專利名稱：一種用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種固定化脂肪酶的方法。
背景技術：
脂肪酶是一類特殊的酰基水解酶，在動植物各種組織及許多微生物中普遍存在， 是人類最早研究的酶類之一。它的天然底物是油脂，具有對油-水界面的親和力，能催化酯水解或醇解、酯合成、酯交換、多肽合成等反應，在制藥、試劑、食品加工、生物能源等方面有著很大的應用潛力。但脂肪酶是水溶性的，不易回收重復使用，粉末狀脂肪酶分散于有機溶劑中容易失活，于酶的固定化有利于酶的分散、回收和再利用，減少了酶的損耗和殘余酶產生的再次污染。科學家們一直對酶的固定化技術進行研究，但迄今為止，幾乎沒有一種固定化技術能普遍適用于每一種酶，所以要根據酶的應用目的和特性，來選擇其固定化方法。目前已建立的固定化方法一般可分為包埋法、吸附法、交聯法及共價偶聯法等。從20世紀50年代膜分離技術進入工業化以來，經過幾十年的發展，它已廣泛滲透到化工、冶金、環保、生物工程等領域。分離膜不僅能對氣體、有機物、各類生物制劑等進行有效的分離、濃縮、純化，而且還能作為固定化酶的載體，實現酶的膜固定化。固定化酶膜可將酶的催化特性和膜的分離、載體和分隔功能等結合起來，從而構成酶膜生物反應器，具有其他載體不可比擬的優點。近年來酶的膜固定化技術己經成為研究的熱點領域。醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜具有一定的吸附性、化學穩定性好、疏水性、機械性能優異等優點， 根據復合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反應體系中的活性和穩定性，調節和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收和產品的生產。
發明內容
本發明是針對單膜法固定化脂肪酶效果不理想的問題，而提出的用醋酸纖維素/ 聚四氟乙烯復合膜來進行固定化脂肪酶的方法。用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶的方法通過以下步驟實現一、復合膜的制備。二、脂肪酶的固定化。三、酶活力的測定。四、固定化條件的優化。五、固定化酶酶學性質的討論。六、通過固定化酶膜的SEM圖像進一步解釋利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶的優勢。利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶中，酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜具有一定的吸附性、化學穩定性好、疏水性、機械性能優異等優點，根據復合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反應體系中的活性和穩定性，調節和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收，最終得到的固定化酶活為17. 2U/cm2,明顯高于文獻中單膜法固定化脂肪酶的活力。
具體實施例方式具體實施方式
一用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶的方法通過以下步驟實現一、復合膜的制備將15g醋酸纖維素60°C下溶于85g 二甲基甲酰胺中得到鑄膜液。將聚四氟乙烯膜先用0. lmol/L的NaOH溶液和0. lmol/L的HCl溶液清洗，然后用去離子水清洗，真空干燥后，平鋪在潔凈的玻璃板上。將醋酸纖維素鑄膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，控制厚度，在室溫下揮發適當的時間完成干相轉換后，浸入去離子水完成濕相轉換。1 后用去離子水清洗，自然干燥待用；二、脂肪酶的固定化取若干份Icm2的醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜于三角瓶中，分別加入一定量的酶液和PH7. 5的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀緩沖液，恒溫攪拌吸附一定時間(25°C，170r/min)。再加入一定量戊二醛進行交聯反應，反應結束后取出酶膜，用去離子水沖洗，放于干燥處待其風干后測定酶活。三、 酶活力的測定采用橄欖油乳化法；四、固定化條件的優化分別在溫度5 35°C，吸附時間0. 5 3h，酶液濃度0. 005 0. 03g/mL,交聯時間1 6h，交聯劑濃度0. 05 0. 3%的條件下，通過測定固定化酶活力得到最佳的固定化條件。五、固定化酶酶學性質的討論在溫度15 55°C，pH 5. 5 9. 5范圍內，通過測定固定化酶和游離酶的活力，得出固定化酶的最適溫度，最適PH值。并通過5 12次重復使用固定化酶水解橄欖油來討論固定化酶的使用穩定性。六、通過固定化酶膜的SEM圖像進一步解釋利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶的優勢。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜與酶液在溫度20 30°C的條件下進行脂肪酶的吸附固定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜與酶液在溫度5 35°C的條件下，吸附固定2 池。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時間0. 5 3h，的條件下，添加濃度為0. 015 0. 025g/mL的酶液。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時間0. 5 3h，酶液濃度0. 005 0. 03g/mL的條件下，與戊二醛交聯2 4h。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時間0. 5 3h，酶液濃度0. 005 0. 03g/mL，與戊二醛交聯1 Mi的條件下，添加濃度為0. 15% 0. 25%的交聯劑。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟五中將固定化酶與游離酶在溫度25 45°C條件下，比較固定化酶與游離酶的最適溫度。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟五中將固定化酶與游離酶在PH7 9. 5條件下，比較固定化酶與游離酶的最適pH值。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟五中將固定化酶重復使用10次來水解橄欖油，得到固定化酶的相對酶活力為原酶活的55. 5%。其它步驟與具體實施方式
