可在鑒別不同魚類的方法中進行應用的特異引物序列及鑒別不同魚類的dna分子標記方法
【專利摘要】本發明公開了可在鑒別不同魚類的DNA分子標記方法中進行應用的特異引物序列，包括上游引物和下游引物，用該特異引物序列鑒別不同魚類的DNA分子標記方法包括：先根據已知魚類的5SrDNA基因保守的編碼區序列設計特異引物；再提取待鑒別魚類材料的基因組；以該基因組DNA為模板，設計PCR反應體系擴增其5SrDNA基因，利用5SrDNA基因非轉錄間隔區的多態性通過PCR擴增反應、瓊脂糖凝膠電泳及DNA凝膠回收試劑盒純化后，獲得樣本5SrDNA基因的DNA片段模式；最后根據凝膠成像中的DNA片段模式與已知魚類進行比對，判斷出待鑒別魚類材料的種類。本發明的方法具有快速、準確、操作簡便等優點。
【專利說明】可在鑒別不同魚類的方法中進行應用的特異引物序列及鑒別不同魚類的DNA分子標記方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及利用分子遺傳標記來分析魚類的遺傳特性以及分子遺傳關系的方法，具體涉及用基于5S rDNA基因DNA條帶模式的DNA分子標記結合DNA測序來鑒定和分析不同魚類的方法。
【背景技術】
[0002]與形態生物學和細胞生物學方法相比，分子生物學技術在鑒定和分析個體或群體遺傳特性方面具有優勢。生物學家長久以來不斷尋找一種更快、更準確、更穩定的標記和鑒定不同動物的分子生物學方法。雖然全基因組測序可以提供有價值的遺傳信息，但對生物界所有物種測序是不現實的。所以，分子遺傳標記仍然是在個體水平或群體水平上研究遺傳多樣性及其變化規律的主要手段，并被廣泛應用于群體遺傳學、系統學、進化生物學等理論研究及保護生物學、動植物遺傳育種、疾病診斷等實踐領域。
[0003]目前，DNA分子標記主要有以下五種:(I)線粒體DNA (mtDNA)分子標記；(2)基于Southern雜交分子標記，如限制性片段長度多態性(Restriction Fragment LengthPolymorphism, RFLP),突光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)和單鏈構象多態性(Single-Strand Conformation Polymorphism, SSCP) ; (3)基于 PCR 的分子標記技術，如隨機擴增多態性 DNA (Random Amplification Polymorphic DNA, RAPD),擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)和單鏈構象多態-DNA聚合酶鏈式反應(Single-Strand Conformation Polymorphism-PoIymerase ChainReaction, SSCP-PCR) ； (4)基于重復序列的分子標記，如微衛星DNA和小衛星DNA ; (5)基于mRNA的分子標記，如逆轉錄PCR (Reverse Transcription-PCR, RT-PCR)和差異顯示逆轉錄 PCR (Differential Display Reverse Transcription-PCR, DDRT-PCR)。現有的分子標記方法普遍存在費用昂貴、穩定性差、重復性差、或者需要放射性標記等不足。
[0004]5S rDNA基因作為一個獨立的轉錄單位，在染色體上的位置較分散。5S rDNA編碼細胞質中5S rRNA，屬于真核生物中一類高度保守的串聯重復序列，重復單位長度為200bp~900bp，單倍體基因組中的拷貝數為1000~50000。在高等真核生物中，5S rDNA多基因家族是一類高度保守的串聯重復序列，重復單位長度為200bp~900bp，每個重復單位都是由一個編碼區(120bp)和之間的非轉錄間隔區(nontranscribed spacer, NTS)組成。由于5S rDNA基因編碼細胞質中的5S rRNA對生命活動很重要，其基因區的序列通常是高度保守的，因為其堿基的微小改變都可能帶來二級結構的變化，改變與核糖體蛋白的結合能力，從而進一步影響蛋白質的合成，并帶來致死突變。而NTS則由于不轉錄的原因，沒有明顯的生存篩選壓力，因此很容易通過遺傳的方式將逐代的變異累計下去，進而形成物種間的明顯差異。因此，5S rDNA基因的NTS多態性成為物種進化、種群分化和遺傳多樣性的一個合適標記。
