專利名稱：3t3-l1脂肪前體細胞誘導分化方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是一種3T3-L1脂肪前體細胞誘導分化方法。
背景技術：
脂肪前體細胞是一類能夠增殖并向脂肪細胞分化的特異化的前體細胞。它是成熟脂肪細胞的前體。在開始向脂肪細胞分化前，脂肪前體細胞形態上類似成纖維細胞，呈長梭形。開始分化后，脂肪前體細胞逐漸喪失長梭形的形態，向圓球形轉變，同時細胞內甘油三脂的含量逐漸上升，細胞骨架蛋白等的含量下降。細胞內出現脂滴，脂肪前體細胞逐漸向成熟脂肪細胞轉化。由于脂肪前體細胞不含脂滴，體積小，有促血管生成特性，在細胞的收集與移植過程中比成熟的脂肪細胞更能耐受缺血與創傷，尤其在脂肪移植后的缺血期，使單個細胞比塊狀脂肪更易通過細胞融合而成活。研究顯示抑制RAS可以減少糖尿病的發病及并發癥的產生，但多項研究并未發現糖尿病患者血液中腎素或是血管緊張素II有所增高，隨著多組織包括胰腺組織、脂肪組織、心臟組織中表達RAS各成分的發現，人們越來越關注局部RAS的激活是否在糖尿病及其并發癥的發生發展中起到重要作用。研究證實人類脂肪細胞可產生RAS的各種成分包括血管緊張素原、腎素或腎素樣活性物質、血管緊張素轉換酶、血管緊張素II I型和血管緊張素II 2型受體。近年來的研究更發現，人類脂肪組織還可表達腎素受體及血管緊張素轉化酶2。脂肪組織其釋放的血管緊張素原不僅是局部RAS的重要來源，更是循環RAS的重要組成成分。研究結果提示脂肪組織局部存在幾乎所有RAS的相關組分，其不僅作用于局部組織更是作為循環RAS的重要組成作用于全身各組織。因此其對糖尿病的發病及并發癥發生也有重要影響。由于脂肪組織在機體分布廣泛，包括皮下脂肪、內臟周圍脂肪、血管周圍脂肪等，因此局部RAS其作用范圍廣泛。腎素-血管緊張素系統不僅可反饋作用于脂肪細胞，影響其增生分化及脂肪代謝。此外脂肪細胞分泌的血管緊張素II還可以促進各種炎癥因子如白介素-6、TNF- α，I趨化分子-1 (ICAM-1)，血管細胞趨化分子_1 (VCAM-1)等的表達和釋放，從而參與糖尿病發病及并發癥的病理生理過程。然而脂肪組織中RAS的表達變化調節因素多樣，機制尚不明確。且由于作為血管緊張素前體的血管緊張素原在脂肪組織中大量表達，許多研究主要集中在脂肪組織內血管緊張素原的生成、調節和釋放方面，而對RAS其他各成分的變化并不十分明確。為了建立脂肪前體細胞培養體系，研究局部脂肪組織中RAS的激活在糖尿病及其并發癥的發生發展中起到作用具有現實意義。
發明內容
本發明的目的在于提供一種脂肪前體細胞誘導分化方法，用于研究局部脂肪組織中RAS的激活在糖尿病及其并發癥的 發生發展中起到作用。一種3T3-L1脂肪前體細胞誘導分化方法，包括以下步驟
(一)3T3-L1前脂肪細胞株的復蘇從液氮種取出細胞株，立即置于37°C水浴箱中，至細胞液完全溶解時取出，將復蘇的細胞加入在室溫IOOOrpm離心5min，棄去上清，再加入培養液，吹打重懸，將重懸的細胞及培養液吸入培養皿中，顯微鏡下觀察細胞形態及數量，將培養皿置于5%C02的37°C恒溫培養箱中培養；(二)3T3-L1前脂肪細胞株的培養顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭行，透亮，細胞每2天更換I次培養液，傾斜培養皿，將培養液用移液管移去，沿壁加入培養液；(三)3T3-L1前脂肪細胞株的傳代顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭形或多角形，細胞密度約80%，傾斜培養皿，將培養液用移液器移去，沿壁加入溫熱的PBS溶液6ml，晃動培養皿后，用移液器移去，重復一次，加入Trypsin進行消化，顯微鏡下見細胞由不規則多角形或梭形收縮成圓形，過程約30秒，加入培養液終止消化，用移液器吹打，使細胞脫離培養皿底，吸入離心管中，IOOOrpm離心4min，傾去上清，加入培養液，吹打使細胞分散；取含有細胞的培養液加入孔板，置于5%C02的37°C恒溫培養箱中培養；(四)3T3_L1前脂肪細胞株的誘導分化上述傳代細胞培養至完全長滿后3天開始誘導分化；加入含有誘導劑(1. OuM地塞米松，1. OmM IBMX,1. 