專利名稱：一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法
技術領域：
本發明屬于大豆多肽提取加工領域，主要涉及一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法。
背景技術：
大豆肽具有良好的溶解性，在高濃度下黏度低，對熱穩定，在酸性條件下不產生沉淀，具有良好的吸濕性與保濕性，具有促進微生物生長代謝等特點，因此可用于生產酸性飲料、營養飲品、高蛋白食品、焙烤食品中，具有軟化食品、改善風味、提高產品品質等優點。采用蛋白酶直接在體外進行酶解反應制備肽產品是常用的制肽方法。優點主要是其最佳的溫度和pH溫和，反應時間及反應程度容易控制，可有效的控制酶解速度，可有效的分裂產生特定的肽。20世紀80年代后，隨著發酵工業和基因工程的迅猛發展，酶的制取和提純工藝日趨成熟，酶的產量和活性也大幅提高，生產成本也急劇降低，此外酶解蛋白質生產的活性肽安全性極高，受到了科研工作者得廣泛關注，因此近幾年報道的活性肽的制備方法多是酶解法。但是應用蛋白酶直接水解存在不能回收和成本高等缺陷因而在工業上的應用受到了限制。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，達到酶制劑可重復回收利用、降低成本、酶解過程連續、不需進行滅酶處理、實現連續化的生產的目的。本發明的目的是這樣實現的一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，所述的方法包括以下步驟(I)將海藻酸鈉溶液與堿性蛋白酶經磁力攪拌Ih混勻后，逐滴滴入氯化鈣溶液中，形成海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶，所述的海藻酸鈉按重量百分比計，質量分數2. 9-3.3%，氯化鈣質量分數2. 8-3.2% ； (2)將海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶放入填充床反應器中，所述的填充床反應器的填充柱的內徑為I. 5cm，柱高30cm;(3)利用蠕動泵將大豆分離蛋白溶液注入填充床反應器進行酶解，所述的大豆分離蛋白溶液質量分數為I %，PH為9-10，酶解溫度40-60°C，蠕動泵流量500-900ml/h ； (4)將酶解液離心，取上清液凍干，得到大豆多肽。本發明方法利用固定化酶與生物反應器相結合的方法酶解大豆分離蛋白，不僅保留了蛋白酶原有的優點，而且可反復使用，易與反應液分離，避免雜質混入并具有延長酶的使用期和保管期，具有反應條件溫和、能耗低、產物性能佳、生產成本低等優點，同時可獲得高質量的大豆肽。
圖I 一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法工藝路線圖；圖2海藻酸鈉濃度對酶活力回收率的影響；
圖3 pH對酶活力回收率的影響；圖4 CaCl2濃度對酶活力回收率的影響；圖5游離酶添加量對固定化酶活力和回收率的影響；圖6固定化時間對酶活力回收率的影響；圖7各影響因素對固定化酶活力回收率的降維分析；圖8 Y = f (X1, X2)的響應面； 圖9 Y = f (X1, X4)的響應面；圖10 Y = f (X1, X5)的響應面；圖11 Y = f (x3, X4)的響應面；圖12 pH對大豆分離蛋白水解度的影響；圖13水解溫度對大豆分離蛋白水解度的影響；圖14底物流速對大豆分離蛋白水解度的影響；圖15水解時間對大豆分離蛋白水解度的影響；圖16 Y = f (X1, X2)的響應面圖17 Y = f (X1, X3)的響應面；圖18 Y = f (x2, X3)的響應面；
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明。一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，所述的方法包括以下步驟(1)將海藻酸鈉溶液與堿性蛋白酶經磁力攪拌Ih混勻后，逐滴滴入氯化鈣溶液中，形成海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶，所述的海藻酸鈉按重量百分比計，質量分數2. 9-3.3%，氯化鈣質量分數2. 8-3.2% ；(2)將海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶放入填充床反應器中，所述的填充床反應器的填充柱的內徑為I. 