專利名稱：一種用于豆粕發酵的益生菌菌劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵領域，具體涉及一種用于豆柏發酵的益生菌菌劑及其制備方法。
背景技術：
隨著飼料工業發展和生產高度集約化，對優質飼料蛋白的需求日趨增大，由于動物蛋白需求的膨脹和來源的快速減少，促使人們選用低價低廉、來源可靠的植物蛋白來替代之。 豆柏因具有蛋白質含量高、氨基酸組成平衡、供應量充足、價格適宜等優點而成為最好的選擇。但豆柏也有含多種抗營養因子、蛋白質消化率低、有豆腥味適口性差等缺陷。
發明內容
為了克服上述缺陷，本發明一種用于豆柏發酵的益生菌菌劑及其制備方法，該方法可降低發酵成本，提高生物量，制得具有發酵降解豆柏功能的益生菌菌劑。本發明首先提供了一種所述用于豆柏發酵的益生菌菌劑的制備方法，其具體步驟包括
(1)枯草芽孢桿菌液體發酵培養基
按重量百分數計為，黃豆粉或豆柏O. 5-5%、糖蜜O. 5-5%、檸檬酸鈉O. 05-0. 5%、 NaClO. 05-0. 5%，余量為水;pH5_9 ;在 121°C下高壓滅菌 30min ；
(2)枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌菌株活化后接種到細菌液體發酵培養基中，置于25-40°C、100-200r/ min條件下震蕩發酵10-50h，制得枯草芽孢桿菌種子液；所述細菌液體發酵培養基為牛肉膏-蛋白胨液體培養基；
(3)枯草芽孢桿菌發酵罐發酵
將枯草芽孢桿菌種子液接種到枯草芽孢桿菌液體發酵培養基中，接種量1-20% (體積)， 在溫度20-45°C下于發酵罐中發酵10-50h ；
(4)發酵完成后收集發酵液，進一步加工為液體或固體的益生菌菌劑。其中所述黃豆粉或豆柏預先過60目篩。步驟(2)所述的活化在細菌培養斜面上活化,活化時間10_48h ;細菌培養斜面的固體培養基配制如下:牛肉膏O. 5 %，NaCl O. 5%，蛋白胨1%，瓊脂2%，pH 7. 2。更優選地，所述枯草芽孢桿菌液體發酵培養基，按重量百分數計為，黃豆粉或豆柏 1-5%、糖蜜 1_5%、檸檬酸鈉 O. 05-0. l%、NaCl O. 3-0. 5%，余量為水；pH6. 5-7. 5 ;在 121°C 下高壓滅菌30min。更優選地，步驟(3)的發酵條件為接種量5-20% (體積)，在溫度30_35°C下于發酵罐中發酵15-50h。步驟(3)中控制發酵罐中溶氧量為10-50%。步驟(4)中將收集的發酵液直接瓶裝或袋裝成液體的益生菌菌劑；或將發酵液用沸石吸附后袋裝成固體的益生菌菌劑。
本發明另外提供了由上述制備方法制得的益生菌菌劑。本發明還提供了所述的益生菌菌劑在豆柏發酵中的應用。本發明將枯草芽孢桿菌subti I is)作為益生菌制成菌劑發酵豆柏，降解豆柏中的大分子蛋白，生成具高營養價值的小肽和游離氨基酸，大大提高蛋白質的消化率和轉化率，還可以消除豆柏中各種抗營養因子，提高豆柏飼料的利用率。另外，微生物發酵過程中可能產生的各種生物活性物質，如益生素、有機酸、抗菌素、異黃酮等，較大程度上改善了適口性，對動物具有一定的保健功能。本發明的顯著優點
1、常見枯草芽孢桿菌液體發酵所用的培養基大多以牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖等為主，生產成本較高，本發明選用的發酵培養基的主要成分為黃豆粉(或豆柏)、糖蜜，分別為農產品和工業制糖廢棄物，容易獲得且價格便宜，成本低；
2、發酵后的每毫升發酵液中的生物量達到100億左右，可用于降解豆柏中的大分子蛋白，生成具高營養價值的小肽和游離氨基酸，大大提高蛋白質的消化率和轉化率，還可以消除豆柏中各種抗營養因子，提高豆柏飼料的利用率，具有較好的應用價值。3、本發明的制備方法可降低發酵成本，簡化生產環節，提高效率。
具體實施例方式以下為本發明的幾個具體實施案例，進一步描述本發明，但是本發明不僅限于此。 其中采用的菌株CS27、CS21均出自文獻“李善仁等，三株芽孢桿菌作為益生菌的生物特性， 營養學報，2010年第32卷第I期”。實施例I
I、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
將IOg糖蜜，50g黃豆粉,Ig朽1檬酸鈉，5g氯化鈉投入水中攪拌均勻，并用水定容至1L, 調至pH7. 5,在121°C下高壓滅菌30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS27菌株(福建省農科院土壤肥料研究所農業微生物研究室分離并保存，保藏號CS27。中國科學院微生物研究所鑒定菌株CS27為-.Bacillus subtilis subsp. subtil is，枯草芽孢桿菌枯草亞種)在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml 的三角瓶細菌液體培養基中，置于37°C、180r/min條件下震蕩培養12h。3、枯草芽孢桿菌發酵
