為底物，反應液中加入終濃度為20mM的氯化鎂，反應在 CMP-Sia合成酶NmCSS的作用下進行，使用薄板層析檢測反應的進度；待反應完成后，使用與步驟(3)中相似的方法純化；(5).糖核苷酸UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc的酶法制備與純化以等物質的量的氮乙酰葡萄糖胺/氮乙酰半乳糖胺、ATP、UTP為底物，反應液中加入終濃度為20mM的氯化鎂和每克反應10個單位的焦磷酸水解酶，反應在NahK和GlmU的作用下進行，使用薄板層析檢測反應的進度；待反應完成后，彳等反應液與活性炭混合，使用與步驟(3)中相似的方法純化。
2.如權利要求1中所述糖核苷酸的酶法制備，其特征是，步驟(1)中所述的GDP-Fuc合成酶是來源于人體共生微生物Bacteroides fragilis的FKP。
3.如權利要求1中所述糖核苷酸的酶法制備，其特征是，步驟(1)中所述的GIcNAC-I-P uridyltransferase是來源于大腸桿菌K12的GlmU。
4.如權利要求1中所述糖核苷酸的酶法制備，其特征是，步驟(1)中所述的氮乙酰六糖胺激酶是來 Bifidobacterium Iongum 的 NahK。
5.如權利要求1中所述糖核苷酸的酶法制備，其特征是，步驟(1)中所述的CMP-Sia合成酶是來源于 Neisseria meningitidis 的 NmCSS。
6.如權利要求1中所述糖核苷酸的酶法制備，其特征是，步驟(1)中所述的載體為 pET15b, pET22b等大腸桿菌表達載體及在此基礎上改造的載體。
7.如權利要求1中所述糖核苷酸的酶法制備，其特征是，步驟( 中所述的大腸桿菌表達菌株為BL21 (DE3)或其他含有DE3特性的大腸桿菌菌株。
8.如權利要求1中所述糖核苷酸的酶法制備，其特征是，步驟O)中所述的IPTG濃度為 0. 2-0. 4mM。
9.如權利要求1中所述糖核苷酸的酶法制備，其特征是，步驟(3)、(5)中所述的反應 PH值均為8，使用氫氧化鈉溶液調節pH。
10.如權利要求1中所述糖核苷酸的酶法制備，其特征是，步驟⑷中所述的反應pH值均為9，使用氫氧化鈉溶液調節pH，并使用IOOmM Tris-HCl作為緩沖體系。
全文摘要
本發明涉及糖核苷酸的酶法制備，即利用分子生物學技術構建糖核苷酸合成酶表達載體，轉化入大腸桿菌進行過量表達，目的蛋白進行粗略純化后在體外催化糖核苷酸的合成。本發明涉及三類四種糖核苷酸的酶法合成GDP-Fuc、CMP-Sia、UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc。使用本發明描述的方法能夠大量制備糖核苷酸，并大大簡化制備步驟和降低制備成本。
文檔編號C12N15/70GK102443597SQ20101050765
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月15日 優先權日2010年10月15日
發明者原靜, 李磊, 王鳳榮, 王鵬 申請人:天津賽科瑞德生物科技有限公司