[0005]目前，利用5SrDNA基因轉錄間隔區的遺傳多樣性進行分子進化和系統發育研究在植物研究中已有很多應用，但還一直沒有利用5S rDNA基因轉錄間隔區的遺傳多樣性進行不同魚類快速鑒別的報道。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種可在鑒別不同魚類的DNA分子標記方法中進行應用的特異引物序列，還相應提供一種快速、準確、操作簡便的用前述特異引物序列鑒別不同魚類的DNA分子標記方法。
[0007]為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為可在鑒別不同魚類的DNA分子標記方法中進行應用的特異引物序列，包括以下的上游引物和下游引物:
上游引物:5’ -GCCCGATCTCGTCTGATCTCG-3’ ；
下游引物:5’ -GCGCTCAGGTTGGTATGGCCG-3，。
[0008]作為一個總的技術構思，本發明還提供一種用上述特異引物序列鑒別不同魚類的DNA分子標記方法，包括以下步驟:
(1)根據已知魚類的5SrDNA基因保守的編碼區序列設計所述特異引物；
(2)提取待鑒別魚類材料樣本的基因組；
(3)以上述步驟(2)提取的基因組DNA為模板，設計PCR反應體系擴增其5SrDNA基因，利用5S rDNA基因非轉錄間隔區(nontranscribed spacer, NTS)的多態性通過PCR擴增反應、瓊脂糖凝膠電泳及DNA凝膠回收試劑盒純化后，獲得不同魚類待檢測樣本5S rDNA基因的DNA片段模式；
(4)根據凝膠成像中的DNA片段模式，并與已知魚類的DNA片段模式進行比對，分析判斷出待鑒別魚類材料的種類。
[0009]上述的DNA分子標記方法中，優選的，在上述步驟(4)后繼續通過對DNA片段模式進行克隆測序，獲得不同魚類待檢測樣本的特異5S rDNA基因序列；再根據擴增片段在數目和種類上的共同性和差異性，以及不同已知魚類特異的5S rDNA基因序列，鑒定出不同魚類待檢測樣本所屬的種類以及不同魚類之間的遺傳關系。
[0010]上述的DNA分子標記方法中，優選的，所述步驟(2)的具體操作方法包括:用注射器從各待鑒別魚類材料樣本的靜脈中取血或取部分鰭條；利用DNA提取試劑盒進行各待鑒別魚類材料樣本的基因組DNA的提取。
[0011]上述的DNA分子標記方法中，優選的，所述步驟(3)中PCR反應體系的總體積為25μ1,其中含 5 ~10 ng DNA, 1.5 ~2.0 mmol MgCl2,0.2 mmol dNTPs, 0.2 ~0.4 Mmol 正負引物，I Xbuffer 和 1.25unit TaqTMDNA 聚合酶。
[0012]上述的DNA分子標記方法中，優選的，所述步驟(3)中PCR擴增反應的程序為94°C預變性5min，94°C變性30 s，55°C~58°C退火30s，72°C延伸lmin，25~30個循環后接著720C IOmin。
[0013]與現有技術相比，本發明的優點在于:由于5S rDNA基因的編碼區具有保守性，轉錄間隔區具有變異性，本發明選擇5S rDNA基因為分子克隆的目標，根據其保守的編碼區設計特異引物，應用PCR、瓊脂糖凝膠電泳等方法在大量不同魚類樣本中獲得了在數目和大小上有差異的DNA片段。各樣本中特定數量和大小的5S rDNA基因DNA片段構成了該種魚類特定的DNA條帶模式，揭示了不同魚類的遺傳特性和遺傳關系。進一步優選結合DNA測序，本發明方法可以廣泛應用于快速準確地鑒定和分析不同魚類的遺傳特性和遺傳關系。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為第一組魚類材料樣品的5S rDNA基因擴增圖；其中M.1OObp分子梯度標記；1表示紅鯽；2表示團頭魴；3表示三倍體鯽魴；4表示四倍體鯽魴。
[0015]圖2為第二組魚類材料樣品的5S rDNA基因擴增圖；其中M.1OObp分子梯度標記；1表示大口鯰；2表示菱鲆；3表示烏鱧；4表示黃顙魚。
[0016]圖3為第三組魚類材料樣品的5S rDNA基因擴增圖；其中M.1OObp分子梯度標記；1表示海鰻；2表示泥鰍；3表示黃鱔；4表示長吻鮑。
[0017]圖4為第四組魚類材料樣品的5S rDNA基因擴增圖；其中M.1OObp分子梯度標記；1表示石斑魚；2表示鰱魚；3表示鳙魚；4表示鮭魚；5表示鰻鱺。
