專利名稱：一種魚類致病菌香魚假單胞菌的lamp檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及香魚假單胞菌的檢測技術，具體涉及一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
香魚假單胞菌最初由患出血癥香魚內臟分離，近年發現在浙江、福建能引起大黃魚內臟肉芽腫疾病。該致病菌可引起大黃魚活動異常、內臟肉芽腫，組織壞死等癥狀。如2010年3月和11月寧波象山爆發了大規模的大黃魚香魚假單胞菌病，疫情涵蓋各種規格大黃魚，同時致病菌可通過親魚傳遞至下一代幼魚中潛伏，大黃魚的死亡率達60%以上，給當地養殖業帶來巨大經濟損失。因此預先分析、檢測確定發病菌種就顯得尤為重要。目前檢測香魚假單胞菌感染的方法主要包括生理生化檢測、組織病理學觀察、顯微鏡檢以及PCR等生物技術診斷方法。但是這些傳統檢測方法不能夠區分香魚假單胞菌與假單胞菌屬中的其他細菌，如惡臭假單胞菌等，缺乏靈敏度和特異性。聚合酶鏈式反應(PCR)具有極高的靈敏度和特異性，已被廣泛應用于致病菌的診斷實踐，但其需要PCR儀等諸多精密儀器的配套使用，使其無法滿足現場和基層檢驗的需要。為有效控制大黃魚香魚假單胞菌病，需建立靈敏、特異、高效和簡便的檢測技術。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒，該LAMP檢測試劑盒具有高靈敏度、高特異性、適用于海水養殖場中大黃魚香魚假單胞菌病的現場快速檢測；應用該LAMP檢測試劑盒的檢測大黃魚細菌感染的方法具有操作簡單，對儀器要求簡單，結果易于觀察等優點，為香魚假單胞菌病的早期防治提供技術支持。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒，包括10 X ThermoPol反應緩沖液、濃度為IOOmM的MgSO4溶液、濃度為10mM的dNTP液、濃度為5M的甜菜堿溶液、濃度為8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / Β3引物溶液和雙蒸水，所述FIP / BIP引物溶液含有FIP引物和BIP引物，所述FIP 引物的核苷酸序列為GCGTTCTTGCTGGCGCAGGTCGATGTACTGGTCGAGCGT，所述BIP 引物的核苷酸序列為TGCCGCGTGCCGACTTTTGGCCAGGTCACCGG，所述FIP引物和所述BIP引物的濃度都為I. 6 2. 4 μ M，所述F3 / Β3引物溶液含有F3弓丨物和Β3引物，所述F3引物的核苷酸序列為TCTGTTCATGCCGATCAAGC，所述Β3引物的核苷酸序列為GCAGCTGCCCACTTGGT，所述F3引物和B3引物的濃度都為O. 4 O. 6 μ M。所述的LAMP檢測試劑盒的100 X 25 μ L反應體系配制方法如下10 X ThermoPol反應緩沖液250 μ L、濃度為IOOmM的MgSO4溶液50 μ L、濃度為10 mM的dNTP液300 μ L、濃度為8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液100 μ L、濃度為5Μ的Betaine溶液400 μ L、引物濃度都為1.6 2.4y]\^3FIP / BIP引物溶液50 μ L、濃度都為O. 4 O. 6 μ M的F3 / Β3引物溶液50 μ L，余量用雙蒸水補足。所述的ThermoPol反應緩沖液的終濃度配制方法如下200mMTris-Hcl, 100 mMKCl, 20 mM MgSO4,100 mM (NH4)2SO4,1. 0% TritonX-100，ρΗ8· 8。所述的LAMP檢測試劑盒還包括有陽性對照液和陰性對照液，所述的陽性對照液含有香魚假單胞菌陽性DNA，所述的陰性對照液為雙蒸水。一種利用魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒檢測大黃魚香魚假單胞菌病的方法，包括下述步驟 (O取被感染大黃魚黃豆大小內臟組織一塊，加入450 1的TE緩沖液，同時用醫用剪刀剪碎組織，室溫6000r/min洗滌離心2min，倒掉上清液，取沉淀物再加入所述TE緩沖液450 μ 1，濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液3 μ 1，質量百分濃度為20%的十二烷基硫酸鈉溶液20 μ I，混勻，于37°C首次溫浴30min，首次溫浴結束，加入濃度為5mol/L的NaCl溶液100 μ 1，溴化十六烷三甲基銨氯化鈉混合液80 μ 1，混勻，于65°C再次溫浴lOmin，得到菌體溫浴液；
(2)在步驟(I)得到的菌體溫浴液中加入等體積的氯仿異戊醇混合液，混勻，12000r/min離心5min,取上清液,所述氯仿異戍醇混合液中氯仿與異戍醇體積比為24:1 ；
(3)在步驟(2)得到的上清液中加入等體積的酚氯仿異戊醇混合液混勻，12000r/min離心5min，取上清液再次加入等體積的所述酚氯仿異戊醇混合液混勻，12000r/min離心5min，如此重復混勻、離心至無白色物質為止，得到去雜上清，所述酚氯仿異戊醇混合液中酚、氯仿與異戊醇的體積比為25:24:1 ；
