專利名稱：多能性干細胞的非致瘤性增殖的制作方法
技術領域：
本發明關于人類多能性干細胞的增殖，尤其是關于人類胚胎干(hES)細胞的非致瘤性增殖。
背景技術：
人類胚胎干(hES)細胞是多能性的，且其具有分化為成人大多數細胞種類的強大能力。因此，該細胞是再生醫學的強大保證。該hES細胞令人向往的特殊性質包含不死性、多能性及無限制的未分化生長。傳統上，在滋養層(feeder layer)細胞(如小鼠胚胎纖維母細胞(MEFs))上培養多能性胚胎干細胞，以將該細胞維持于未分化狀態。該滋養層對于維持該等細胞是必要的；且通常在該滋養層上培養hES細胞直到需要分化時為止。不幸地，該小鼠滋養層維持細胞經常與hES細胞接觸而受到污染，雖對于小鼠滋養層維持細胞 不會造成多大功能上的影響，仍因此使小鼠滋養層細胞中培養的hES細胞不適用于臨床。已有報告指出，無滋養層培養的人類多能性干(hPS)細胞會很快死亡，或者分化為定型細胞(committed cells)的異源性群體(heterogeneous population)。許多報告已證實，嘗試使用無細胞的成分或是至少避免非人類的成分或細胞，來取代該滋養層或維持細胞。該取代物無法展現長期保證的結果，且這樣的嘗試已證實不足以維持細胞穩固(robust)且繼續增殖(propagation)。再者,該取代方式還展現,于無滋養層細胞的培養中，生長于培養基取代物中的hES細胞的確在hES細胞群落周圍形成已分化細胞，這是沒有實現最理想情況的標志。因此，需要開發使用不造成污染及形成畸胎瘤(teratomas)的另一種滋養層細胞源來培養hES細胞的替代方案。
發明內容
一實施方式中，本發明提供一種人類多能性干細胞的增殖方法，共同培養人類多能性干細胞與臍帶衍生干細胞。該臍帶衍生干細胞于培養基中形成滋養層，用于增殖該人類多能性干細胞，且將該人類多能性干細胞維持于未分化狀態。一實施方式中，該人類多能性干細胞的增殖為非致瘤性增殖，使得該人類多能性干細胞不會形成畸胎瘤。另一實施方式中，該人類臍帶衍生干細胞對于⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、CD166 及 HLA-ABC 為陽性，但對于 CDlq、CD3、CD34、CD45、CD56、CD117 及 HLA-DR 為陰性。該人類臍帶衍生干細胞具有成骨(osteogenic)或成脂(adipogenic)細胞分化能力。另一實施方式中，該臍帶衍生干細胞為人類臍帶間質干細胞(HUCMSCs)，且衍生自人類臍帶的華頓氏膠(Wharton’ s jelly)。另一實施方式中，該人類多能性干細胞對于堿性磷酸酶(AP)、Oct-4、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、NANOG, S0X2、NF-200、短尾突變型(brachyury)、ATBFl 或 MAP2 為陽性，且表達⑶F9、GATA4、HANDl或TUJ-I基因。又，于該人類多能性干細胞中MYC被降低調控。另一實施方式中，該人類多能性干細胞為人類胚胎干(hES)細胞，并形成類胚胎體(embryoid bodies)。另一實施方式中，本發明提供一種用于增殖人類多能性干細胞的培養基，其中，該培養基包含在培養基中形成滋養層的臍帶衍生干細胞。一實施方式中，培養基中的該臍帶衍生干細胞為人類臍帶間質干細胞(HUCMSCs)。另一實施方式中，本發明提供一種用于增殖人類多能性干細胞的試劑盒，其中，該試劑盒包括包含臍帶衍生干細胞的培養基，及其使用說明書。在一實施方式中，該試劑盒的培養基中的該臍帶衍生干細胞為人類臍帶間質干細胞(HUCMSCs)。
