專利名稱：一種脂肪酶及其重組表達工程菌株的制作方法
一種脂肪酶及其重組表達工程菌株技術領域
本發明屬于微生物工程技術領域，具體涉及一種脂肪酶基因及其重組表達工程菌株。
背景技術：
脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。脂肪酶基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈。它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質結構(Schmid等，1998)。
脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽，當油料種子發芽時，脂肪酶能與其他的酶協同發揮作用催化分解油脂類物質生成糖類，提供種子生根發芽所必需的養料和能量；動物體內含脂肪酶較多的是高等動物的胰臟和脂肪組織，在腸液中含有少量的脂肪酶，用于補充胰脂肪酶對脂肪消化的不足，在肉食動物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在動物體內，各類脂肪酶控制著消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代謝等過程；細菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更為豐富 (Pandey等)。由于微生物種類多、繁殖快、易發生遺傳變異，具有比動植物更廣的作用P H、 作用溫度范圍以及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業化大生產和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業用脂肪酶的重要來源，并且在理論研究方面也具有重要的意義。
脂肪酶具有廣泛的應用價值，已成為市場上的第三大工業用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應，廣泛應用于飼料添加劑、油脂加工、食品、醫藥、日化等工業。 脂肪酶的制備方法有提取法和微生物發酵法(王海燕等，2007，飼料工業)。但是提取法工藝復雜，成本高、效率低。因此，絕大多數脂肪酶均是通過微生物發酵而制備的。現有工業化生產脂肪酶的方法主要有二種一是誘變選育高產的脂肪酶的自然菌株，如解脂亞羅酵母(李珍等，2011，菌物學報；徐宇麗等，2011，微生物學報)；二是構建高產的工程菌(王小峰等，2011，生物工程雜志)。
構建基因工程菌是獲得高產、高酶活菌株的有效方法之一。目前國內市場上脂肪酶產品多由畢赤酵母異源表達而生產，其優點是發酵工藝成熟；缺點是甲醇誘導存在的安全隱患，還有畢赤酵母表達水平不高，表達水平一般低于7g/l。
木霉最常用的工業酶生產菌株之一，其中市場上的纖維素酶絕大多數是由木霉生產的。木霉屬于真核生物，具有翻譯后修飾系統，如內含子的剪切和糖基化等，因此可以直接表達真核來源的DNA序列、無需刪除內含子序列，簡化了分子操作。木霉規模化發酵系統優點是(1)分泌表達，便于發酵后處理；(2)深層液體發酵，便于規模化工業發酵；(3)高密度發酵，生產成本低,其最高表達水平可達40g/l。
因此，通過構建木霉工程菌，高效重組表達脂肪酶，有望大大降低發酵成本，從而降低脂肪酶對使用成本，促進脂肪酶在飼料添加劑領域的廣泛應用。發明內容
本發明的目的是提供一種脂肪酶及其重組表達工程菌株，即一種從黑曲霉中篩選的新的脂肪酶，以及用于重組表達該脂肪酶的里氏木霉工程菌，經里氏木霉表達后，該酶對胃液、胃蛋白酶和人工腸液的耐受性增強，可將其廣泛用作飼料添加劑，提高飼料利用率。
本發明首先提供一種新型的脂肪酶，其特征在于
(a)其氨基酸序列為SEQ ID NO: I的脂肪酶；
(b)在(a)中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。
用于編碼上述脂肪酶的基因，其中一種核苷酸序列是SEQ ID N0:2。
本發明另一方面提供了一種里氏木霉工程菌，用于表達上述的脂肪酶。
所述里氏木霉工程菌ZQ-KTrichoderma reesei ZQ-I),已于2012年11月27日保藏于“中國典型培養物保藏中心”，保藏編號是=CCTCC Ν0:Μ 2012483。
本發明的脂肪酶作為飼料添加劑的應用。
本發明的里氏木霉工程菌能高效表達黑曲霉來源的脂肪酶，20L罐發酵酶活高達 20000U/ml，表達水平超過10g/L。經里氏木霉宿主細胞的修飾，本發明的里氏木霉工程菌重組表達的脂肪酶對胃液、胃蛋白酶和人工腸液的耐受性很強，適合作為飼料添加劑使用。
圖I :本發明的里氏木霉工程菌發酵上清液SDS-PAGE電泳檢測分析圖。
圖2 :本發明重組表達脂肪酶的耐受性實驗。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明進行詳細的描述。
實施例I黑曲霉脂肪酶基因表達載體的構建
I. I提取黑曲霉總基因組DNA
