專利名稱：一種定向誘導雞胚原始生殖細胞向脂肪細胞分化的方法
技術領域：
本發明涉及一種定向誘導雞胚原始生殖細胞向脂肪細胞分化的方法，屬于治療性克隆、細胞工程、組織工程技術領域。
背景技術：
胚胎原始生殖細胞(Embryonic Primordial germ cells，EPGCs)是胚胎生殖譜系最原始形式的細胞，是精子或卵子的祖先細胞。EPGCs作為一種多潛能干細胞，與ES細胞一樣，在體外適當的條件下可以分化為其他類型的細胞，是臨床醫學和組織工程研究中最有前途的種子細胞之一。Jiang等成功將成人骨髓間充質干細胞誘導成脂肪細胞，Yagami對人的軟骨中分離到的間葉干細胞進行了誘導，結果顯示間葉干細胞分化為脂肪細胞。目前，作為一種重要的胚胎源性干細胞，其定向分化方面的研究大多見于骨髓間充質干細胞、小鼠胚胎干細胞和骨髓基質細胞等方面，而對于雞EPGCs的相關研究報道很少。胚胎源性干細胞的分化研究將為今后細胞替代療法和組織治療甚至器官移植提供新的來源，為人類完美修復或替代因遺傳或后天疾病引起的重要組織、器官的缺陷及損傷提供新思路。因此，對于雞EPGCs的分化研究在整個干細胞研究中占據著重要的位置。
發明內容
本發明的目的是提供一種操作簡便、可重復性強、在體外對雞胚原始生殖細胞進行定向誘導分化培養能獲得脂肪細胞的方法。
本發明的技術方案是一種定向誘導雞胚原始生殖細胞向脂肪細胞分化的方法，其特征是利用脂肪細胞誘導劑對雞胚原始生殖細胞進行體外誘導分化培養，最終定向分化為脂肪細胞。
所述的誘導劑包括90％DMEM、10％FBS、5.5×10-5β-巰基乙醇、1×10-6mol/L地塞米松、10mg/L胰島素、5×10-4mol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤配制的誘導劑I和90％DMEM、10％FBS、5.5×10-5β-巰基乙醇、10mg/L胰島素配制的誘導劑II。
所述的誘導分化步驟包括1)雞胚原始生殖細胞的分離、培養與傳代采用單獨酶解離法在雞胚發育的第19期和第28期提取生殖腺中聚集的EPGCs，培養5～6天，用EDTA-胰酶消化液把EPGCs克隆消化成單個細胞，接種到新的培養瓶中培養，將細胞傳至4代；2)雞胚原始生殖細胞向脂肪細胞定向誘導分化雞胚原始生殖細胞在培養48小時后，將原有基礎培養基更換為誘導劑I，處理3天后，再更換為誘導劑II處理1天，如此循環3次后，用誘導劑II繼續處理，至誘導分化21天后行脂肪細胞油紅O染色；3)脂肪細胞油紅O染色誘導后細胞用PBS洗滌3次，10％～15％的聚甲醛固定10～15分鐘，油紅O染色30分鐘，60％異丙醇稍洗去多余染液，蒸餾水洗，蘇木精淺染核15分鐘，1％鹽酸-酒精溶液稍分化，水漂洗10分鐘。
所述的原有基礎培養基含有10％的胎牛血清、2％的雞血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/L β-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、10IU/ml鼠白血病抑制因子(mLIF)、5ng/ml人干細胞生長因子(hSCF)、10ng/ml堿性成纖維生長因子(bFGF)、0.04ng/ml人白細胞介素-11(hIL-11)、10ng/ml胰島素樣生長因子(hIGF)的高糖DMEM培養液。
本發明工藝先進簡單，誘導劑和基礎培養基配制科學合理。采用誘導劑I(90％DMEM+10％FBS+5.5×10-5β-巰基乙醇+1×10-6mol/L地塞米松+10mg/L胰島素+5×10-4mol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)與誘導劑II(90％DMEM+10％FBS+5.5×10-5β-巰基乙醇+10mg/L胰島素)循環誘導法，對傳至4代的第19期和第28期的雞胚原始生殖細胞進行體外定向誘導，結果表明在該誘導劑的作用下，能誘導產生75％～90％的脂肪細胞，對其進行油紅O染色鑒定，細胞均呈強陽性。
本發明成功將雞胚原始生殖細胞誘導成脂肪細胞，為今后細胞替代療法和組織治療甚至器官移植提供新的來源，進而實現人類完美修復或替代因遺傳或后天疾病引起的重要組織、器官的缺陷及損傷的夢想。本發明證明了雞胚原始生殖細胞具有發育多能性的性質，并為臨床醫學研究建立細胞模型，廣泛應用于組織工程領域提供可靠的實驗數據。實現本發明無需特殊的儀器要求，只需要掌握一般的細胞分離和培養的操作，簡便易行。本發明所采用的方法同樣適合于其它禽類與哺乳類動物以及其它類型的干細胞，提供一種操作簡便、可重復性強的方法。
圖1a、1b為EPGCs成脂誘導72小時后形成的典型戒環樣結構圖片；圖2a、2b為EPGCs成脂誘導21天后行脂肪細胞油紅O染色圖片。
具體實施例方式
1、配制誘導劑①誘導劑I90％DMEM+10％FBS+5.5×10-5β-巰基乙醇+1×10-6mol/L地塞米松+10mg/L胰島素+5×10-4mol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤。
