一種體外擴增腫瘤干細胞的方法
【專利摘要】本發明是一種體外擴增腫瘤干細胞的方法，即利用海藻酸鹽凝膠支架對腫瘤細胞進行體外三維培養，通過改變海藻酸鈉的分子量、古羅糖醛酸含量與甘露糖醛酸含量（GM）比、鈣離子濃度、鈣化時間等支架制備參數調控凝膠支架的剛度，用于模擬不同腫瘤組織微環境中細胞外基質的軟硬程度，以實現不同組織來源腫瘤干細胞的體外擴增。本發明操作簡單，成本低廉，性能可控，易于規模放大，是一種很好的將不同來源的腫瘤干細胞進行體外擴增的方法。
【專利說明】一種體外擴增腫瘤干細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及提供一種體外擴增腫瘤干細胞的方法，特別涉及一種基質剛度可控的海藻酸鹽凝膠支架的制備。
【背景技術】 [0002]腫瘤干細胞已被證實為惡性腫瘤轉移和復發的根本原因，其研究對于闡明腫瘤的發生機制、生物學行為以及為今后尋找靶向腫瘤干細胞的根治治療方案都具有十分重要的意義。然而腫瘤干細胞在腫瘤組織及腫瘤細胞系中含量很低，難以得到足夠量的純度高的腫瘤干細胞用于研究，這是當前腫瘤干細胞研究所面臨的障礙之一。
[0003]細胞微環境按其性能可分為生物化學因素和生物物理因素。基質剛度(substratestiffness)作為生物物理因素之一，近年來被證實與細胞生物學行為密切相關。體內實體組織表現出一系列的剛度，用彈性模量(E)來表示，例如腦組織為0.Ι-lkPa，肌肉組織為10kPa-15kPa，而骨組織為25_45kPa。對于干細胞，培養基質的剛度影響其未分化狀態:剛度為0.6kPa時，胚胎干細胞可長期維持在未分化狀態；適當的基質剛度(12kPa)促進骨骼肌干細胞的自我增殖。骨髓間充質干細胞(MSC細胞)的分化方向也受到基質剛度調節；當培養環境的剛度類似肌肉組織的剛度時，MSC細胞會分化成肌肉細胞；而周圍環境剛度降到和腦組織相似的時候，MSC細胞則會分化成神經細胞。對于腫瘤細胞，基質剛度則參與調解其增殖、轉移等生物學行為。在較硬的基質上，腫瘤細胞伸展，形成應力纖維和成熟的黏著斑，迅速轉移；在與正常組織相似硬度的基質上，腫瘤細胞呈圓形，失去轉移能力，增殖減緩。研究表明，基質剛度對腫瘤生物學行為的調節是通過細胞膜表面的跨膜蛋白受體integrin提高胞外信號調解激酶(ERK)活性和增加ROCK (Rho kinase)產生的收縮。有證據表明，腫瘤干細胞特性的維持有賴于特殊的腫瘤微環境，而該微環境中的生物物理因素一基質剛度是調控腫瘤干細胞生物學行為的重要因素。因此，不同組織來源的腫瘤干細胞其最適基質剛度是不同的。本發明利用的海藻酸鹽凝膠體系能夠構建出不同基質剛度即適合不同來源的腫瘤干細胞進行體外擴增，是一種普適性的腫瘤干細胞體外擴增體系。
[0004]目前腫瘤干細胞的體外培養主要由與滋養層細胞共培養或通過特殊的干細胞培養基來實現，雖然滋養層細胞分泌的某些細胞因子能夠在一定程度上達到維持腫瘤干細胞不分化的目的，但與體內腫瘤組織的三維生長方式不同，該方法中腫瘤干細胞呈現一種二維生長方式，失去了腫瘤干細胞的眾多特性。取而代之的是利用添加生長因子EGF和bFGF的干細胞培養基擴增腫瘤干細胞。然而，該培養基以及生長因子價格十分昂貴，不利于培養體系的放大。
【發明內容】
[0005]本發明的是一種體外擴增腫瘤干細胞的方法。
[0006]本發明采用的技術方案為:
[0007]一種體外擴增腫瘤干細胞的方法，[0008]I)確定所需體外擴增腫瘤干細胞于生物體內所處環境的基質剛度；
