專利名稱：分離自土壤的高抗草甘膦epsp合酶及其編碼序列的制備和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及分離來自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的制備與用途，具體涉及從草甘膦污染土壤微生物群體DNA庫中分離的具有草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及其蛋白產物的制備與用途。
背景技術：
草甘膦(Glyphosate)為內吸傳導型、廣譜滅生性除草劑，其作用機制是通過抑制植物體內5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，阻斷植物體內芳香族氨基酸的 生物合成，導致植物死亡。應用化學誘變細菌產生的aroA突變體，抗藥性機理研究確證了 aroA基因是草甘膦作用靶標EPSP合酶的編碼基因。近年來包括美國和中國在內的國家，草甘膦產量急劇增加還與系列轉基因抗草甘膦作物品種的選育和大面積推廣有直接的關系。美國Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的編碼基因及其抗草甘膦轉基因植物等方面已申請了 100余份專利，獲得轉基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等系列作物品種，其中大豆等多種轉基因作物已進入商品化生產。抗草甘膦轉基因植物的研究開發對農業發展可起到巨大推進作用，因此，為選育新的高抗草甘膦的轉基因作物本領域迫切需要開發新的具有抗草甘膦用途的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶。
發明內容
本發明的目的是提供一種可提高植物草甘膦抗性的EPSP合酶及其編碼序列的制備和用途，本發明通過從草甘膦極端污染環境中采集土壤樣品，構建草甘膦污染土壤微生物群落水平DNA庫，分離獲得了一種EPSP合酶，并且通過實驗證實了它具有高抗草甘膦抗性，并且轉入植物后，可導致植物抗草甘膦抗性的提高。本發明通過如下技術方案實現
一種分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，用于提高植物對草甘膦的抗性。分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶為如下多肽，
(a)具有SEQID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b)將SEQID N0:2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。
分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶的酶活性為25. 57U/mg。分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，編碼所述高抗草甘膦EPSP合酶的多核苷酸序列選自下組(a)編碼上述EPSP合酶多肽的SEQ ID NO: I的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，所述編碼EPSP合酶多肽的SEQ ID N0:1的多核苷酸序列選自下組的一種
(a)具有SEQ ID NO: I中1-1335位的序列；
(b)具有SEQID NO: I中1-1338位的序列。
一種用于提高植物對草甘膦的抗性的載體，含有如上所述的多核苷酸。一種用于提高植物對草甘膦的抗性的宿主細胞，含有如上所述的載體。分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶的制備方法，(a)培養上述含有如權利要求7所述的多核苷酸的載體轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有活性的多肽。一種能與如上所述的高抗草甘膦EPSP合酶特異性結合的抗體。一種改變植物抗草甘膦抗性的方法，它包括步驟
(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有EPSP合酶DNA編碼序列，所述的EPSP合酶選自下組
(a)具有SEQID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b)將SEQID N0:2氨基酸序列經過一個到二十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；
(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(I)中的農桿菌接觸，從而使EPSP合酶DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；
(3)選擇出轉入EPSP合酶DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；
(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。在本發明中，術語“ EPSPS ”、“ EPSP合酶”、“ EPSP合成酶” “ EPSP多肽”或“ 5_烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶”可互換使用，都指具有5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合酶。如發明所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如發明所用，“分離的EPSP合酶或多肽”是指EPSP多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化EPSP合酶。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。 本發明還包括EPSP合酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然EPSP合酶相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。在本發明中，術語“EPSP多肽”指具有EPSP合酶活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。該術語還包括具有與EPSP合酶相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括EPSP合酶的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與EPSPS DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗EPSP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含EPSP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了 EPSP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有EPSP多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。發明還提供EPSP合酶或多肽的類似物。這些類似物與天然EPSP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到。在本發明中，“EPSP合酶保守性變異多肽”指與SEQ ID NO: 2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行氨基酸替換而產生。表I
夏￥的殘基I代表性的取代I優選的坂 T
Ala(A)Val; Leu; HeVal
Arg(R)Lys;Gin;AsnLys
Asn (N)Gln;His;Lys;ArgGln
Asp (D)GluGlu
Cys (C)SerSer
Gln (Q)AsnAsn
Glu(E)AspAsp
Gly(G)Pro;AlaAla
His (H)Asn;Gln;Lys;ArgArg
He (I)Leu; Val; Met; Ala; PheLeu
權利要求
1.一種分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，所述編碼序列包含SEQ ID NO: 1，其特征在于用于提高植物對草甘膦的抗性。
2.如權利要求I所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
3.如權利要求2所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶為如下多肽， (a)具有SEQID NO: 2氨基酸序列的多肽； (b)將SEQID NO:2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。
4.如權利要求3所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶的酶活性為25. 57U/mg。
5.如權利要求4所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶的夂值為0. 0443 ±0. 012。
6.如權利要求5所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶的&值為0. 746 ±0. 007。
7.如權利要求6所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于編碼所述高抗草甘膦EPSP合酶的多核苷酸序列選自下組(a)編碼上述EPSP合酶多肽的SEQ ID NO: I的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
8.如權利要求7所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于所述編碼EPSP合酶多肽的SEQ ID NO:l的多核苷酸序列選自下組的一種 (a)具有SEQ ID NO: I中1-1335位的序列； (b)具有SEQ ID NO: I中1-1338位的序列。
9.一種含有如權利要求8所述的多核苷酸的用于提高植物對草甘膦的抗性的載體。
10.一種含有如權利要求9所述的載體用于提高植物對草甘膦的抗性的宿主細胞。
全文摘要
本發明提供一種可提高植物草甘膦抗性的EPSP合酶及其編碼序列的制備和用途，本發明通過從草甘膦極端污染環境中采集土壤樣品，構建草甘膦污染土壤微生物群落水平DNA庫，分離獲得了一種EPSP合酶，并且通過實驗證實了它具有高抗草甘膦抗性，并且轉入植物后，可導致植物抗草甘膦抗性的提高。
文檔編號C12N15/82GK102776161SQ20121028770
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月14日 優先權日2012年8月14日
發明者何軍光, 劉英新, 吳濤, 張維, 徐京, 林敏 , 樓億圓, 燕永亮, 王偉, 王林輝, 陸偉, 陳明, 黃明春 申請人:中國農業科學院生物技術研究所, 浙江新安化工集團股份有限公司