將黑曲霉(Aspergillus niger)接種搖瓶培養基過夜培養,取適量菌體置于離心管中，13000 rpm離心5 min，棄上清；加入400 μ I抽提緩沖液(100 mM TrisHCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠、在珠打儀劇烈振蕩2 min左右；水浴鍋 65°C 水浴 20 min 后加入 200μ1 IOM NH4AC 冰浴 10 min ;13000rpm 離心 10 min 取上清，然后加入2倍體積的無水乙醇，-20°C放置30 min ； 13000 rpm離心10 min棄上清， 用70%乙醇洗滌2次；晾干，加入適量水溶解于_20°C保存。
I. 2基因克隆
以I. I中提取的基因組總DNA為模板，利用引物anl_F和anl_R (AAAGGTACCATGTTCTCTGGACGGTTTG 和 AGCTCTAGACTATAGCAGA CACTCTGAAATTGC)進行 PCR 擴增。PCR擴增條件為 95°C 4min ；94°C 30S，59°C 40S，72°C Imin 30 個循環；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物。
I. 3測序分析
將I. 2中回收的擴增產物連接到PMD18-T載體，獲得克隆載體pMD-ANL質粒并送至北京華大基因研究中心進行測序分析。測序結果，擴增產物的基因序列為SEQ ID NO: 2，其編碼氨基酸序列為SEQ ID NO: I。多個克隆的結果證明沒有發生擴增錯誤。
I. 4構建載體
提取質粒pMD-ANL，用NcoI和KpnI進行雙酶切，回收ANL片段；取2 μ I回收產物與NcoI和KpnI雙酶切pKDN-5載體連接過夜導入大腸桿菌DH5 α，獲得重組表達質粒 pKDN-ANL，測序結果證實插入的片段能夠編碼序列為SEQ ID NO: I的脂肪酶
實施例2轉化與篩選
I. I原生質體制備
接種里氏木霉(Trichoderma reesei )菌絲于PDA平板上生長4天；切取直徑約3 cm的菌落置于約60 mlYEG (O. 5%酵母粉、1%葡萄糖)的液體培養基中，30°C、200 rpm振蕩培養過夜；多層紗布過濾收集菌絲；將菌絲置于盛有10-20 ml裂解酶液(Sigma L1412)酶解2-3小時；取出酶解液，加入O. 7 M NaCl溶液，輕輕搖晃，倒于三層滅菌擦鏡紙過濾，收集濾液，3000 rpm，離心 10 min ;棄上清，加 10-20 ml STC液(20%蔗糖，50mM Tris-Cl, 50mM CaCl2)懸浮,3000 rpm,離心 10 min ;加適量 STC 懸浮分裝(150 μ /管，IO8 個/ml )。
I. 2轉化與驗證
取2Pg pKDN-ANL DNA加入到150μ1原生質體中，接著加入500μ1 25%PEG輕輕混勻，室溫靜置25 min ;然后分2_3次再加Iml 25%PEG，輕輕混勻，室溫靜置25min，把原生質體加到50 ml左右熔化后冷卻至45-55°C的上層半固體培養基(O. l%MgS04, 1%KH2P04,O.6%(NH4)2SO4, 1%葡萄糖，18. 3%山梨醇，O. 35%瓊脂糖)，輕輕混勻后倒入含IOOPg/ ml潮霉素下層基礎培養基平板(2%葡萄糖，O. 5% (NH4) 2S04, 1. 5%KH2P04, O. 06%MgS04,O.06%CaCl2，I. 5%瓊脂)，28°C黑暗培養數天至轉化子長出。
按照實施例I所述方法提取轉化子基因組DNA為模板，利用引物Hcds531-s 和 Hcds531-a (Hcds531-s ACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACT ；和 Hcds531_a: AGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATT )擴增潮霉素基因驗證轉化子。利用實施例I所述引物 anl-F和anl-R進行PCR擴增目的基因。PCR擴增條件為95°C 4min ；94°C 30S ；59°C 40S, 72°C Imin 30個循環；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物并進行測序分析，即經過上述兩個PCR反應選育和驗證陽性轉化子。將其中一株陽性轉化子命名為 Trichoderma reesei ZQ-1，并于2012年11月27日保藏于“中國典型培養物保藏中心”，保藏編號 CCTCC Ν0:Μ 2012483。
實施例3發酵驗證和酶學性質測定
將陽性轉化子Trichoderma reesei ZQ-I和出發菌株(陰性對照)分別接種于麗發酵培養基(I. 5% 葡萄糖，I. 7% 乳糖，2. 5% 玉米漿，O. 44% (NH4)2SO4,0. 09%MgS04, 2%KH2P04,O.04%CaCl2，0. 018% 吐溫-80，O. 018% 微量元素，O. 018% 聚丙二醇-2000)培養，28°C培養 48 小時，然后25°C培養48小時，取上清液進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖I所示，其中箭頭所指處為重組表達的脂肪酶，說明本發明構建的里氏木霉工程菌能重組表達黑曲霉的脂肪酶。