[0009]2)利用海藻酸鹽凝膠支架包埋所需體外擴增腫瘤細胞，使包埋后的凝膠支架的基質剛度為步驟I)所確定的腫瘤干細胞所處環境的基質剛度的90-110% ；
[0010]3)進行包埋后腫瘤細胞的體外三維培養，以實現腫瘤干細胞的體外擴增。
[0011 ] 即利用海藻酸鹽凝膠支架包埋腫瘤細胞，并進行體外三維培養(示意圖1 )，通過改變海藻酸鈉的分子量、GM比、濃度及形成凝膠所必需的二價陽離子濃度和作用時間等凝膠支架制備參數調控凝膠支架的基質剛度，以實現不同組織來源的腫瘤干細胞的體外擴增。
[0012]其特征在于:所述海藻酸鈉分子量范圍為100-1000kDa、濃度為0.5%_3%、G/M比范圍為0.2-0.7 ;并且海藻酸鈉包括使用多肽(如精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸，即RGD等)或有機化合物(如聚乙二醇等)進行修飾。
[0013]所述二價陽離子種類為鈣、鋇等陽離子，濃度范圍為IOmmol.L^l-SOOmmol.L_S作用時間為15-60分鐘；
[0014]所述凝膠支架為200微米至5毫米的凝膠微球以及其它形狀如立方體、片層狀等;
[0015]所述凝膠支架的基質剛度在IkPa-1OOkPa之間；
[0016]所述不同腫瘤組織來源的腫瘤細胞為肝癌、肺癌、頭頸部鱗癌、結腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、膠質瘤來源的一種；
[0017]所述構建不同基質剛度的凝膠支架可以通過改變海藻酸鈉的分子量、濃度、G/Μ比和二價陽離子濃度及作用時間來實現。
[0018]所述腫瘤干細胞包括肝癌、`肺癌、頭頸部鱗癌、結腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、膠質瘤干細胞中的一種。
[0019]所述體外三維培養為靜態或者動態條件下的細胞三維培養。
[0020]所述銳孔擠壓法為一種公知的技術，如靜電液滴法。
[0021]本發明具有如下優點:
[0022]1.操作簡單，成本低，本發明利用海藻酸鹽凝膠作為細胞三維培養的載體，容易制備，避免使用昂貴材料和工藝；
[0023]2.海藻酸鹽凝膠為其內部細胞提供了三維生長環境，且制備的凝膠其基質剛度具有可控性；
[0024]3.本發明不但在常規靜態培養下能實現對腫瘤干細胞的擴增，還可以應用到動態培養體系如轉瓶培養體系中，利于規模化放大；
[0025]4.應用范圍廣，本發明方法通過模擬不同來源腫瘤的微環境，能夠適合不同組織來源的腫瘤干細胞進行體外擴增，并可用于抗腫瘤藥物的篩選。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1為利用海藻酸鹽凝膠體外三維培養腫瘤細胞的示意圖。
[0027]圖2為利用不同基質剛度海藻酸鈣凝膠培養的舌鱗癌細胞:㈧海藻酸鈉濃度為
1.5% (w/v) ; (B)海藻酸鈉濃度為2.5% (w/v) ; (C)海藻酸鈉濃度為3% (w/v)0
[0028]圖3為不同基質剛度對腫瘤干細胞相關基因表達的影響。(A) 0ct3/4; (B)Nanog;(C)ABCG2:(D)CD44。[0029]圖4為濃度0.5% (w/v)的海藻酸鈉形成的凝膠培養的肝癌細胞。
[0030]圖5為不同濃度鈣離子形成海藻酸鈣凝膠培養的腫瘤細胞其0ct3/4基因的表達情況。【具體實施方式】
[0031]實施例1:擴增舌鱗癌干細胞
[0032]I)確定舌鱗癌干細胞于人體內所處環境的基質剛度為8_17kPa (Engler, A.J.，et al., Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.Cell, 2006.126(4):p.677-689.);