將CS27種子液接種到枯草芽孢桿菌發酵培養基中(接種量10%)，控制發酵罐中氧氣含量為50%，發酵溫度30°C，培養50h。4、發酵完成后收集發酵液。5、檢測
平板計數法測定生物量為IjSXIO'uf/mL 6、制成固體或液體益生菌菌劑產品。實施例2
I、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
將50g糖蜜，IOg豆柏(過60目篩),0. 5g朽1檬酸鈉,5g氯化鈉投入水中攪拌均勻，并用水定容至1L,調至pH6. 5,在121°C下高壓滅菌30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS27菌株(福建省農科院土壤肥料研究所農業微生物研究室保存) 在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三角瓶細菌液體培養基中，置于 37°C、180r/min條件下震蕩培養48h。3、枯草芽孢桿菌發酵
將CS27種子液接種到發酵培養基中(接種量20%)，控制發酵罐中氧氣含量為50%，發酵溫度30°C，培養50h。4、發酵完成后收集發酵液。5、檢測
平板計數法測定生物量為9. 21 X 109cuf/mL 6、制成固體或液體益生菌菌劑產品。實施例3
I、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
將25g糖蜜，25g豆柏(過60目篩)，O. 5g檸檬酸鈉，3g氯化鈉投入水中攪拌均勻，并用水定容至1L,調至pH7. O,在121°C下高壓滅菌30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS27菌株(福建省農科院土壤肥料研究所農業微生物研究室保存) 在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三角瓶細菌液體培養基中，置于 33°C、180r/min條件下震蕩培養24h。3、枯草芽孢桿菌發酵
將CS27種子液接種到發酵培養基中(接種量5%)，控制發酵罐中氧氣含量為10%，發酵溫度33。。，培養20h。4、發酵完成后收集發酵液。5、檢測
平板計數法測定生物量為7. 80 X 109cuf/mL
6、制成固體或液體益生菌菌劑產品。實施例4
I、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
將20g糖蜜，50g豆柏(過60目篩)，O. 5g檸檬酸鈉，5g氯化鈉投入水中攪拌均勻，并用水定容至1L,調至pH6. 5,在121°C下高壓滅菌30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS27菌株(福建省農科院土壤肥料研究所農業微生物研究室保存) 在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三角瓶細菌液體培養基中，置于 33°C、180r/min條件下震蕩培養24h。3、枯草芽孢桿菌發酵
將CS27種子液接種到發酵培養基中(接種量10%)，控制發酵罐中氧氣含量為30%，發酵溫度33°C，培養24h。4、發酵完成后收集發酵液。
5、檢測
平板計數法測定生物量為I. 13X1010cuf/mL 6、制成固體或液體益生菌菌劑產品。實施例5
I、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
將50g糖蜜,50g黃豆粉(過60目篩),0. 5g朽1檬酸鈉,5g氯化鈉投入水中攪拌均勻，并用水定容至1L,調至pH7. O,在121°C下高壓滅菌30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS27菌株(福建省農科院土壤肥料研究所農業微生物研究室分離并保存，保藏號CS27)在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三角瓶細菌液體培養基中，置于30°C、180r/min條件下震蕩培養24h。3、枯草芽孢桿菌發酵
將CS27種子液接種到發酵培養基中(接種量20%)，控制發酵罐中氧氣含量為40%，發酵溫度30。。，培養15h。4、發酵完成后收集發酵液。5、檢測
平板計數法測定生物量為8. 81 X 109cuf/mL 6、制成固體或液體益生菌菌劑產品。實施例6
I、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
將50g糖蜜,50g黃豆粉(過60目篩),0. 5g朽1檬酸鈉,5g氯化鈉投入水中攪拌均勻，并用水定容至1L,調至pH7. O,在121°C下高壓滅菌30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS21 (福建省農科院土壤肥料研究所農業微生物研究室分離并保存， 保藏號CS21)在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三角瓶細菌液體培養基中，置于35°C、180r/min條件下震蕩培養24h。3、枯草芽孢桿菌發酵
