一種膽鹽水解酶突變體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種膽鹽水解酶突變體及其應用，屬于基因工程【技術領域】。本發明通過對膽鹽水解酶氨基酸序列比對分析和3-D結構的同源模擬及疊加分析，確定膽鹽水解酶底物特異性氨基酸突變位點，利用定點突變技術將底物特異性氨基酸突變為非極性氨基酸，將突變體導入宿主菌，獲得突變菌株。突變體所產膽鹽水解酶均為活性酶，且與野生型相比，突變體對甘氨結合膽鹽的水解能力都有下降的趨勢，而對牛磺結合膽鹽的水解能力則有增加的趨勢。這為提高BSH對牛磺結合膽鹽的水解能力和揭示其對底物的結合機制奠定了基礎。
【專利說明】一種膽鹽水解酶突變體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種膽鹽水解酶突變體及其應用，屬于基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]通過底物特異性的研究發現，膽鹽水解酶有很強的底物選擇性，其水解甘氨結合膽鹽(glyco-conjugated bile salts)的能力遠遠高于水解牛磺結合膽鹽(tauro-conjugated bile salts)的能力，這與報道的大多數BSH的底物特異性一致。然而正常人體中甘氨結合膽鹽與牛磺結合膽鹽的比例為3:1，這將導致牛磺結合膽鹽不能被BSH很好的水解。
[0003]膽鹽水解酶的底物是由類固醇核部分和氨基酸基團(甘氨酸/牛磺酸)兩部分組成的。Huijghebaert和Hofmann發現,修飾底物的酰胺鍵或減少底物氨基酸部分末端基團的負電荷會顯著降低膽鹽水解酶對相應底物的水解能力。Batta等也發現膽酰甘氨酸水解酶(CGH)能有效水解由帶有一到兩個亞甲基的甘氨酸或牛磺酸類似物制成的底物。而且目前大多數文獻中的動力學數據都表明BSH優先識別底物的氨基酸基團。然而Moser andSavage等發現BSH優先識別底物的類固醇核部分。此外,Batta等和Rossocha等的研究證實，類固醇部分的羥基取代基或異構化的羥基取代基對BSH的底物特異性沒有影響，而且BSH是通過疏水相互作用而不是氫鍵與底物的類固醇部分結合的。因此，關于BSH對底物的識別位點還存在一定的爭議，膽鹽水解酶可能對類固醇核部分和氨基酸基團都有識別作用。也有可能是BSH對底物沒有特異性的結合條件，只要氨基酸部分和類固醇部分合適且與底物結合口袋互補 就行。為了增強BSH水解牛磺結合膽鹽的能力以及揭示BSH與底物的結合機制，有必要尋找和研究決定其底物特異性的氨基酸殘基(specificity-determiningresidue, SDR)。
[0004]本發明根據現有的報道，通過氨基酸序列比對分析以及同源建模等發現，L.plantarum BBE7 BSH 65位氨基酸的極性對BSH的底物特異性有一定的影響。并利用定點突變研究了突變體對酶的底物特異性的影響。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種膽鹽水解酶突變體及其應用，主要涉及改變膽鹽水解酶氨基酸序列的底物特異性。
[0006]所述突變體是膽鹽水解酶，來源于植物乳桿菌L.plantarum BBE7,突變位點為第65位酪氨酸，突變后65位氨基酸是非極性氨基酸，具體為丙氨酸、苯丙氨酸或異亮氨酸中的任--種。
[0007]另外，本發明還提供了一種獲得膽鹽水解酶突變的方法，是利用定點突變技術將膽鹽水解酶底物特異性氨基酸突變為非極性氨基酸。具體為將植物乳桿菌L.plantarumBBE7膽鹽水解酶第65位酪氨酸突變為非極性氨基酸:丙氨酸、苯丙氨酸或異亮氨酸中任
--種。[0008]通過本方法除可將L.plantarum BBE7BSH65位氨基酸分別突變成了 3個非極性氨基酸外，還可突變為2個極性氨基酸。方法的具體操作步驟如下:
[0009]1、利用在線工具 Clustalff2 (http: //www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)對底物特異性已知的BSH的氨基酸序列進行比對和分析。
[0010]2、米用在線軟件 Swiss Model (http: //swissmodel.expasy.0rg/)對 L.plantarumBBE7的BSH進行3_D結構的同源模擬。并利用軟件Accelrys Discovery Studio Client 2.5對該結構與C.perfringens 13 CBAH的結構(PDB code:2BJF, 2BJG)進行疊加和分析。