(4)在步驟(3)得到的去雜上清中加入所述去雜上清兩倍體積的無水乙醇，室溫放置8 12min，然后在4°C，14000r/min離心20min，棄上清，沉淀用質量百分濃度為70%的乙醇洗滌兩次，然后在空氣中晾曬5 20min，再加入所述TE緩沖液20 μ 1，_20°C保存，得到樣品DNA模板；
(5)取樣品DNA模板Iμ 1，與所述魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒組成25 μ L反應體系10 X ThermPol緩沖液2. 5 μ L，dNTP溶液2. O μ L，Bst DNA聚合酶液l.OyL, MgSO4 溶液 O. 5 μ L，Betaine 溶液 4. O μ L, FIP / BIP 引物溶液 O. 5 μ L，F3 / Β3引物溶液O. 5μ L，樣品DNA模板I μ 1，余量用雙蒸水補足；60 65°C下反應，反應完畢，出現肉眼可見白色沉淀或反應液渾濁則該菌體為香魚假單胞菌；或反應完畢取4. Ομ I的反應液，用經溴化乙錠(EB)染色后的I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下分析擴增結果，顯示階梯狀的特異性條帶為陽性，無條帶為陰性。所述的TE緩沖液的pH 8. O,Tris-HCl濃度10mmol/L,乙二胺四乙酸濃度Immol/L0所述的溴化十六烷三甲基銨氯化鈉混合液中溴化十六烷三甲基銨的質量百分濃度為10%, NaCl的濃度為O. 7mol/L。與現有技術相比，本發明的優點在于魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒及檢測方法，包括反應緩沖液、MgSO4溶液、dNTP液、Bst DNA聚合酶液、Betaine溶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / B3引物溶液和雙蒸水，FIP引物的核苷酸序列為GCGTTCTTGCTGGCGCAGGTCGATGTACTGGTCGAGCGT, BIP 引物的核苷酸序列為 TGCCGCGTGCCGACTTTTGGCCAGGTCACCGG, F3引物的核苷酸序列為AAGTGCAAGT CATCAGCT, B3引物的核苷酸序列為GCAGCTGCCCACTTGGT ;該LAMP檢測試劑盒對魚類致病菌香魚假單胞菌具有高靈敏度、高特異性，適用于海水養殖場中大黃魚香魚假單胞菌病的快速檢測；用該LAMP檢測試劑盒檢測魚類致病菌香魚假單胞菌具有操作簡單，對儀器要求簡單，結果易于觀察等優點，為香魚假單胞菌病的早期防治提供技術支持。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。 實施例I
一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒，包括10XThermoPol反應緩沖液250 μ L、濃度為IOOmM的MgSO4溶液50 μ L、濃度為10 mM的dNTP液300 μ L、濃度為8 U /μ L的Bst DNA聚合酶液100 μ L、濃度為5Μ的Betaine溶液400 μ L、引物濃度都為I. 6 2· 4μ M的FIP / BIP引物溶液50yL、濃度都為O. 4 O. 6μΜ的F3 / Β3引物溶液50yL，余量用雙蒸水補足，FIP引物的核苷酸序列為GCGTTCTTGCTGGCGCAGGTCGATGTACTGGTCGAGCGΤ,ΒΙΡ引物的核苷酸序列為TGCCGCGTGCCGACTTTTGGCCAGGTCACCGG，F3引物的核苷酸序列為AAGTGCAAGT CATCAGCT, B3 引物的核苷酸序列為 GCAGCTGCCCACTTGGT，FIP 引物、BIP 引物、F3引物和B3引物是GENBANK，登陸號JN688867的保守管家基因rpoD基因特異性片段，用primer explorer 4軟件自動挑選及人工篩選(特異性和靈敏性試驗)后設計完成引物由上海生工合成。在此具體實施例中，ThermoPol反應緩沖液的終濃度配制方法如下200mMTris-HCl, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4,100 mM (NH4)2SO4,1. 0% TritonX-100, pH8. 8 ；LAMP檢測試劑盒還包括有陽性對照液和陰性對照液，所述的陽性對照液含有香魚假單胞菌陽性DNA，所述的陰性對照液為雙蒸水，用以對比、驗證檢測。實施例2
該LAMP檢測試劑盒的檢測方法，包括下述步驟