圖I顯示HUCMSC的形態、免疫表型(immunotyping)及體外分化。生長自組織培養物的華頓氏膠細胞為類纖維母細胞，且具有紡錘狀型態(圖1A)。流式細胞儀快速地區分HUCMSCs，顯示其對于 CDlq、CD3、CD34、CD45、CD56、CDl 17 及 HLA-DR 為陰性，而對于 CD10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、CD 166及HLA-ABC為陽性(圖1B)。待成脂細胞分化后，該細胞形成中性脂肪空泡，并含有復數對于油紅染料為陽性的脂肪小滴(圖1C，上)。于成骨細胞培養基中，該細胞延展而形成礦化基質，該礦化基質于三至四周的培養(cultivation)后被茜紅染料顯著染色(圖1C，下)。通過RT-PCR分析(以GAPDH作為陽性控制組)顯示對于成脂(PPARy)及成骨(骨橋蛋白，osteopontin)細胞分化具有專一性的基因表達(圖1D)。圖IA左的比例尺表示lOOOiim，而圖IA及圖IC右的比例尺表示100 y m。圖2顯示生長于HUCMC及MEF滋養層上的未分化人類ES細胞群落的形態。生長于HUCMC上的hES群落圖(圖2A)及生長于MEF上的hES群落圖(圖2B)。生長于HUCMC上的群落放大圖顯示典型的hES細胞形態具有高核質比(圖2C及圖2D)。圖2A及圖2B的比例尺表示lOOOiim，而圖2C及圖2D的比例尺表示100 y m。圖3顯示生長于HUCMC上的人類ES細胞表現型(phenotype)。使用專一性抗體的該hES群落的免疫染色(immnostaining)顯示堿性磷酸酶(圖3A)、Oct-4(圖3B)、SSEA-4 (圖3C)、TRA-l-60 (圖3D)、及TRA-1-81 (圖3E)的高度表達。于HUCMC上持續培養并繼代20次后，在ES細胞中觀察到代表性的正常染色體組型(46，XX)(圖3F)。比例尺表示 1000 Ii m。圖4顯示衍生自hES的類胚胎體(FB)的螢光免疫染色。相位差顯微鏡下顯示的類胚胎體(圖4A)，及使用NF-200抗體(圖4B)、短尾突變型抗體(圖4C) ,ATBFl (圖4D)、及MAP2 (圖4E)的免疫染色。比例尺表示1000 u m。圖5顯示不同滋養層上hES細胞的不同分化標記的表達。圖5A為通過RT-PCR手段說明對于生殖細胞(GDF9)、內胚層(GATA4)、中胚層(HANDl)及外胚層(TUJ-I)有專一性的基因表達。GAPDH作為控制組。圖5B說明圖5A所顯示的基因表達的半定量分析。圖6顯示當滋養層細胞由HUCMSC變為MEF的發展自hES細胞的畸胎瘤。圖6A顯示待NOD-SCID小鼠上的滋養層由HUCMSC變為MEF后，畸胎瘤(箭頭指示)快速發展自hES細胞。組織切片顯示黑色素細胞(melanocyte)的帶狀物,其具有似視網膜(retina-like)結構(圖6B)、似神經管(neurotube-1 ike)結構(圖6C-圖6E)、生牙上皮(odontogenicepithelium)(圖6F)、神經上皮(圖6G)、未成熟的軟骨(圖6H)及未成熟的鱗狀上皮(squamoid epithelium)(圖 61)。比例尺表不 100 U m。圖7顯示培養于HUCMSC及MEF上的hES細胞的多能性基因表達。圖7A說明培養于 HUCMSC(WJ)及 MEF 上的 hES 細胞(ES)的 0CT4、NANOG, S0X2 及 MYC 的 RT-PCR 分析，并以GAPDH作為內部控制組。圖7B說明圖7A所顯示的基因表達的半定量分析。圖7C說明通過西方點墨法分析測量C-MYC蛋白質。圖7D說明通過RT-PCR測量的MYC的mRNA等級，以該內部控制組的倍數顯示。FB表示類胚胎體。
具體實施例方式本文所提供的多種具體細節用以更詳細了解本發明。實施例該基因與其它分化標記基因的RT-PCR及定量RT-PCR 機械性地移除并以RLT裂解溶液(lysis buffer) (Qiagen)處理培養于HUCMSCs或MEF滋養層上的未分化或已分化的hES細胞。依照制造商說明書使用SuperScript IIIOne-Step RT-PCR試劑盒(invitrogen)合成第一條cDNA。表I顯示每對引物的序列、粘合溫度及產物大小。所有的PCR樣本通過含有0. 5 u g/ml溴化乙啶(Sigma)的2%瓊脂膠電泳分析。關于定量 RT-PCR(qRT-PCR),是在 ABIStepOne Plus 系統(Applied Biosystems)中使用 FastStart universal SYBR green master (ROX, Roche,USA)基因表達試驗，以 GAPDH作為內部控制組。引物的序列及粘合溫度顯示于表I。表I