[0018]圖5為第五組魚類材料樣品的5S rDNA基因擴增圖；其中M.1OObp分子梯度標記；1表示神仙魚；2表示金魚；3表示鱖魚；4表示S盧魚。
[0019]圖6為第六組魚類材料樣品的5S rDNA基因擴增圖；其中M.1OObp分子梯度標記；1表示翹嘴舶；2表示草魚；3表示黃尾鲴；4表示鯉魚。
[0020]圖7為第七組魚類材料樣品的5S rDNA基因擴增圖；其中M.1OObp分子梯度標
記；1表示團頭鮮；2表示草魚；3表示二倍體草鮮；4表示三倍體草鮮。
【具體實施方式】
[0021]以下結合說明書附·圖和具體優選的實施例對本發明作進一步描述，但并不因此而限制本發明的保護范圍。
[0022]實施例:
參照已知其它魚類的5S rDNA基因的編碼區序列，用Primer Premier 5.0軟件和Jellyfish 1.4軟件設計一種可在鑒別不同魚類的DNA分子標記方法中進行應用的特異引物序列，由上海生工公司(簡稱上海Sangon)合成，所述特異引物序列如下:
上游引物:5 ’ -GCCCGATCTCGTCTGATCTCG-3，；
下游引物:5’ -GCGCTCAGGTTGGTATGGCCG-3，。
[0023]一種本發明的用上述特異引物序列鑒別不同魚類的DNA分子標記方法，包括以下步驟:
1.準備實驗材料。
[0024]神仙jtXPterophyllum\ 鯉 jtXCyprinuscarpio Ζ.)、黃尾鲴(JeflociFArisda vidi Bleeker )、翅嘴舍白(Erythrocul ter iIishaeformis Bleeker)、海 {Muraenesoxcinereus)> 日本獲 ii (.Anguilla japonica)、績 jtXsinipoorca chuatsi)、長吻脆ileiocassis longirostris) >MSf {Paralichthys olivaceus)>{Epinephelussp)>IA jt.1Lateolabrax japonicus.、、jhiOncorhynchus keta )、烏 Siichanna argus)>草 H.1Ctenopharyngodon idellus')、鏈 H.(Hypoph thalmi ch thys molitrix)、鋪魚{Hypoph thalmi ch thys nobi/is )、大口 It (5? lurus so I da to vi meri di onali s CXe/?)、黃顏魚{Pel teobagrus ful vi draco )、泥嫩(#i sgurnus Angui Ili cauda tus )、黃鱔(Monop terusalba )、金魚(Carassius aura tus aura tus )、團頭魚方(Megalobrama amblycephala )、會I 顧PiCarassius aura tus var ret/)、二倍體草鮮、三倍體草鮮(草魚(早)X團頭鮮(t ))，三倍體鯽魴和四倍體鯽魴(紅鯽(早)X團頭魴(色))，其中前面的23種為自然界魚類，后4種為人工制備的雜交魚。
[0025]2.基因組DNA的提取。
[0026]對于上述準備的不同種類的魚類材料，用一次性注射器從各魚類材料樣品的靜脈中取血(或部分鰭條);按照UNIQ-10柱式基因組DNA提取試劑盒(上海Sangon公司)進行各魚類材料樣品基因組DNA提取。提取的DNA用紫外分光光度計檢測其濃度，_20°C保存。
[0027]3.PCR擴增和克隆。
[0028]以上述步驟2提取的各魚類材料樣品的基因組DNA為模板，設計PCR體系擴增其5S rDNA基因，再利用5S rDNA基因非轉錄間隔區的多態性通過PCR、瓊脂糖凝膠電泳獲得各魚類材料樣品5S rDNA基因的DNA片段模式。PCR反應在GeneAmp? PCR System 2700熱循環儀(美國Applied Biosystems公司生產)上進行,每個擴增反應總體積為25μ1,其中I ~10 ng DNA, 1.5 ~2.0 mmol MgCl2,0.2 mmol dNTPs, 0.4MmoI 正負引物，I Xbuffer 和