7uM胰島素)和小牛血清(10%)的DMEM培養液，培養2天；顯微鏡下見少數細胞呈圓形，并有脂滴出現；加入僅有1. 7uM胰島素(1. 7uM)、小牛血清(10%)的DMEM培養液繼續培養；繼續誘導6天后，顯微鏡下見細胞基本呈圓形，細胞內含有多個較大的脂滴，即分化為成熟的脂肪細胞。使用本發明上述方法對3T3-L1脂肪前體細胞進誘導分化至誘導后8天，視野中大約90%細胞分化為典型的成熟脂肪細胞，細胞體積增大，胞體變圓，胞漿內脂滴明顯，部分融合成較大脂滴。可見本發明具有較好的分化效果和分化效率。
圖1為成熟的3T3-L1脂肪細胞油紅O染色結果(20X)。
具體實施例方式本實施例用到的各種試劑(I)各PCR引物上海英俊生物技術有限公司合成，用DEPC水配成IOmmoI/L濃度，-20°C保存。(2)油紅O染液0. 25g油紅O加入IOOml異丙醇，56°C溶解I小時，冷卻后過濾作為儲存液。使用時，取上述儲存液與ddH20以6:4比例混勻，靜置IOmin即為使用液。(3) IOmM地塞米松儲存液(10000X ):以無水乙醇溶解后，_20°C儲存。(4)0. 5IBMX 儲存液(1000X):以 DMSO 溶解后，_20°C儲存。(5)磷酸緩沖液(PBS):用10XPBS儲存液，用超純水以1:9比例配置，pH值調到
7.2，高溫滅菌后備用。(6)甲醛固定液將40%甲醛10ml、L Ig氯化鈣加入90mlddH20中，調節PH至7. O。(7)3T3_L1 脂肪前體細胞，購自美國 ATCCXAmerican Type Culture Collection)。誘導分化具體包括(一)3T3-L1前脂肪細胞株的復蘇(I)從液氮種取出細胞株，立即置于37°C水浴箱中，至細胞液完全溶解時取出；
(2)將復蘇的細胞加入裝有IOml培養液的15ml離心管中，室溫IOOOrpm離心5min ；(3)棄去上清，再加入6ml培養液，吹打重懸；(4)將重懸的細胞及培養液吸入35mm培養皿中；(5)顯微鏡下觀察細胞形態及數量；(6)將培養皿置于5%C02的37°C恒溫培養箱中培養；(二)3T3-L1前脂肪細胞株的培養(I)顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭行，透亮，細胞每2天更換I次培養液；(2)傾斜培養皿,將培養液用移液管移去,沿壁加入培養液；(三)3T3-L1前脂肪細胞株的傳代(I)顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭形或多角形，細胞密度約80% ；(2)傾斜培養皿,將培養液用移液器移去；(3)沿壁加入溫熱的PBS溶液6ml，晃動培養皿后，用移液器移去，重復一次；(4)加入ImlTryps in進行消化，顯微鏡下見細胞由不規則多角形或梭形收縮成圓形，過程約30秒；(5)加入2m培養液終止消化；(6)用移液器吹打，使細胞脫離培養皿底，吸入離心管中，IOOOrpm離心4min ；(7)傾去上清，加入40ml培養液，吹打使細胞分散；(8)取含有細胞的培養液加入12孔板，每孔加入1ml，置于5%C02的37°C恒溫培養箱中培養；(四)3T3-L1前脂肪細胞株的誘導分化( I)上述傳代細胞培養至完全長滿后3天開始誘導分化；(2)加入含有誘導劑(1. OuM地塞米松，1. OmM IBMX，1. 7uM胰島素)和小牛血清(10%)的DMEM培養液，培養2天；(3)顯微鏡下見少數細胞呈圓形，并有脂滴出現；(4)加入僅有1. 7uM胰島素(1. 7uM)、小牛血清(10%)的DMEM培養液繼續培養；(5)繼續誘導6天后，顯微鏡下見細胞基本呈圓形，細胞內含有多個較大的脂滴，即分化為成熟的脂肪細胞。