專利名稱：無載體骨髓間充質干細胞膜片的制備方法
技術領域：
本發明專利屬于骨髓間充質干細胞培養領域，具體涉及到一種無載體骨髓間充質干細胞膜片的制備方法。
背景技術：
骨髓間充質干細胞位于骨髓的基質細胞系中，屬于多潛能成體干細胞，不僅能分 化為成骨細胞、軟骨細胞、成肌細胞、脂肪細胞等中胚層組織，而且能向神經細胞、肝細胞、胰島細胞等外胚層和內胚層組織分化。骨髓間充質干細胞由于具有易被分離獲取、高分裂增殖性、多組織分化潛能、免疫抑制性、便于自體移植、倫理的合法化等諸多優點，是當前干細胞研究領域的熱點之一。干細胞缺乏的疾病如眼部堿燒傷、皮膚熱燒傷等在臨床治療中相當棘手。干細胞的發現及干細胞移植的應用給這些患者帶來一線希望。而骨髓間充質干細胞因其多潛能性的特點成為治療此類疾病的主要種子細胞之一。如何將其移植于體表成為研究的熱點。目前，較成熟的方法是將其接種于脫細胞的羊膜上形成羊膜復合干細胞膜片。但是，羊膜并非完全透明的組織，因此透過羊膜觀察細胞狀態及細胞密度較困難，此外羊膜具有降解速度快、降解產物堆積的不良之處。目前，組織工程領域一直在尋找一種能夠使培養的干細胞完整脫落形成膜片用于臨床治療的材料。研究較多的是溫敏材料，希望通過溫度的改變使細胞脫離，雖然取得了一定的效果，但仍不成熟。乙二胺四乙酸(EDTA)是一種二價陽離子螯合劑，而細胞表面很多與培養皿或培養瓶結合的蛋白都是帶有鈣鎂離子的，因此，加入EDTA后可以螯合這些二價離子，使細胞和培養皿脫離。
發明內容
本發明的目的是提供一種無載體骨髓間充質干細胞膜片的制備方法，為臨床提供可供移植的單純細胞膜片。本發明制備方法如下首先，用貼壁法將骨髓間充質干細胞培養于培養皿中，隔天全量換干細胞培養基一次，待骨髓間充質干細胞完全融合后，再培養7天以上作為待用的骨髓間充質干細胞；然后，取待用的骨髓間充質干細胞，用不含二價陽離子的緩沖液沖洗2次以上，在培養皿中加入配置好的二價陽離子螯合劑，待骨髓間充質干細胞膜片脫離培養皿，去除培養皿中的螯合劑，即獲得無載體骨髓間充質干細胞膜片；最后，將無載體骨髓間充質干細胞膜片用干細胞培基沖洗2次以上，再加入干細胞培基保存。使用時用鑷子夾住制備好的骨髓間充質干細胞膜片一角或者將整個植片吸入槍頭內，置于需要移植的部位，加入少量生理鹽水或平衡鹽溶液，將其展平，然后進行縫合/粘合固定，用接觸鏡、半透膜或者人工合成材料等進行覆蓋，定期觀察被移植部位狀態。本發明是利用二價陽離子螯合劑螯合細胞表面與培養皿或培養瓶結合的蛋白上的鈣鎂離子使細胞和培養皿脫離的原理而實現的，相比以往的細胞膜片，本發明避免了載體代謝所產生的不良作用；該操作方法簡單、經濟、對細胞無害，得到純細胞膜片，細胞密度大；膜片上的細胞可以通過顯微鏡輕易觀察。
具體實施例方式本發明專利以BN大鼠的骨髓間充質干細胞為材料制成無載體的骨髓間充質干細胞膜片，具有骨髓間充質干細胞的特性，用于治療干細胞缺乏等疾病的移植治療。 本發明的制備方法一、骨髓間充質干細胞的培養無菌條件下取IOOg 150g的BN大鼠雙側股骨、胚骨入無菌皿中帶入無菌操作臺中。0. 9%氯化鈉注射液沖洗下肢骨，無菌組織剪刀將股骨、脛骨表面軟組織去除干凈，0. 9%氯化鈉注射液沖洗股骨、脛骨。20ml無菌注射器吸取IOml骨髓間充質干細胞培基(含10%胎牛血清FBS+90% DMED液體)反復沖洗股骨、脛骨的骨髓腔，沖洗液入培養皿中37°C,5% CO2飽和濕度條件下培養，培養48小時進行首次換液，以后每2天換液I次，去除未貼壁的細胞，待細胞融合后，用胰蛋白酶消化，按I : 3傳代培養，每2天換液I次，融合后，繼續傳代。該發明取用的是培養于35mm塑料培養皿中的P2代骨髓間充質干細胞，細胞融合后每日換液繼續培養七天以上備用。二、乙二胺四乙酸(EDTA)的配制將20mgEDTA溶于IOOml不含二價陽離子、PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或D-HankJ s液中制得0. 02% EDTA,濾膜孔徑為0. 22 y m的無菌濾器將上述EDTA液體過濾置于無菌容器中，用時用無菌的PBS或D-Hank’ s液稀釋，濃度范圍在0. 01 % 0. 004%之間均可。三、無載體骨髓間充質干細胞膜片的制備將備好的帶有骨髓間充質干細胞的培養皿從孵箱中取出，置于無菌操作臺，吸凈培養皿中的干細胞培基，將無菌PBS或D-Hank’ s液2ml加入培養皿中以洗去培養皿內殘余培基中的二價陽離子，吸凈，重復一次以上。加入稀釋好的乙二胺四乙酸(EDTA)液體100 L，培養皿周邊的骨髓間充質干細胞首先脫離培養皿，脫離的骨髓間充質干細胞與相鄰骨髓間充質干細胞相連形成片狀，骨髓間充質干細胞脫離范圍從周邊逐漸向中央發展，最終完全脫離，形成無載體骨髓間充質干細胞膜片，隨骨髓間充質干細胞的脫離，無載體骨髓間充質干細胞膜片逐漸縮小變厚。完全脫離時間為40秒 I分鐘，脫離后無載體骨髓間充質干細胞膜片面積大小為皿底的1/3，無載體骨髓間充質干細胞膜片所含細胞數量為IO6數量級。