1.25unit TaqTMDNA聚合酶(TaKaRa公司)。PCR反應程序為:94°C預變性5min，94°C變性30 s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，30個循環后接著72°C lOmin，最后在4°C保存。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠成像掃描儀拍照，目的產物片段使用UNIQ-1O柱式膠回收試劑盒(上海Sangon公司)純化，純化方法參照產品手冊進行。將回收的DNA片段克隆于載體PMD18-T (TakaRa公司)，連接反應及細菌轉化按pMD18_T載體試劑盒說明書進行操作。
[0029]4.測序和序列分析。
[0030]選取陽性克隆菌落，提取重組質粒PMD18-T，經過菌落PCR和酶切鑒定后，由上海Sangon公司對陽性克隆進行測序，采用Blast軟件進行核苷酸和氨基酸序列同源性比較，根據其與查詢序列的最高相似性而`命名所得克隆。
[0031]本實施例中各魚類材料樣品的5S rDNA基因擴增圖如圖1~圖7所示。圖1~圖7展示了多種不同魚類樣品擴增出的不同數量和大小的5S rDNA基因DNA片段，而每種魚類材料樣品的條帶模式都體現了其遺傳特征以及與其他魚類之間的遺傳關系。
[0032]圖1展示了第一組魚類材料樣品的5S rDNA基因條帶模式，包括鯉形目鯉科鯉亞科的紅鯽(I號樣品)、鯉形目鯉科舶亞科的團頭魴(2號樣品)、以及它們的雜交后代三倍體鯽鮮(3號樣品)和四倍體鯽鮮(4號樣品)。紅鯽(I號樣品)具有200bp、340bp和500bp左右的條帶，團頭魴(2號樣品)具有200bp和400bp左右條帶。因此，通過5S rDNA基因的DNA條帶分布模式就能將這兩種魚進行區分。三倍體鯽魴(3號樣品)具有200bp、340bp和500bp左右的條帶，四倍體鯽魴(4號樣品)具有200bp、340bp、400bp和500bp左右的條帶。因此，通過5S rDNA基因的DNA條帶分布模式就能將這兩種不同倍性的雜交魚進行區分。
[0033]圖2展示了第二組四種自然界魚類的5S rDNA基因條帶模式，包括鯰形目鯰科的大口鯰(I號樣品)、鰈形目鲆科菱鲆(2號樣品)、鱸形目鱧科烏鱧(3號樣品)和鯰形目鮑科黃顙魚(4號樣品)。南方大口 It (I號樣品)具有250bp和450bp左右的條帶,菱鲆(2號樣品)具有350bp的條帶，烏鱧(3號樣品)200pb、400bp和1000bp左右的條帶，黃顙魚(4號樣品)具有300bp和600bp左右的條帶。因此，通過5S rDNA基因的DNA條帶分布模式就能將這四種魚類進行區分。[0034]圖3展示了第三組四種自然界魚類的5S rDNA基因條帶模式，包括鰻鱺目海鰻科海鰻(I號樣品)、鯉形目鰍科泥鰍(2號樣品)、合鰓目合鰓科黃鱔(3號樣品)和鯰形目鰉科長吻鮑(4號樣品)。海鰻(I號樣品)具有400bp、800bp和1200bp左右的條帶，泥鰍(2號樣品)具有250bp和600bp左右的條帶，黃鱔(3號樣品)具有550bp左右的條帶，長吻鮑(4號樣品)具有400bp、450bp和800bp左右的條帶。因此，通過5S rDNA基因的DNA條帶分布模式就能將這四種魚類進行區分。
[0035]圖4展示了第四組五種自然界魚類的5S rDNA基因條帶模式，包括鱸形目鰭科石斑魚(I號樣品)、鯉形目鯉科鰱魚(2號樣品)、鯉形目鯉科鳙魚(3號樣品)、鮭形目鮭科鮭魚(4號樣品)、鰻鱺目鰻鱺科日本鰻鱺(5號樣品)。石斑魚(I號樣品)具有220bp、400bp和850bp左右的條帶，鰱魚(2號樣品)具有200bp和400bp左右的條帶，鳙魚(3號樣品)具有200bp和400bp左右的條帶，鮭魚(4號樣品)具有250bp、600bp和800bp左右的條帶，鰻鱺(5號樣品)具有200bp和600bp左右的條帶。通過5S rDNA基因條帶分布模式可以將四種不同科的魚類進行區分。鰱魚和鳙魚同屬鯉科，5S rDNA基因條帶模式很相似，但是通過對200bp的片段進行測序，發現鰱魚為180bp、鳙魚為184bp，因此通過測序能進一步區分這兩種不同魚類。
[0036]圖5展示了第五組四種自然界魚類的5S rDNA基因條帶模式，包括鱸形目麗魚科神仙魚(I號樣品)、鯉形目鯉科金魚(2號樣品)、鱸形目真鱸科鱖魚(3號樣品)、鱸形目河鱸科魚盧魚(4號樣品)。神仙魚(I號樣品)具有200bp和600bp左右的條帶,金魚(2號樣品)具有200bp、340bp和600bp左右的條帶，鱖魚(3號樣品)具有400bp和500bp左右的條帶，鱸魚(4號樣品)200bp、550bp和700bp左右的條帶。因此，通過5S rDNA基因的DNA條模式就能將這四種魚類進行區分。