權利要求
1.一種增殖人類多能性干細胞的方法，包括共同培養該人類多能性干細胞及臍帶衍生干細胞。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該臍帶衍生干細胞在培養基中形成滋養層，以增殖該人類多能性干細胞。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該臍帶衍生干細胞為人類臍帶間質干細胞。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，該人類臍帶間質干細胞衍生自人類臍帶的華頓氏膠。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該人類臍帶衍生干細胞用以將該人類多能性干細胞維持于未分化狀態。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該人類臍帶衍生干細胞對于CD10、CD13、 CD29、CD44、CD73、CD90、CD166 及 HLA-ABC 的一種或多種為陽性。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該人類臍帶衍生干細胞對于CDlq、CD3、⑶34、⑶45、⑶56、⑶117及HLA-DR的一種或多種為陰性。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該人類臍帶衍生干細胞具有成骨細胞分化能力或成脂細胞分化能力。
9.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細胞為人類胚胎干細胞。
10.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細胞對于堿性磷酸酶、Oct-4、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、NANOG、S0X2及分化標記的一種或多種為陽性，且其特征在于，該分化標記為NF-200、短尾突變型、ATBFl及MAP2的一種或多種。
11.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細胞表達一種或多種分化基因，且其特征在于，該分化基因為⑶F9、GATA4、HANDl或TUJ-I基因。
12.如權利要求I所述的方法，其特征在于，在該人類多能性干細胞中，MYC被降低調控。
13.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細胞的增殖無致瘤增殖性。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細胞的增殖不會形成畸胎瘤。
15.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該人類多能性干細胞形成類胚胎體。
16.一種用于增殖人類多能性干細胞的培養基，包括臍帶衍生干細胞。
17.如權利要求16所述的培養基，其特征在于，該臍帶衍生干細胞在該培養基中形成滋養層。
18.如權利要求16所述的培養基，其特征在于，該臍帶衍生干細胞為人類臍帶間質干細胞。
19.一種用于增殖人類胚胎干細胞的試劑盒，包括包含臍帶衍生干細胞的培養基，及其使用說明書。
20.如權利要求19所述的試劑盒，其特征在于，該臍帶衍生干細胞為人類臍帶間質干細胞。
全文摘要
本發明提供一種在包含人類臍帶間質干細胞(HUCMSCs)的培養基中增殖人類胚胎干(hES)細胞的方法，其中，該培養基作為滋養層。在培養基中，該人類胚胎干(hES)細胞維持胚胎干細胞的特性，如多能性、無限制的未分化增殖及正常的染色體組型。本發明還提供一種該人類胚胎干(hES)細胞的非致瘤性增殖方法，且該方法不會形成畸胎瘤。
文檔編號C12N5/0735GK102747032SQ20121011698
公開日2012年10月24日 申請日期2012年4月19日 優先權日2011年4月19日
發明者丁大清, 朱堂元 申請人:財團法人佛教慈濟綜合醫院