權利要求
1.一種無載體骨髓間充質干細胞膜片的制備方法，其特征是 首先，用貼壁法將骨髓間充質干細胞培養于培養皿中，隔天全量換干細胞培養基一次，待骨髓間充質干細胞完全融合后，再培養7天以上作為待用的骨髓間充質干細胞； 然后，取待用的骨髓間充質干細胞，用不含二價陽離子的緩沖液沖洗2次以上，在培養皿中加入配置好的二價陽離子螯合劑，待骨髓間充質干細胞膜片脫離培養皿，去除培養皿中的螯合劑，即獲得無載體骨髓間充質干細胞膜片； 最后，將無載體骨髓間充質干細胞膜片用干細胞培基沖洗2次以上，再加入干細胞培基保存。
2.根據權利要求I所述的無載體骨髓間充質干細胞膜片的制備方法，其特征是所述不含二價陽離子的緩沖液為PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或D-Hank’ s液。
3.根據權利要求I所述的無載體骨髓間充質干細胞膜片的制備方法，其特征是所述配置好的二價陽離子螯合劑為濃度在0.01% 0.004%之間的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征是所述乙二胺四乙酸(EDTA)配置方法為將20mg乙二胺四乙酸(EDTA)溶于IOOmlPH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或D_Hank’ s液中配置成濃度為0. 02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，再將0. 02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液稀釋，獲得濃度范圍在0.01% 0. 004%之間的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液。
5.根據權利要求I所述的無載體骨髓間充質干細胞膜片的制備方法，其特征是加入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液后，培養皿周邊的骨髓間充質干細胞首先脫離培養皿，脫離的骨髓間充質干細胞與相鄰骨髓間充質干細胞相連形成片狀，骨髓間充質干細胞脫離范圍從周邊逐漸向中央發展，最終完全脫離，形成無載體骨髓間充質干細胞膜片，隨骨髓間充質干細胞的脫離，無載體骨髓間充質干細胞膜片逐漸縮小變厚。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征是35mm大小的培養皿完全脫離時間為40秒 I分鐘，脫離后無載體骨髓間充質干細胞膜片面積大小為皿底的1/3，無載體骨髓間充質干細胞膜片所含細胞數量為IO6數量級。
7.—種如權利要求I 6中任意一種方法制得的無載體骨髓間充質干細胞膜片，其特征是無載體骨髓間充質干細胞膜片的細胞密度大；可以有效避免因載體代謝所產生的不良作用；無載體骨髓間充質干細胞膜片經胰酶消化、培養后，其增殖能力、形態及活性無明顯改變。
全文摘要
一種無載體骨髓間充質干細胞膜片的制備方法。首先用貼壁法培養骨髓間充質干細胞于培養皿中，細胞融合后繼續培養7天以上，磷酸鹽緩沖液(PBS)或D-Hank’s液沖洗兩次，將濃度范圍在0.01％～0.004％之間的乙二胺四乙酸(EDTA)100μL加入皿中，細胞膜片逐漸從周圍向中央脫離培養皿，完全脫離后，吸除EDTA液，培基輕輕沖洗兩次上述膜片后，再次加入培基備用。相比以往有載體的細胞膜片，本發明制備的膜片細胞密度大；操作方法簡單、經濟；膜片上的細胞可輕易通過顯微鏡觀察；植入體內避免了載體代謝所產生的不良作用；膜片脫離后經胰酶消化、培養，細胞增殖能力、形態及活性無明顯改變。
文檔編號C12N5/0775GK102628028SQ20121009079
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月31日 優先權日2012年3月31日
發明者彭榮梅, 洪晶, 靳瑛 申請人:北京大學第三醫院