油紅染色(I)移去培養液，沿壁緩慢加入PBSlml，沖洗后移去，重復2次。(2)用10%甲醛固定液固定細胞lOmin。(3) PBSlml 沖洗 3 次。移去 PBS。(4)將固定細胞晾干20min。(5)加入油紅O染液，使染料全部覆蓋細胞表面，放置lOmin。(6)吸去油紅O染液，用60%異丙醇洗滌細胞2次。(7)加入ddH20清洗，重復3-4次。(8)倒置顯微鏡下觀察結果，拍攝照片。3T3-L1脂肪細胞的誘導分化鑒定試驗中用倒置相差顯微鏡觀察細胞誘導分化整個過程中的形態變化。開始誘導分化后第2天，3T3-L1細胞由最初的梭行逐漸變為圓形，部分胞漿內出現細小脂滴，此后含有脂滴的細胞增多，脂滴增多、增大，至誘導后8天，視野中大約90%細胞分化為典型的成熟脂肪細胞，細胞體積增大，胞體變圓，胞漿內脂滴明顯，部分融合成較大脂滴，油紅染色結果見圖1。 以上所述為本發明的較佳實施例而已，但本發明不應該局限于該實施例所公開的內容。所以凡是不脫離本發明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發明保護的范圍。
權利要求
1.一種3T3-L1脂肪前體細胞誘導分化方法，其特征在于，包括以下步驟 (一)3T3-L1前脂肪細胞株的復蘇從液氮種取出細胞株，立即置于37°C水浴箱中，至細胞液完全溶解時取出，將復蘇的細胞加入在室溫IOOOrpm離心5min，棄去上清，再加入培養液，吹打重懸，將重懸的細胞及培養液吸入培養皿中，顯微鏡下觀察細胞形態及數量，將培養皿置于5%C02的37°C恒溫培養箱中培養； (二)3T3-L1前脂肪細胞株的培養顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭行，透亮，細胞每2天更換I次培養液，傾斜培養皿，將培養液用移液管移去，沿壁加入培養液； (三)3T3-L1前脂肪細胞株的傳代顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭形或多角形，細胞密度約80%，傾斜培養皿，將培養液用移液器移去，沿壁加入溫熱的PBS溶液6ml，晃動培養皿后，用移液器移去，重復一次，加入Trypsin進行消化，顯微鏡下見細胞由不規則多角形或梭形收縮成圓形，過程約30秒，加入培養液終止消化，用移液器吹打，使細胞脫離培養皿底，吸入離心管中，IOOOrpm離心4min，傾去上清，加入培養液，吹打使細胞分散；取含有細胞的培養液加入孔板，置于5%C02的37°C恒溫培養箱中培養； (四)3T3-L1前脂肪細胞株的誘導分化上述傳代細胞培養至完全長滿后3天開始誘導分化；加入含有誘導劑(1. OuM地塞米松，1. OmM IBMX,1. 7uM胰島素)和小牛血清(10%)的DMEM培養液，培養2天；顯微鏡下見少數細胞呈圓形，并有脂滴出現；加入僅有1. 7uM胰島素(1. 7uM)、小牛血清(10%)的DMEM培養液繼續培養；繼續誘導6天后，顯微鏡下見細胞基本呈圓形，細胞內含有多個較大的脂滴，即分化為成熟的脂肪細胞。
全文摘要
本發明公開了一種3T3-L1脂肪前體細胞誘導分化方法，包括3T3-L1前脂肪細胞株的復蘇、3T3-L1前脂肪細胞株的培養、3T3-L1前脂肪細胞株的傳代和3T3-L1前脂肪細胞株的誘導分化。使用本發明上述方法對3T3-L1脂肪前體細胞進誘導分化至誘導后8天，視野中大約90%細胞分化為典型的成熟脂肪細胞，細胞體積增大，胞體變圓，胞漿內脂滴明顯，部分融合成較大脂滴。本發明具有較好的分化效果和分化效率。
文檔編號C12N5/077GK103060267SQ201210576430
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者寧光, 方萍, 湯正義, 崔斌, 王衛慶 申請人:上海市內分泌代謝病研究所