專利名稱：一種高純度納豆激酶的制備方法
一種高純度納豆激酶的制備方法本發明涉及食品工程中有關采用液體純種發酵生物技術領域，具體的說是一種高純度納豆激酶的制備法。納豆激酶是一種由納豆枯草桿菌產生的蛋白酶。最早從日本的傳統食品納豆中鑒別發現。經研究發現納豆激酶具有降解血栓的功能，而且口服有效，長期使用能降低中風、 血管梗塞的風險，可作為一種功能性的保健食品，在世界各地均有銷售。傳統的納豆激酶制備方法是制備納豆后直接干燥粉碎，灌入膠囊后獲得。但由于其含大豆成分如嘌呤和維生素K2，嘌呤長期服用可引起痛風，維生素K2有凝血作用，與納豆激酶的溶血栓功能相反。本專利描述了一種采用細菌純種培養、液體深層發酵，再用柱層析法精制以制備高純度納豆激酶的方法。國內申請02116667. 6中描述了一種利用枯草芽孢桿菌制備納豆激酶的方法，其采用了枯草芽孢桿菌，而枯草芽孢桿菌包括了大量種類；不同的菌種其制備方法、培養特征也不同，但是在該申請中無法概括出明確的對于不同菌種的制備方法，該申請中所用的高濃度乙醇和硫酸銨沉淀納豆激酶和使用干燥粉碎的方法，無法很好的保留納豆激酶的天然活性，收率低，并且分離過程中的有機溶劑和高濃度硫酸銨對環境污染和人體具有危害。另外，該申請所述的目的產物純度不明，雖然描述產物分子量為27730道爾頓，但沒有表述蛋白質序列，同時沒有直接描述其對纖維蛋白(血栓形成的主要物質之一)的纖溶活性；其中所述的目的產物的Pl值為8. 6，但是常規的納豆激酶蛋白質序列計算的pi值為6. 3，先前專利中沒有說明該原因，綜上所述，該申請所制備的產物是否為納豆激酶是不清晰的。國內申請200610168056是采用轉基因技術制備異源性的重組納豆激酶，所產生的納豆激酶為包涵體，須用其他轉基因手段得到可溶性蛋白，生產工藝復雜，最終產物為轉基因產品，是否能直接用于人體還不清楚；同時該專利也描述了使用大量硫酸銨的蛋白質沉淀法，這會降低收率并對納豆激酶的活性產生不利影響。本發明的目的是去除現有市場上粗制納豆激酶產品中含有的，從納豆中帶入的嘌呤和維生素K2等雜質，能更好地實現納豆激酶本身對心血管疾病的保護作用。為實現上述目的設計一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于由以下工藝步驟組成a、采用細菌劃線或涂布分離出單一的納豆枯草桿菌，并在固體和液體培養基上進行純種培養，所述的固體培養基質量濃度為蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖3. 5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂15g/L，pH 7. 0 ;所述的液體培養基質量濃度為大豆蛋白胨10g/L、葡萄糖 10g/L、牛肉膏5g/L、氯化鈉2g/L，pH 7. 0，培養溫度為35-42。。，b、采用液體深層發酵技術進行納豆枯草桿菌的發酵，發酵溫度為38 42V ;發酵時間為30-72hr，并通過震蕩、攪拌或通氣的方法供氧，C、發酵后通過離心或過濾的方法去除菌體，獲得澄清的含納豆激酶的培養液，d、上述培養液經過柱層析的方法去除其他雜質，納豆激酶從層析柱上洗脫，再經濃縮、干燥，然后用聚丙烯酰胺凝膠檢測，產物呈一 28kDa的條帶，用纖維平板檢測可見清晰的纖維溶解圈。 步驟(a)納豆枯草桿菌培養溫度最優為37 °C。步驟(b)納豆枯草桿菌發酵溫度最優為42 °C。納豆枯草桿菌發酵時間最優為48hr或5Ihr。柱層析方法為疏水層析或離子交換層析或先疏水層析再離子交換層析。所述的疏水層析采用疏水性樹脂。所述的疏水性樹脂是Phenyl瓊脂糖凝膠或Butyl瓊脂糖凝膠。所述的離子交換層析采用陽離子交換樹脂。所述的陽離子交換樹脂為CM瓊脂糖凝膠或SP瓊脂糖凝膠。所述的洗脫采用氯化鈉溶液梯度洗脫。本發明同現有技術相比具有以下優點(I)菌種的選擇及分離方法更好；菌種單純，安全性更好，所分離得到的納豆枯草桿菌(又名枯草納豆桿菌(Bacillus subtilis natto)是從食品納豆或用于制備納豆的微生物中純化而來，是納豆枯草芽孢桿菌，對人體無害；(2)培養方法不同，選擇了更合適的溫度和配方，在42度時，能夠得到更多的納豆激酶。(3)純化工藝更有效更安全，用疏水性樹脂直接吸附納豆激酶，能最大程度上保留納豆激酶的天然活性，收率高，并避免了有機溶劑和高濃度硫酸銨對環境污染和對人體的危害。(4)本發明所描述的納豆激酶是由納豆枯草桿菌所生成的天然產物，不是轉基因產物,生物安全性更好。圖I納豆枯草桿菌在固體培養基上的生長情況；圖2是用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測納豆激酶的蛋白質條帶；圖3是納豆激酶的纖維蛋白溶解活性實驗；圖4是納豆激酶的纖維蛋白溶解活性實驗；枯草納豆桿菌的純種培養和液體發酵法生產納豆桿菌取納豆制品或納豆菌產品用5ml無菌水混懸后涂布(或劃線)于固體培養基上， 在37°C培養12-16小時，直至有白色菌落長出(見圖I)。培養特征為菌落呈圓至橢圓型， 白到乳白色，直徑為2. 5_左右，表面略顯干燥，菌落邊緣清晰，菌落有一定粘性，在液體培養時粘性更大。能利用淀粉和葡萄糖。再挑取單菌落至5ml液體培養基中，在37°C旋轉震蕩(220rpm)培養6h ;再將上述培養物擴大培養至200ml液體培養基中，同樣條件培養42小時。得到的納豆激酶氨基酸序列表參見附表。納豆激酶的純化將所述的培養物在4，OOOg離心20分鐘，收集澄清上層液體；也可用1_0. 