[0011]突變菌株的構建，包括如下步驟:
[0012]I)以質粒pET-20b(+)-dmSA-bSh為模板，分別以下幾對引物進行PCR擴增；
[0013]65A-F:5’ -CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACGCCGATG-3’ [0014]65A-R: 5，-CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCGGCGTAAAG-3，
[0015]65C-F:5’ -CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACTGTGATG-3’
[0016]65C-R: 5，-CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCACAGTAAAG-3，
[0017]65F-F: 5，-CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACTTCGATG-3，
[0018]65F-R: 5，-CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCGAAGTAAAG-3，
[0019]651-F:5’ -CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACATTGATG-3’
[0020]651-R:5， -CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCAATGTAAAG-3’
[0021]65N-F:5’ -CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACAACGATG-3’
[0022]65N-R:5’ -CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCGTTGTAAAG-3’
[0023]PCR反應體系:0.2mL PCR管中按順序加入以下試劑:5 XPrimeSTAR Buffer10 μ L;dNTP Mixture 4μ L;模板 DNA I μ L ;上下游引物各 2μ L ；PrimeSTAR HS DNA 聚合酶
0.5 μ L ;加雙蒸水至終體積為50 μ L。
[0024]PCR 擴增條件:94°C預變性 IOmin ;98°C變變性 10s，57°C退火 30s，72°C延伸 Imin(30個循環)；72°C延伸IOmin0
[0025]2)將PCR產物直接用限制性內切酶Dpn I進行消化(37°C，lh)，取10 μ L酶切產物RKE.coli JM109感受態細胞，直接挑取含有抗生素的LB固體平板上的單菌落進行培養，并送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序；
[0026]3)將測序正確的質粒轉化Ε.coli BL21 (DE3)pLysS感受態細胞，即得到突變菌株。
[0027]突變體的表達與純化；
[0028]I)培養基:種子和斜面培養基為LB培養基(IL):胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，用IN NaOH將pH調至7.0 ;斜面培養基添加瓊脂15g ;基本發酵培養基為TB培養基(1L):去離子水900mL，胰蛋白胨12g，酵母抽提物24g，甘油10mL，高壓滅菌，冷卻至60°C，加IOOmL滅菌磷酸鉀緩沖液；
[0029]2)培養方法:將20°C、200rpm下過夜培養的種子以2%的接種量轉入基本發酵培養基，于37°C、200rpm條件下培養至OD6tltl=0.6，加入0.4mM IPTG于20°C誘導35h ;通過SDS-PAGE和酶活測定，分析突變體的表達情況。
[0030]SDS-PAGE蛋白電泳的方法:SDS_PAGE膠的組成為:上層濃縮膠為5%，下層分離膠為12%，電泳緩沖液為Tris-HCl緩沖液(pH8.0)。具體方法見碧云天SDS-PAGE配制試劑盒說明書。酶活的測定方法是分別將IOmM的底物甘氨膽酸(GCA)，甘氨脫氧膽酸(GDCA)，甘氨鵝脫氧膽酸(G⑶CA)，牛磺膽酸(TCA)，牛磺脫氧膽酸(TDCA)和牛磺鵝脫氧膽酸(IODCA)添加到反應體系中，37°C反應30min，用茚三酮法進行比酶活的測定，比酶活最高者為100%。