(1)取被感染大黃魚黃豆大小內臟組織一塊，加入450μ1的TE緩沖液(pH8.0，Tris-HCl濃度10mmol/L，EDTA濃度lmmol/L)，同時用醫用剪刀剪碎組織，室溫6000r/min洗滌離心2min，倒掉上清液，組織中再加入所述TE緩沖液450 μ 1，濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液3 μ I，質量百分濃度為20%的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液20 μ I，混勻，于37°C首次溫浴30min，首次溫浴結束，加入濃度為5mol/L的NaCl溶液100 μ 1，溴化十六烷三甲基銨氯化鈉混合液(CTAB濃度10%，NaCl濃度0. 7mol/L )80 μ 1，混勻，于65°C再次溫浴lOmin，得到菌體溫浴液；
(2)加入與該組織溫浴液等體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿與異戊醇體積比24:1)，混勻，12000r/min離心5min,取上清液；
(3)在上清液中加入與該上清液等體積的酚氯仿異戊醇混合液(酚、氯仿與異戊醇體積比25:24:1)混勻，12000r/min離心5min，離心所得上清繼續重復用該酚氯仿異戊醇混合液混勻，12000r/min離心5min，如此混勻、離心，經多次重復混勻、離心至無白色物質為止，得到去雜上清；去雜上清中加入該去雜上清兩倍體積的無水乙醇，室溫放置8 12min，然后在4°C，12000r/min離心20min，棄上清，沉淀用質量百分濃度為70%的乙醇洗滌兩次，然后在空氣中晾曬5 20min，再加入所述TE緩沖液20 1，_20°C保存，得到樣品DNA模板；取樣品DNA模板I. O μ 1，與魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒組成25 μ L反應體系:10 X ThermPol 緩沖液 2. 5 μ L, dNTP 溶液 3. O μ L, Bst DNA 聚合酶液 l.OyL, MgSO4 溶液 O. 5 μ L, Betaine 溶液 4. O μ L, FIP / BIP 引物溶液 O. 5 μ L , F3 / Β3 引物溶液 O. 5 μ L，余量用雙蒸水補足；60 65°C下反應，反應完畢，出現肉眼可見白色沉淀或反應液渾濁則該菌體為香魚假單胞菌；或反應完畢取4. O μ I的反應液,用經溴化乙錠(EB)染色后的I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下分析擴增結果，顯示階梯狀的特異性條帶為陽性，無條帶為陰性。實施例3
特異性和靈敏性試驗
取魚類致病菌香魚假單胞菌，同時以海水養殖常見細菌哈維弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、海豚鏈球菌、嗜水氣單胞菌及惡臭假單胞菌等致病菌為特異性樣本測試LAMP反應的特 異性，用實施例2相同的提取和檢測方法進行，對提取的DNA用紫外分光光度計測得提取的香魚假單胞菌基因組DNA濃度，并以此為母液將DNA梯度稀釋，每種濃度取I. O μ I為模板進行LAMP擴增。LAMP檢測結果香魚假單胞菌樣本顯示為陽性，其他樣本均為陰性，表明與其他海水養殖常見致病菌無交叉反應，說明本發明的試劑盒對魚類致病菌香魚假單胞菌特異。LAMP檢測香魚假單胞菌最低檢出量為10_6 ng/μ 1，說明本發明的試劑盒對魚類致病菌香魚假單胞菌靈敏。上述說明并非對本發明的限制，本發明也并不限于上述舉例。本技術領域的普通技術人員在本發明的實質范圍內，作出的變化、改型、添加或替換，也應屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括IOXThermoPol反應緩沖液、濃度為IOOmM的MgSO4溶液、濃度為10 mM的dNTP液、濃度為5M的甜菜堿溶液、濃度為8 U /uL的Bst DNA聚合酶液、FIP / BIP引物溶液、F3 /B3引物溶液和雙蒸水，所述FIP / BIP引物溶液含有FIP引物和BIP引物，所述FIP引物的核苷酸序列為GCGTTCTTGCTGGCGCAGGTCGATGTACTGGTCGAGCGT，所述BIP弓丨物的核苷酸序列為TGCCGCGTGCCGACTTTTGGCCAGGTCACCGG，所述FIP引物和所述BIP引物的濃度都為1.6 2.411|1，所述？3 / B3引物溶液含有F3引物和B3引物，所述F3引物的核苷酸序列為TCTGTTCATGCCGATCAAGC，所述 B3 引物的核苷酸序列為GCAGCTGCCCACTTGGT，所述 F3引物和B3引物的濃度都為0.4 0.6 PM。
2.根據權利要求I所述的一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的LAMP檢測試劑盒的100 X 25 u L反應體系配制方法如下10 X ThermoPol反應緩沖液250 u L、濃度為IOOmM的MgSO4溶液50 u L、濃度為10 mM的dNTP液300 u L、濃度為8 U / ii L的Bst DNA聚合酶液100 y L、濃度為5M的Betaine溶液400 y L、引物濃度都為I.6 2.4 ii M的FIP / BIP引物溶液50 iiL、濃度都為0.4 0.6 ii M的F3 / B3引物溶液50 iiL，余量用雙蒸水補足。