②誘導劑II90％DMEM+10％FBS+5.5×10-5β-巰基乙醇+10mg/L胰島素。
2、雞胚原始生殖細胞的分離、培養與傳代采用單獨酶解離法在雞胚發育的第19期和第28期提取生殖腺中聚集的EPGCs，將提取出的細胞接種到已制備的飼養層上，用添加10％的胎牛血清、2％的雞血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/L β-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、10IU/ml鼠白血病抑制因子(mLIF)、5ng/ml人干細胞生長因子(hSCF)、10ng/ml堿性成纖維生長因子(bFGF)、0.04ng/ml人白細胞介素-11(hIL-11)，10ng/ml胰島素樣生長因子(hIGF)的高糖DMEM培養液培養。EPGCs培養5～6天，用EDTA-胰酶消化液把PGCs克隆和飼養層細胞一起消化成單個細胞，接種到新的培養瓶中培養，傳代時一同消化下來的飼養層細胞通過明膠差速貼壁法將其除去。將細胞傳至4代。
3、雞胚原始生殖細胞向脂肪細胞定向誘導分化雞胚原始生殖細胞在培養48小時后，將原有基礎培養基更換為誘導劑I，處理3天后，再更換為誘導劑II處理1天，如此循環3次后，用誘導劑II繼續處理，至誘導分化21天后行脂肪細胞油紅O染色。
4、脂肪細胞油紅O染色誘導后細胞用PBS洗滌3次，10％～15％的聚甲醛固定10～15分鐘，油紅O染色30分鐘，60％異丙醇稍洗去多余染液，蒸餾水洗，蘇木精淺染核15分鐘，1％鹽酸-酒精溶液稍分化，水漂洗10分鐘。
1)第4代EPGCs培養48小時后，在誘導劑I與誘導劑II的循環誘導作用下，能誘導產生75％～90％的脂肪細胞。
2)加入誘導劑后72小時，細胞中有小脂滴出現，主要集中于細胞核周圍。隨著誘導時間的延長，脂滴數量明顯增多，小脂滴逐漸聚集為大的脂泡，脂泡逐漸增大，形成典型的戒環樣結構(圖1a，1b)。
3)傳至4代的EPGCs成脂誘導21d后行脂肪細胞油紅O染色。顯微鏡下觀察，脂滴為橙紅色(圖2a，2b)。
權利要求
1.一種定向誘導雞胚原始生殖細胞向脂肪細胞分化的方法，其特征是利用脂肪細胞誘導劑對雞胚原始生殖細胞進行體外誘導分化培養，最終定向分化為脂肪細胞。
2.根據權利要求1所述的一種定向誘導雞胚原始生殖細胞向脂肪細胞分化的方法，其特征是所述的誘導劑包括由90％DMEM、10％FBS、5.5×10-5β-巰基乙醇、1×10-6mol/L地塞米松、10mg/L胰島素、5×10-4mol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤配制的誘導劑I和由90％DMEM、10％FBS、5.5×10-5β-巰基乙醇、10mg/L胰島素配制的誘導劑II。
3.根據權利要求1所述的一種定向誘導雞胚原始生殖細胞向脂肪細胞分化的方法，其特征是所述的誘導分化步驟包括1)雞胚原始生殖細胞的分離、培養與傳代采用單獨酶解離法在雞胚發育的第19期和第28期提取生殖腺中聚集的EPGCs，培養5～6天，用EDTA-胰酶消化液把EPGCs克隆消化成單個細胞，接種到新的培養瓶中培養，將細胞傳至4代；2)雞胚原始生殖細胞向脂肪細胞定向誘導分化雞胚原始生殖細胞在培養48小時后，將原有基礎培養基更換為誘導劑I，處理3天后，再更換為誘導劑II處理1天，如此循環3次后，用誘導劑II繼續處理，至誘導分化21天后行脂肪細胞油紅O染色；3)脂肪細胞油紅O染色誘導后細胞用PBS洗滌3次，10％～15％的聚甲醛固定10～15分鐘，油紅O染色30分鐘，60％異丙醇稍洗去多余染液，蒸餾水洗，蘇木精淺染核15分鐘，1％鹽酸-酒精溶液稍分化，水漂洗10分鐘。
4.根據權利要求3所述的一種定向誘導雞胚原始生殖細胞向脂肪細胞分化的方法，其特征是所述的原有基礎培養基含有10％的胎牛血清、2％的雞血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/Lβ-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、10IU/ml鼠白血病抑制因子、5ng/ml人干細胞生長因子、10ng/ml堿性成纖維生長因子、0.04ng/ml人白細胞介素-11，10ng/ml胰島素樣生長因子的高糖DMEM培養液。
全文摘要
一種定向誘導雞胚原始生殖細胞向脂肪細胞分化的方法，屬于治療性克隆、細胞工程、組織工程技術領域。本發明采用誘導劑I(90％DMEM+10％FBS+5.5×10
文檔編號C12N5/06GK1935988SQ20061009663
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月13日 優先權日2006年10月13日
發明者李碧春, 葛劍輝, 陳國宏, 秦潔, 吳信生, 趙文明, 徐琪, 孫國波, 戴建明, 孫鵬翔, 魏彩霞 申請人:揚州大學