[0033]2)將舌鱗癌細胞分別與不同濃度1.5%、2.5%、3%(g/100ml)的海藻酸鈉(分子量200kDa，GM比0.4)溶液混合，調整細胞密度為IO6ceIls.mL—1，利用靜電液滴法滴入IOOmmol.L4CaCl2溶液中，室溫韓化30min,形成粒徑400_500um海藻酸韓凝膠。其凝膠支架的基質剛度為4kPa、10kPa、20kPa;
[0034]3)之后，用DMEM培養液洗滌3次，然后添加含有質量濃度10%胎牛血清的DMEM培養液，于37° C、5%C02、飽和濕度條件下培養，每2天更換培養液。培養15天后(圖2)，利用55mmol.L—1檸檬酸鈉溶解包埋有舌鱗癌細的海藻酸鈣凝膠，收獲內部類組織化細胞團，提RNA,分析0ct3/4、Nanog等干細胞自我更新相關基因表達(Schrader, J., et al., Matrixstiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy inhepatocellular carcinoma cells.Hepatologyj2011.53(4):p.1192-1205.)，
[0035]實驗結果見圖3。結果顯示，濃度為1%的海藻酸鈉形成的海藻酸鈣凝膠(ALG-BEADS)培養的舌鱗癌細胞中干細胞相關的基因表達最高。說明該彈性模量的海藻酸鈣凝膠適合舌鱗癌干細胞的體外擴增。
[0036]實施例2:擴增肝癌干細胞
[0037]I)確定肝癌干細胞于人體內所處環境的基質剛度為0.6-3kPa(YEH, ff.-C., Elastic modulus measurements of human liver and correlation withpathology.Ultrasound in Med.&Biol, 2002.28 (4):p.467-474.)；
[0038]2)將肝癌細胞與0.5%(g/100ml)的海藻酸鈉(分子量200kDa，GM比0.4)溶液混合，調整細胞密度為IO6ceIls.πι?Λ利用靜電液滴法滴入IOOmmol.[1CaCl2溶液中，室溫鈣化30min,形成粒徑300-400um海藻酸鈣凝膠。其凝膠支架的基質剛度為lkPa。
[0039]3)之后，用培養液洗滌3次，然后添加含有10%胎牛血清的DMEM培養液，于37°C、5%C02、飽和濕度條件下培養，每2天更換培養液。
[0040]培養一段15天后(圖4)，利用55mmol.1檸檬酸鈉溶解海藻酸鈣凝膠，收獲內部類組織化細胞團，提RNA，分析肝癌干細胞標記物在的表達情況。結果表明，肝癌干細胞標記物⑶90、⑶133表達均顯著上調。說明該彈性模量的海藻酸鈣凝膠適合肝癌干細胞的體外擴增。
[0041]實施例3:通過改變鈣離子濃度改變凝膠支架彈性模量
[0042]將肝癌細胞與0.5%(g/100ml)的海藻酸鈉(分子量430kDa，GM比0.4)溶液混合，調整細胞密度為IO6Cells.mL—1，利用靜電液滴法分別滴入25mmol.r50mmol.L'IOOmmol.L_1>200mmol.L1CaCl2溶液中，室溫|丐化30min,形成粒徑300-400um海藻酸鈣凝膠。之后，用培養液洗滌3次，然后添加含有10%胎牛血清的DMEM培養液，于37°C、5%C02、飽和濕度條件下培養，每2天更換培養液。