3.根據權利要求I所述的一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的ThermoPol反應緩沖液的終濃度配制方法如下200mMTris-Hcl，100 mM KCl,20mM MgSO4,100 mM (NH4)2SO4,1. 0% TritonX-100, pH8. 8。
4.根據權利要求I所述的一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的LAMP檢測試劑盒還包括有陽性對照液和陰性對照液，所述的陽性對照液含有香魚假單胞菌陽性DNA，所述的陰性對照液為雙蒸水。
5.利用權利要求I所述的魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒檢測大黃魚香魚假單胞菌病的方法，其特征在于包括下述步驟 (1)取被感染大黃魚黃豆大小內臟組織一塊，加入450Ul的TE緩沖液，同時用醫用剪刀剪碎組織，室溫6000r/min洗滌離心2min，倒掉上清液，取沉淀物再加入所述TE緩沖液450 u 1，濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液3 U 1，質量百分濃度為20%的十二烷基硫酸鈉溶液20 ill，混勻，于37°C首次溫浴30min，首次溫浴結束，加入濃度為5mol/L的NaCl溶液.100 u 1，溴化十六烷三甲基銨氯化鈉混合液80 u 1，混勻，于65°C再次溫浴lOmin，得到菌體溫浴液； (2)在步驟(I)得到的菌體溫浴液中加入等體積的氯仿異戊醇混合液，混勻，12000r/min離心5min,取上清液,所述氯仿異戍醇混合液中氯仿與異戍醇體積比為24:1 ； (3)在步驟(2)得到的上清液中加入等體積的酚氯仿異戊醇混合液混勻，12000r/min離心5min，取上清液再次加入等體積的所述酚氯仿異戊醇混合液混勻，12000r/min離心5min，如此重復混勻、離心至無白色物質為止，得到去雜上清，所述的酚氯仿異戊醇混合液中酚、氯仿與異戊醇的體積比為25:24:1 ； (4)在步驟(3)得到的去雜上清中加入所述去雜上清兩倍體積的無水乙醇，室溫放置8 12min，然后在4°C，14000r/min離心20min，棄上清，沉淀用質量百分濃度為70%的乙醇洗滌兩次，然后在空氣中晾曬5 20min，再加入所述TE緩沖液20 yl，_20°C保存，得到樣品DNA模板；(5)取樣品DNA模板I ii 1，與所述魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒組成25 ii L反應體系10 X ThermPol緩沖液2. 5 y L，dNTP溶液2. 0 y L，Bst DNA聚合酶液l.OuL, MgSO4 溶液 0. 5u L, Betaine 溶液 4. 0 u L, FIP / BIP 引物溶液 0. 5 u L , F3 / B3引物溶液0.5 ii L，樣品DNA模板I iil，余量用雙蒸水補足；60 65°C下反應，反應完畢，出現肉眼可見白色沉淀或反應液渾濁則該菌體為香魚假單胞菌；或反應完畢取4. OiU的反應液，用經溴化乙錠(EB)染色后的I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下分析擴增結果，顯示階梯狀的特異性條帶為陽性，無條帶為陰性。
6.根據權利要求5所述的一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測方法，其特征在于所述的TE緩沖液的pH 8. 0，Tris-HCl濃度10mmol/L，乙二胺四乙酸濃度lmmol/L。
7.根據權利要求5所述的一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測方法，其特征在于所述的溴化十六烷三甲基銨氯化鈉混合液中溴化十六烷三甲基銨的質量百分濃度為10%, NaCl 的濃度為 0. 7mol/L。
全文摘要
本發明公開了一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測試劑盒及其檢測方法，特點是包括10×ThermoPol反應緩沖液、濃度為100mM的MgSO4溶液、濃度為10mM的dNTP液、濃度為5M的甜菜堿溶液、濃度為8U/μL的BstDNA聚合酶液、FIP/BIP引物溶液、F3/B3引物溶液和雙蒸水，FIP引物序列如SEQIDNO.1所示，BIP引物序列如SEQIDNO.2所示，F3引物如SEQIDNO.3所示，B3引物序列如SEQIDNO.4所示，優點是具有高靈敏度、高特異性，適用于海水養殖場中大黃魚香魚假單胞菌病的快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102952884SQ201210466878
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者王國良, 張繼挺, 周濤 申請人:寧波大學