45 μ m的微孔濾膜過濾除去菌體，獲得澄清培養液。該液體中加入硫酸銨直至lmol/L的濃度，再次離心或過濾以去除不溶性的雜質。處理后的溶液通入50ml的疏水性的蛋白質分離填料 (如Phenyl或Butyl瓊脂糖凝膠)。用250ml的lmol/L硫酸銨溶液清洗,去除嘌呤和維生素K2等雜質，最后用IOOml水洗脫納豆激酶。也可再用離子交換填料(如CM-Sepharose) 在pH6. O的Tris-HCl的緩沖液中吸附上述分離所得納豆激酶，用O lmol/L范圍內NaCl 梯度洗脫納豆激酶。再經濃縮和干燥獲得納豆激酶成品。經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，主蛋白呈單一的28kDa的蛋白質條帶，見圖2(自左向右的樣品為蛋白質標準(由上向下依次為97· 4kDa、66. 2kDa、43kDa、31kDa、20kDa)，納豆枯草桿菌發酵原液，分離出的雜質蛋白，純化后的納豆激酶(28kDa)。納豆激酶的纖維蛋白溶解活性的測定取纖維蛋白原51. 2mg加入16ml O. lmol/L的磷酸納緩沖液pH 7. 4，混勻。再加入20ml O. 25%的瓊脂糖以及12. 5U的凝血酶，所有成分混合均勻，緩慢倒入無菌平皿中， 帶凝固待用。取10 μ I樣品穿刺加入上述平皿中，37°C培養16小時，納豆激酶可形成透明的纖維溶解圓圈，見附圖
3、圖4。(圖3左側的是I μ g的納豆激酶對纖維蛋白的溶解圈，右側是O. 5 μ g的。圖4左側的是2 μ g的納豆激酶對纖維蛋白的溶解圈，右側的是I μ g，圖 3，圖4下方的是Oyg的溶解圈)。
權利要求
1.一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于由以下工藝步驟組成a、采用細菌劃線或涂布分離出單一的納豆枯草桿菌，并在固體和液體培養基上進行純種培養，所述的固體培養基質量濃度為蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖3. 5g/L、氯化鈉 10g/L、瓊脂15g/L，pH 7. O ;所述的液體培養基質量濃度為大豆蛋白胨10g/L、葡萄糖IOg/ L、牛肉膏5g/L、氯化鈉2g/L，pH 7. O，培養溫度為35-42°C，b、采用液體深層發酵技術進行納豆枯草桿菌的發酵，發酵溫度為38 42°C;發酵時間為30-72hr，并通過震蕩、攪拌或通氣的方法供氧，C、發酵后通過離心或過濾的方法去除菌體，獲得澄清的含納豆激酶的培養液，d、上述培養液經過柱層析的方法去除其他雜質，納豆激酶從層析柱上洗脫，再經濃縮、 干燥，然后用聚丙烯酰胺凝膠檢測，產物呈一 28kDa的條帶，用纖維平板檢測可見清晰的纖維溶解圈。
2.如權I所述的一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于步驟(a)納豆枯草桿菌培養溫度為37°C。
3.如權I所述的一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于步驟(b)納豆枯草桿菌發酵溫度為42°C。
4.權I所述的一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于納豆枯草桿菌發酵時間為 48hr 或 5 Ihr ο
5.權I所述的一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于柱層析方法為疏水層析或離子交換層析或先疏水層析再離子交換層析。
6.如權5所述的一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于所述的疏水層析采用疏水性樹脂。
7.如權6所述的一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于所述的疏水性樹脂是 Phenyl瓊脂糖凝膠或Butyl瓊脂糖凝膠。
8.如權5所述的一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于所述的離子交換層析采用陽離子交換樹脂。
9.如權8所述的一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于所述的陽離子交換樹脂為 CM瓊脂糖凝膠或SP瓊脂糖凝膠。
10.如權I所述的一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于所述的洗脫采用氯化鈉溶液梯度洗脫。
全文摘要
本發明涉及食品工程中有關采用液體純種發酵生物技術領域，具體的說是一種高純度納豆激酶的制備法，采用細菌劃線或涂布分離出單一的納豆枯草桿菌(Bacillus subtilis natto)，并在固體和液體培養基上進行純種培養，采用液體深層發酵技術進行納豆枯草桿菌的發酵，發酵產物通過離心或過濾的方法去除菌體，獲得澄清的含納豆激酶的培養液，上述培養液經過柱層析的方法去除其他雜質，納豆激酶從層析柱上洗脫，再經濃縮、干燥得到產品，本發明同現有技術相比，去除了食品納豆中含的嘌呤和維生素K2；采用細菌純種培養、液體深層發酵，柱層析法得到了更高純度的納豆激酶。
文檔編號C12R1/125GK102604917SQ20121009746
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月1日 優先權日2012年4月1日
發明者范銘琦 申請人:范銘琦