5cm，柱高30cm ； (3)利用蠕動泵將大豆分離蛋白溶液注入填充床反應器進行酶解，所述的大豆分離蛋白溶液質量分數為I %，PH為9-10，酶解溫度40-60°C，蠕動泵流量500-900ml/h ; (4)將酶解液離心，取上清液凍干，得到大豆多肽。海藻酸鈉質量分數優選為3.1%。氯化鈣質量分數優選為3.0%。大豆分離蛋白溶液pH優選為9. 52，酶解溫度優選為50. 5 °C。螺動泵流量優選為730mL/h。實驗例I大豆蛋白酶解工藝條件最佳參數的篩選實驗I材料與方法I. I材料、試劑大豆分離蛋白哈高科protex 6L喊性蛋白酶丹麥novo公司I. 2主要儀器設備pHS-25型酸度計上海偉業儀器廠
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電熱恒溫水浴鍋余姚市東方電工儀器廠I. 3實驗方法I. 3. I固定化堿性蛋白酶的制備稱取一定質量的海藻酸鈉于一定pH的硼酸緩沖溶液中，配制成不同質量分數的海藻酸鈉溶液。量取一定量的protex 6L堿性蛋白酶,并用硼酸緩沖液稀釋。將一定質量分數的海藻酸鈉溶液按一定比例與protex 6L混合,充分攪拌均勻后,用螺動泵將混合液以5cm高度注入一定質量分數的CaCl2中形成凝膠珠，放入4°C冰箱中進一步硬化一段時間。得到顆粒均勻、形狀規整的海藻酸鈉微球。用無菌生理鹽水洗滌3 5次，以洗去表面CaCl20取出抽濾，并用濾紙吸干，稱總重％，同時測其酶活，剩余的于4°C冰箱保存備用。I. 3. 2單因素試驗設計以固定化酶酶活力回收率為評價指標，研究不同海藻酸鈉濃度，pH, CaCl2濃度，游離酶添加量，固定化時間對固定化酶效果的影響。I. 3. 3響應面試驗設計依據單因素實驗結果，以固定化酶活力回收率為指標，利用SAS軟件進行響應曲面設計，因素水平表見表I。表I響應面設計因素水平編碼表
權利要求
1.一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟(1)將海藻酸鈉溶液與堿性蛋白酶經磁力攪拌Ih混勻后，逐滴滴入氯化鈣溶液中，形成海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶，所述的海藻酸鈉按重量百分比計，質量分數2. 9-3.3%，氯化鈣質量分數2. 8-3.2% ； (2)將海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶放入填充床反應器中，所述的填充床反應器的填充柱的內徑為I. 5cm，柱高30cm ; (3)利用蠕動泵將大豆分離蛋白溶液注入填充床反應器進行酶解，所述的大豆分離蛋白溶液質量分數為1%，PH為9-10，酶解溫度40-60°C，蠕動泵流量500-900ml/h ； (4)將酶解液離心，取上清液凍干，得到大豆多肽。
2.根據權利要求I所述的一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，其特征在于海藻酸鈉質量分數優選為3. 1%。
3.按照權利要求I所述的一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，其特征在于氯化鈣質量分數優選為3.0%。
4.根據權利要求I所述的一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，其特征在于大豆分離蛋白溶液PH優選為9. 52，酶解溫度優選為50. 50C。
5.根據權利要求I所述的一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法，其特征在于蠕動泵流量優選為730mL/h。
全文摘要
一種固定化堿性蛋白酶制備大豆多肽的方法屬于大豆多肽提取技術；該方法將自制的固定化堿性蛋白酶加入到填充床反應器中，將大豆分離蛋白溶液注入填充床反應器進行酶解，經柱層析分離，凍干，得到大豆肽產品；本發明方法利用固定化酶與生物反應器相結合的方法酶解大豆分離蛋白，酶解過程連續，不需進行滅酶處理，實現了連續化的生產，具有反應條件溫和、能耗低、產物性能佳、生產成本低等優點，且固定化酶可重復利用，同時可獲得高質量的大豆肽。
文檔編號A23J3/34GK102613387SQ20121009704
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月27日 優先權日2012年3月27日
發明者李楊, 江連洲, 王梅, 王勝男, 齊寶坤 申請人:東北農業大學