一相同。
權利要求
1.一種用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶的方法，其特征在于用復合膜來固定化脂肪酶的方法通過以下步驟實現一、復合膜的制備將15g醋酸纖維素60°C下溶于8 二甲基甲酰胺中得到鑄膜液。將聚四氟乙烯膜先用0. lmol/L的NaOH溶液和0. Imol/ L的HCl溶液清洗，然后用去離子水清洗，真空干燥后，平鋪在潔凈的玻璃板上。將醋酸纖維素鑄膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，控制厚度，在室溫下揮發適當的時間完成干相轉換后，浸入去離子水完成濕相轉換。1 后用去離子水清洗，自然干燥待用；二、脂肪酶的固定化取若干份Icm2的醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜于三角瓶中，分別加入一定量的酶液和PH 7. 5的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀緩沖液，恒溫攪拌吸附一定時間(25°C， 170r/min) 0再加入一定量戊二醛進行交聯反應，反應結束后取出酶膜，用去離子水沖洗， 放于干燥處待其風干后測定酶活。三、酶活力的測定采用橄欖油乳化法；四、固定化條件的優化分別在溫度5 35°C，吸附時間0. 5 3h，酶液濃度0. 005 0. 03g/mL,交聯時間 1 6h，交聯劑濃度0. 05 0. 3%的條件下，通過測定固定化酶活力得到最佳的固定化條件。五、固定化酶酶學性質的討論在溫度15 55°C，pH 5. 5 9. 5范圍內，通過測定固定化酶和游離酶的活力，得出固定化酶的最適溫度，最適PH值。并通過重復使用固定化酶水解橄欖油來討論固定化酶的使用穩定性。六、通過固定化酶膜的SEM圖像進一步解釋利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶的優勢。
2.根據權利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜與酶液在溫度20 30°C的條件下進行脂肪酶的吸附固定。
3.根據權利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜與酶液在溫度5 35°C的條件下，吸附固定2 汕。
4.根據權利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時間0. 5 3h， 的條件下，添加濃度為0. 015 0. 025g/mL的酶液。
5.根據權利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時間0. 5 3h， 酶液濃度0. 005 0. 03g/mL的條件下，與戊二醛交聯2 4h。
6.根據權利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時間0. 5 3h， 酶液濃度0. 005 0. 03g/mL,與戊二醛交聯1 Mi的條件下，添加濃度為0. 15% 0. 25% 的交聯劑。
7.根據權利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟五中將固定化酶與游離酶在溫度25 45°C條件下，比較固定化酶與游離酶的最適溫度。
8.根據權利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟五中固定化酶與游離酶在PH7 9. 5條件下，比較固定化酶與游離酶的最適pH值。
9.根據權利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟五中將固定化酶重復使用10次來水解橄欖油，得到固定化酶的相對酶活力為原酶活的55. 5%。
全文摘要
本發明提供一種以醋酸纖維素和聚四氟乙烯膜為材料制備了醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜，采用吸附-交聯相結合的固定化方法，用該復合膜來固定化脂肪酶。研究了溫度、吸附時間、酶液濃度、交聯時間和交聯劑濃度等不同固定化條件對脂肪酶固定化效率和催化效果的影響，并對固定化酶膜的酶學性質進行了討論。通過固定化酶膜的SEM圖像進一步解釋利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜固定化脂肪酶的優勢。根據本發明中復合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反應體系中的活性和穩定性，調節和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收和產品的生產，最終得到的固定化酶活為17.2U/cm2，明顯高于文獻中單膜法固定化脂肪酶的活力。
文檔編號C12N11/08GK102304503SQ201110290420
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月20日 優先權日2011年9月20日
發明者于殿宇, 劉鑫, 周曉丹, 周璇, 宋云花, 張佳寧, 張春艷, 時敏, 李志平, 李越, 江連洲, 王妍, 王立琦, 王雪, 胡立志, 陳曉慧 申請人:東北農業大學