專利名稱：一種抗草甘膦EPSP合成酶GmEPSPS-2及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域，涉及一種抗草甘膦EPSP合成酶及其編碼基因與應用，特別涉及一種人工改造合成的抗草甘膦EPSP合成酶及其編碼基因GmEPSPS-2，以及含有該基因的表達載體及其在抗除草劑轉基因植物研制方面的應用。
背景技術：
草甘膦是一種內吸傳導非選擇性、廣譜滅生性除草劑，具有理化性質穩定、高效、低毒、低殘留、易被微生物分解，不破壞土壤環境等優點，已廣泛應用于農業生產中，成為目前世界上生產量最大的農藥品種。其相關作用機理是由于草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的類似物，因此草甘膦、莽草酸-3-磷酸、EPSP合成酶容易結合形成EPSP-S3P-草甘膦復合體(此復合體非常穩定)，阻止PEP與EPSP合成酶的結合，這樣草甘膦就競爭性抑制莽草酸途徑中5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，干擾生物體內芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，導致生物死亡。 植物可以通過轉化導入對草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而獲得抗草甘膦的能力。根癌農桿菌CP4、熒光假單胞菌G2和沙門氏菌CT7的EPSPS已經在植物中得到廣泛的驗證和應用。隨著抗除草劑基因克隆的發展，抗草甘膦轉基因作物也相繼問世并大面積推廣應用，這些轉基因作物具有如下優點(1)所用除草劑品種廣譜、選擇性強、對環境友好、使用方便，特別適用于少耕與免耕體系，加強了水分保持，大大減少了土壤流失，并形成了有機物質來鎖住土壤碳并減少二氧化碳排放；同時減少機械耕作，節約燃料能源；(2)減少除草劑總使用量，使防治雜草費用下降，有效地降低農業成本，增加農產品的經濟效益；解決了常規除草劑難以防治的特殊雜草問題，如稻田的野生稻、赤稻、寬葉臂形草、圓葉牽牛；小麥田的雀麥、莎草；大豆田的鴨趾草、純葉決明以及寄生雜草；(4)解決土壤長殘留性除草劑對后茬作物的傷害。轉基因作物所使用的草甘膦無土壤殘留，故對后茬作物十分安全。從1996年轉基因作物首次商業化至今，耐除草劑性狀始終是轉基因作物的主要性狀。在2011年，轉基因作物耐除草劑性狀被運用在了大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜以及苜蓿中，種植面積為9390萬公頃，占全球轉基因作物種植面積的59%，比占全球轉基因作物面積15%的抗蟲品種(2390萬公頃)高出很多，這其中大部分為抗草甘膦轉基因作物品種。因此近年來包括美國和中國在內的國家草甘膦產量急劇增加還與系列轉基因抗草甘膦品種的選育和大面積推廣有直接的關系。我國在轉基因草甘膦作物方面的研究已取得一定進展，但目前尚無轉抗草甘膦基因作物進入商品化階段的報道。中國發明專利03826892. 2公開的一種來源于熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)的抗草甘膦基因(EPSPS基因),但由于其來源于細菌,細菌密碼子偏好性與植物有較大差異，將來自細菌的EPSPS基因直接轉化植物，其表達效率較低，因此，本領域有必要對來自微生物的抗草甘膦基因進行人工改造，以保證抗草甘膦基因能夠在植物體內高效穩定表達。
發明內容
本發明的目的是提供抗草甘膦蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的蛋白質，名稱是GmEPSPS-2，是如下(a)或(b)或(C)(a)由序列表中序列I的第56-532位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(c)將(a)或(b)的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列I衍生的蛋白質。其中，(a)所限定的蛋白為GmEPSPS-2的成體蛋白，不含轉運肽序列；(b)所限定 的蛋白為5'端帶有擬南芥CTP2葉綠體轉運肽的GmEPSPS-2的中間體蛋白。上述(C)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(c)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變。序列表中序列I由532個氨基酸殘基組成。為了便于GmEPSPS-2蛋白的純化，可在由序列表中序列I的氨基酸殘基序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標簽。表標簽的序列
權利要求
1.蛋白質，是如下(a)或(b)或(c): Ca)由序列表中序列I的第56-532位所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (c)將(a)或(b)的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列I衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求I所述蛋白質的核酸分子。
3.根據權利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子是編碼權利要求I所述蛋白質的基因；所述基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子 1)編碼序列為序列表中序列2的第637-2070位核苷酸所示的DNA分子； 2)編碼序列為序列表中序列2的第472-2070位核苷酸所示的DNA分子； 3)序列表中序列2的第7-2070位核苷酸所示的DNA分子； 4)序列表中序列2所示的DNA分子； 5)在嚴格條件下與I)-4)中任一限定的DNA分子雜交且編碼權利要求I所述蛋白質的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為重組表達載體或重組克隆載體。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組表達載體中啟動所述基因轉錄的啟動子為35S啟動子或玉米Ubi-I啟動子。
7.權利要求I所述的蛋白質，或權利要求2或3所述的核酸分子，或權利要求4或5或6所述的重組表達載體、表達盒或重組菌在如下al)或a2)中的應用 al)調控植物或微生物抗草甘膦功能； a2)選育抗草甘膦植物或微生物品種。
8.一種培育抗草甘膦功能提高的轉基因植物的方法，包括將編碼權利要求I所述蛋白質的基因導入目的植物中的步驟；所述轉基因植物與所述目的植物相比，抗草甘膦功能提聞。
9.一種培育抗草甘膦功能提高的轉基因微生物的方法，包括將編碼權利要求I所述蛋白質的基因導入目的微生物中的步驟；所述轉基因微生物與所述目的微生物相比，抗草甘勝功能提聞。
10.根據權利要求7所述的應用，或權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述微生物為大腸桿菌。
全文摘要
本發明公開了一種抗草甘膦蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的蛋白質，是如下(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列1的第56-532位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(c)將(a)或(b)的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列1衍生的蛋白質。本發明所提供的GmEPSPS-2蛋白及其編碼基因對草甘膦除草劑具有顯著的抗性效果，實驗證明轉GmEPSPS-2基因煙草和轉GmEPSPS-2基因玉米在0.15%草甘膦作用下仍能正常生長，而未轉基因的煙草或玉米生長明顯受抑制，葉片出現發黃、枯萎。這表明GmEPSPS-2能夠在植物中穩定高效表達，進而用于生產抗草甘膦轉基因植物。
文檔編號C12N15/54GK102776158SQ201210196678
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月14日 優先權日2012年6月14日
發明者李新海, 楊小艷, 林清, 翁建峰, 謝樹章, 雷開榮 申請人:中國農業科學院作物科學研究所, 重慶市農業科學院