最適作用pH分析用pH值分別為3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. O的緩沖液進行稀釋測結果表明構建的工程菌重組表達的脂肪酶的最適作用pH為5. O。
最適作用溫度分析分別在30°C、35°C、40°C、45°C、50°C，pH7. 5條件下測定酶活， 以最高酶活為100%，計算相對酶活，做溫度-相對酶活曲線。結果表明，本發明構建的工程菌重組表達的脂肪酶的最適作用溫度為30°C。
實施例4重組表達脂肪酶的耐受性實驗
(I)胃液、胃蛋白酶耐受性實驗
用pH5. 5的緩沖液稀釋T. reesei ZQ-I的發酵上清液，調節pH至2. O ;取上述上清液各8 ml，分別加入到2ml胃液和2ml胃蛋白酶(5%)中；37°C處理2 h，測定溶液中殘余的脂肪酶酶活，以未處理的溶液中脂肪酶酶活為100%。結果顯示經上述胃液處理后，脂肪酶的殘余酶活為60. 4% ;經上述胃蛋白酶處理后，脂肪酶的殘余酶活為66. 8%。
(2) pH6. 8、胰蛋白酶耐受性實驗
用ρΗ5· 5的緩沖液稀釋Τ. reesei ZQ-1的發酵上清液，調節ρΗ6· 8 ;分別用ρΗ6· 8 的緩沖液和胰蛋白酶各稀釋5倍，37°C處理6 h，測定溶液中殘余的脂肪酶酶活，以未處理的溶液中脂肪酶酶活為100%。結果顯示經pH6. 8的緩沖液處理后，殘余酶活約為62. 6% ； 胰蛋白酶處理后的殘余酶活為9. 8%。
上述結果表明，本發明構建的里氏木霉工程菌重組表達的脂肪酶對胃液、胃蛋白酶和人工腸液具有很強的耐受性，有望開發成飼料添加劑。
實施例5脂肪酶產品的制備
將上述工程菌T. reesei ZQ-I接種于搖瓶種子培養基(葡萄糖10_30g/L, 土豆 100-200g/L)，30°C，200rpm搖床培養48h之后，將發酵液轉入I噸種子罐(培養基為葡萄糖20-50g/L，硫酸銨10-30g/L，硫酸鎂5-10g/L，磷酸二氫鉀15_30g/L)，溫度控制在 25土1°C，pH值5. 0±0. 2，在種子罐培養48h之后，將種子液轉入30噸發酵罐(培養基為 葡萄糖 30-50g/L,乳糖 2. 0-10 g/L，玉米漿 20_50g/L，硫酸銨 10_30g/L，硫酸鎂 5-10g/L， 磷酸二氫鉀15-30g/L)，溫度控制在25±1°C，pH值控制在5. 0±0. 2，在發酵罐培養IOh到 15h之后，開始補加乳糖誘導菌體產酶，發酵時間約為200h到230h。發酵結束之后，將發酵液放入40噸儲罐，按照發酵液體積加入O. 5-1. 0%的硅藻土和O. 1-0. 5%的珍珠巖。攪拌混勻之后，靜置8h后，采用板框過濾。采用以下步驟分別制備液體酶制劑或固體酶制劑(I) 通過過濾獲得澄清的濾液進行超濾，溫度控制在15°C ;最后在超濾濃縮液加入添加保護劑 (16%山梨醇，3%氯化鈉)，防腐劑(山梨酸鉀O. 12%，苯甲酸鈉O. 17%)獲得液體酶制劑成品；(2)將超濾濃縮后的濾液和載體(淀粉)混合均勻，采用噴霧干燥方法將其噴干即得到固體酶制劑產品。
實施例6重組表達的脂肪酶對肉雞生產性能的影響實驗
I.材料與方法
I. I試驗動物與分組
六和種雞場提供的羅斯肉雛雞300只，隨機分為3個處理，每個處理10個重復，每個重復10只肉雞。具體分組設計見表I。
表I試驗分組設計
權利要求
1.一種脂肪酶，其特征在于所述的脂肪酶 Ca)其氨基酸序列為SEQ ID NO: I ；(b)在(a)中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。
2.用于編碼權利要求I所述的脂肪酶的基因，其核苷酸序列為SEQID N0:2。
3.—種里氏木霉工程菌，所述的工程菌用于表達權利要求I所述的脂肪酶。
4.權利要求3所述的里氏木霉工程菌，其保藏編號為CCTCCΝ0:Μ 2012483。
5.權利要求I所述的脂肪酶作為飼料添加劑的應用。
全文摘要
本發明提供了一種重組表達脂肪酶的工程菌株。本發明將從黑曲霉中克隆得到的脂肪酶基因轉入里氏木霉中，構建了里氏木霉工程菌，保藏號為CCTCC NO:M2012483。經重組表達的脂肪酶最適作用pH為5.0，最適作用溫度30℃，且對胃液、胃蛋白酶和人工腸液的耐受性增強。本發明的脂肪酶能顯著提高飼料中油脂類物質的利用率，從而能夠顯著減少飼料中油脂的添加，從而降低飼料成本。
文檔編號C12N15/55GK102978181SQ201210497039
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年11月29日
發明者黃亦鈞, 張青, 徐娟, 許麗紅, 王華明, 吳秀秀 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司