[0043]培養一段時間后，用55mmol.T1檸檬酸鈉溶解海藻酸鈣凝膠，收獲內部類組織化細胞團，提RNA，分析相關基因表達情況。結果表明，隨著鈣離子濃度增加，干細胞因子0ct3/4的表達上調，且當鈣離子濃度為200mM時，0ct3/4上調40多倍(圖5)。當海藻酸鈉質量濃度為0.5%，鈣離子濃度為200mM時形成海藻酸鈣凝膠的彈性模量與肝組織彈性模量最接近，因此最適合肝癌干細胞 的體外擴增。
【權利要求】
1.一種體外擴增腫瘤干細胞的方法，其特征在于: 1)確定所需體外擴增腫瘤干細胞于生物體內所處環境的基質剛度； 2)利用海藻酸鹽凝膠支架包埋所需體外擴增腫瘤細胞，使包埋后的凝膠支架的基質剛度為步驟I)所確定的腫瘤干細胞所處環境的基質剛度的90-110% ； 3)進行包埋后腫瘤細胞的體外三維培養，以實現腫瘤干細胞的體外擴增。
2.按照權利要求1所述的擴增腫瘤干細胞的方法，其特征在于: 利用海藻酸鹽凝膠支架包埋腫瘤細胞，并進行體外三維培養；通過改變海藻酸鈉分子量、GM比、濃度以及形成凝膠必需的陽離子濃度和反應時間等支架制備參數調控凝膠支架的基質剛度，模擬不同腫瘤組織的基質剛度，以實現腫瘤干細胞的體外擴增。
3.按照權利要求1所述的擴增腫瘤干細胞的方法，其特征在于: 所述腫瘤細胞為不同腫瘤組織來源的腫瘤細胞，它們為肝癌、肺癌、頭頸部鱗癌、結腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、膠質瘤來源的一種； 對應的，所述腫瘤干細胞為肝癌、肺癌、頭頸部鱗癌、結腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、膠質瘤來源的腫瘤干細胞的一種； 所述體外三維培養為靜態或者動態的細胞三維培養。
4.按照權利要求1所述擴增腫瘤干細胞的方法，其特征在于: 利用海藻酸鹽凝膠支架包埋所需體外擴增腫瘤細胞過程為:將腫瘤細胞與海藻酸鈉溶液均勻混合，利用銳孔擠壓·法將混合后的溶液噴射入含有二價陽離子的溶液中，作用一定時間后得到包埋有腫瘤細胞的海藻酸鹽球形凝膠支架； 或者采用直接將混合均勻的腫瘤細胞與海藻酸鈉溶液轉移到孔板中，加入含有二價陽離子的溶液，作用一定時間后，根據需要切割為所需形狀的海藻酸鹽凝膠支架； 腫瘤細胞于海藻酸鈉溶液中的密度為IO5-1O7ceIls -mr1 ;所述海藻酸鈉溶液的質量濃度為 0.5%-3% ； 所述二價陽離子種類為鈣或鋇離子，它們于溶液中的濃度為IOmmol ^dOOmmol作用時間為15-60分鐘。
5.按照權利要求4所述的擴增腫瘤干細胞的方法，其特征在于:所述海藻酸鈉分子量為 100-1000KDa、GM 比范圍為 0.2-0.7。
6.按照權利要求4或5所述的擴增腫瘤干細胞的方法，其特征在于:所述海藻酸鈉為使用多肽或有機化合物進行修飾后的海藻酸鈉。
7.按照權利要求4所述的擴增腫瘤干細胞的方法，其特征在于:權利要求4所獲得的包埋有腫瘤細胞的海藻酸鹽凝膠支架表面用聚賴氨酸或殼聚糖修飾，得到修飾的海藻酸鹽凝膠支架。
8.按照權利要求4或5所述的擴增腫瘤干細胞的方法，其特征在于:所述凝膠支架的基質剛度在1-1OOkPa之間。
9.按照權利要求4或7所述的擴增腫瘤干細胞的方法，其特征在于:所述海藻酸鹽凝膠支架粒徑為200微米至5毫米。
【文檔編號】C12N11/10GK103571792SQ201210259932
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月25日 優先權日:2012年7月25日
【發明者】馬小軍, 劉暢, 孫廣煒, 徐小溪, 劉洋, 于煒婷 申請人:中國科學院大連化學物理研究所