將CS21種子液接種到發酵培養基中(接種量20%)，控制發酵罐中氧氣含量為40%，發酵溫度35°C，培養24h。4、發酵完成后收集發酵液。5、檢測
平板計數法測定生物量為2. 78 X 109cuf/mL
6、制成固體或液體益生菌菌劑產品。應用實施例I
將實施例I中獲得的液體益生菌菌劑產品，接種豆柏進行固態發酵，豆柏與液體益生菌菌劑產品的體積比為I :1，發酵48h后烘干測定發酵產物中大豆肽含量。(I)酸溶蛋白質含量的測定稱取樣品2. OOg溶解，加入15%TCA(三氯乙酸)溶液 10mL，混合均勻，靜置5min。將溶液定量轉移，在4000r/min下離心IOmin后，取全部上清液，按凱氏定氮的方法測定上清液中可溶性蛋白質含量。
(2)游離氨基酸含量的測定利用茚三酮顯色法測定。(3)肽含量的測定由酸溶蛋白質測定值減去游離氨基酸測定值計算即得大豆肽的含量。由表I和表2可知，豆柏發酵后，消除了豆腥味，適口性好，且生成具高營養價值的小肽和游離氨基酸，大大提高蛋白質的消化率和轉化率，還可以消除豆柏中各種抗營養因子，提高豆柏飼料的利用率，具有較好的應用價值。
表I豆柏發酵前后成分比較
權利要求
1.一種用于豆柏發酵的益生菌菌劑的制備方法，其特征在于所述制備方法的具體步驟包括(1)枯草芽孢桿菌液體發酵培養基按重量百分數計為，黃豆粉或豆柏O. 5-5%、糖蜜O. 5-5%、檸檬酸鈉O. 05-0. 5%、 NaClO. 05-0. 5%，余量為水;pH5_9 ;在 121°C下高壓滅菌 30min ；(2)枯草芽孢桿菌種子液制備將枯草芽孢桿菌菌株活化后接種到細菌液體發酵培養基中，置于25-40°C、100-200r/ min條件下震蕩發酵10-50h，制得枯草芽孢桿菌種子液；所述細菌液體發酵培養基為牛肉膏-蛋白胨液體培養基；(3)枯草芽孢桿菌發酵罐發酵將枯草芽孢桿菌種子液接種到枯草芽孢桿菌液體發酵培養基中，接種量1-20% (體積)， 在溫度20-45°C下于發酵罐中發酵10-50h ；(4)發酵完成后收集發酵液，進一步加工為液體或固體的益生菌菌劑。
2.根據權利要求I所述的用于豆柏發酵的益生菌菌劑的制備方法，其特征在于所述黃豆粉或豆柏預先過60目篩。
3.根據權利要求I所述的用于豆柏發酵的益生菌菌劑的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的活化在細菌培養斜面上活化，活化時間10-48h;細菌培養斜面的固體培養基配制如下:牛肉膏O. 5 %，NaCl O. 5%，蛋白胨1%，瓊脂2%，pH 7. 2。
4.根據權利要求I所述的用于豆柏發酵的益生菌菌劑的制備方法，其特征在于所述枯草芽孢桿菌液體發酵培養基，按重量百分數計為，黃豆粉或豆柏1_5%、糖蜜1_5%、檸檬酸鈉 O. 05-0. 1%, NaCl O. 3-0. 5%，余量為水；pH6. 5-7. 5 ;在 121°C 下高壓滅菌 30min。
5.根據權利要求I所述的用于豆柏發酵的益生菌菌劑的制備方法，其特征在于步驟(3)的發酵條件為接種量5-20%(體積)，在溫度30-35°C下于發酵罐中發酵15_50h。
6.根據權利要求I所述的用于豆柏發酵的益生菌菌劑的制備方法，其特征在于步驟(3)中控制發酵罐中溶氧量為10-50%。
7.根據權利要求I所述的用于豆柏發酵的益生菌菌劑的制備方法，其特征在于步驟(4)中將收集的發酵液直接瓶裝或袋裝成液體的益生菌菌劑；或將發酵液用沸石吸附后袋裝成固體的益生菌菌劑。
8.—種如權利要求1-7中任一條所述制備方法制得的益生菌菌劑。
9.如權利要求8所述的益生菌菌劑在豆柏發酵中的應用。
全文摘要
本發明屬于微生物發酵領域，具體涉及一種用于豆粕發酵的益生菌菌劑及其制備方法。該方法可降低發酵成本，提高生物量，制得具有發酵降解豆粕功能的益生菌菌劑。通過將枯草芽孢桿菌種子液接種到枯草芽孢桿菌液體發酵培養基中發酵；發酵完成后收集發酵液，進一步加工為液體或固體的益生菌菌劑。本發明選用的發酵培養基的主要成分為黃豆粉(或豆粕)、糖蜜，分別為農產品和工業制糖廢棄物，容易獲得且價格便宜，成本低；發酵后的每毫升發酵液中的生物量達到100億左右，可用于降解豆粕中的大分子蛋白，還可以消除豆粕中各種抗營養因子，提高豆粕飼料的利用率，具有較好的應用價值。本發明的制備方法可降低發酵成本，簡化生產環節，提高效率。
文檔編號C12N1/20GK102604871SQ20121008301
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月27日 優先權日2012年3月27日
發明者吳大華, 林戎斌, 林新堅, 林陳強, 陳濟琛 申請人:福建省農業科學院土壤肥料研究所