[0037]圖6展示了第六組四種自然界魚類的5S rDNA基因條帶模式，包括鯉形目鯉科舶亞科翹嘴舶(I號樣品)、鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚(2號樣品)、鯉形目鯉科鲴亞科黃尾鲴(3號樣品)和鯉形目鯉科 亞科鯉魚(4號樣品)。它們同屬鯉科魚類，除了翹嘴舶具有3條帶以外，其它魚類都只有200bp和400bp左右的條帶。通過對200bp的條帶測序發現,草魚為180bp,黃尾鲴為188,鯉魚為203。因此,通過測序能進行區分。
[0038]圖7展示了第七組兩種親本及其雜交后代的5S rDNA基因條帶模式，包括團頭魴(I號樣品)、草魚(2號樣品)、二倍體草魴(3號樣品)和三倍體草魴(4號樣品)。兩種親本及其雜交后代均只有200bp和400bp左右的條帶。通過對200bp左右的條帶測序發現，團頭魴為188bp，草魚為180bp，二倍體草魴和三倍體草魴具有188bp和180bp兩條DNA序列。因此，通過序列比對我們能對雜交魚的親本來源進行鑒定。
[0039]由上可見，本實施例中根據已知魚類的5S rDNA基因保守的編碼區設計特異引物，并利用其非轉錄間隔區(nontranscribed spacer, NTS)的多態性,通過應用PCR、瓊脂糖凝膠電泳獲得動物樣本的5S rDNA基因DNA片段并進行了測序。結果表明，不同魚類的5SrDNA基因擴增產物在數目、大小以及DNA序列方面存在共同性和差異性，通過這些差異性和共同性可以對它們進行準確地區分并確定它們各自的遺傳特性，分析它們的遺傳關系。本發明基于5S rDNA基因DNA片段的數目、大小和種類的分子標記技術可以快速、準確、特異、敏感地確定不同魚類的分子遺傳特性并分析它們的分子遺傳關系。
【權利要求】
1.可在鑒別不同魚類的DNA分子標記方法中進行應用的特異引物序列，包括以下的上游引物和下游引物: 上游引物:5 ’ -GCCCGATCTCGTCTGATCTCG-3，； 下游引物:5’ -GCGCTCAGGTTGGTATGGCCG-3，。
2.一種用權利要求1所述特異引物序列鑒別不同魚類的DNA分子標記方法，包括以下步驟: (1)根據已知魚類的5SrDNA基因保守的編碼區序列設計所述特異引物； (2)提取待鑒別魚類材料樣本的基因組； (3)以上述步驟(2)提取的基因組DNA為模板，設計PCR反應體系擴增其5SrDNA基因，利用5S rDNA基因非轉錄間隔區的多態性通過PCR擴增反應、瓊脂糖凝膠電泳及DNA凝膠回收試劑盒純化后，獲得不同魚類待檢測樣本5S rDNA基因的DNA片段模式； (4)根據凝膠成像中的DNA片段模式，并與已知魚類的DNA片段模式進行比對，分析判斷出待鑒別魚類材料的種類。
3.根據權利要求2所述的DNA分子標記方法，其特征在于，在上述步驟(4)后繼續通過對DNA片段模式進行克隆測序，獲得不同魚類待檢測樣本的特異5S rDNA基因序列；再根據擴增片段在數目和種類上的共同性和差異性，以及不同已知魚類特異的5S rDNA基因序列，鑒定出不同魚類待檢測樣本所屬的種類以及不同魚類之間的遺傳關系。
4.根據權利 要求2或3所述的DNA分子標記方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體操作方法包括:用注射器從各待鑒別魚類材料樣本的靜脈中取血或取部分鰭條；利用DNA提取試劑盒進行各待鑒別魚類材料樣本的基因組DNA的提取。
5.根據權利要求2或3所述的DNA分子標記方法，其特征在于，所述步驟(3)中，PCR反應體系的總體積為 25μ1，其中含 5 ~10 ng DNA, 1.5 ~2.0 mmol MgCl2,0.2 mmol dNTPs,0.2 ~0.4 Mmol 正負引物，IXbuffer 和 1.25unit TaqTMDNA 聚合酶。
6.根據權利要求2或3所述的DNA分子標記方法，其特征在于，所述步驟(3)中，PCR擴增反應的程序為:941:預變性51^11，941:變性30 s，55°C~58°C退火30s，72°C延伸lmin，25~30個循環后接著72°C IOmin0
【文檔編號】C12N15/11GK103589801SQ201310583949
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】劉少軍, 覃欽博, 劉筠, 王余德, 王娟 申請人:湖南師范大學