[0031]具體方法為:取0.1mL樣品加入1.8mL 0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.0)和0.1mL結合膽鹽(200mM)中混合，并置于37°C孵育30min，取0.5mL上述反應液加入0.5mL15%(w/v)三氯乙酸終止反應，混合均勻后，離心10min (離心機最大轉速，40C )取上清。將0.1mL上清液與1.9mL茚三酮顯色液(包括0.5mLl%茚三酮(溶解于0.5M檸檬酸緩沖液(pH5.5)中)、
1.2mL甘油和0.2mL 0.5M的檸檬酸緩沖液(pH5.5))混合，震蕩混勻，沸水浴Hmin0冷卻3min后測定570nm下的吸收值。標準曲線用甘氨酸或牛磺酸制作。并用Brandford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白的含量，計算比酶活。
[0032]3)利用硫酸銨沉底、透析、Ni2+親和層析和凝膠過濾層析純化突變體。
[0033]突變體的分離純化方法如下:
[0034]結合緩沖液(24mL):3mL8X磷酸鹽緩沖溶液，0.24mL 2M咪唑，加水至24mL，調pH至7.4~7.6。此緩沖液含有20mM的磷酸鹽(I X )，500mM NaCl和20mM咪唑。
[0035]洗脫緩沖液(8mL): lmL8 X磷酸鹽緩沖溶液，2mL2M咪唑，加水至8mL，調pH至
7.4~7.6。此緩沖液含有20mM的磷酸鹽，500mM NaCl和500mM咪唑。
[0036]8 X 磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4):1.42g Na2HP042H20( 177.99g mol-1)，1.1lg NaH2PO4H2O (137.99811101-1)，23.38gNaCl(58.44g mol-1)，加入 90mL 蒸餾水，充分溶解，將 pH 調至 7.4，再定容至IOOmL,用0.45 μ m濾膜過濾。
[0037]2M 咪唑(pH7.4):13.62g 咪唑(68.0Sgmor1)，加入 90mL 蒸餾水，完全溶解，用 HCl調pH至7.4,定容至IOOmL,用0.45 μ m濾膜過濾。
[0038]I)鹽析
[0039]在800mL發酵上清液中加入10% (v/v)的甘油，隨后將其放在磁力攪拌器上進行攪拌，再緩慢加入研磨的、干燥的硫酸銨粉末至其飽和度為40%。在冰上放置Ih后，離心(7000rpm ；30min ;4C)取上清，加硫酸銨至其飽和度為80%。在4C放置4h以上，離心收集沉淀，并將其溶解到20mL 50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。
[0040]2)透析
[0041]將硫酸銨沉淀后的樣品用透析袋(截留分子量為50kDa)在50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中透析24h，每隔三四個小時換一次緩沖液，直至樣品中硫酸銨全部透析出來。
[0042]3) Ni2+親和層析
[0043]用5~IOmL的結合緩沖液以ImLmirT1的流速平衡HisTrap FF crude柱(ImL),將樣品以ImLmirT1的流速進樣至層析柱上，隨后用IOmL的結合緩沖液洗脫未結合蛋白，再用洗脫緩沖液對目的蛋白進行梯度洗脫，并進行收集(固定體積和峰收集)，最后對收集液進行SDS-PAGE電泳分析和酶活測定。
[0044]4)凝膠柱純化
[0045]利用超濾離心管將含有重組BSH的組分離心(4000rpm ；4°C )濃縮至2mL左右。然后用Superdex G-200預裝柱對濃縮的樣品進行純化，所用的緩沖液為20mM的磷酸鈉緩沖液(ρΗ6.0)，流速為0.5mL mirT1。收集含有BSH的組分。
[0046]3、突變體底物特異性的測定。
[0047]通過對不同底物酶活的測定，分析野生型BSH和突變型BSH的底物特異性。[0048]本發明的有益效果:與野生BSH相比，突變體Y65A，Y65F和Y65I對甘氨結合膽鹽的水解能力都有下降的趨勢，而對牛磺結合膽鹽的水解能力則有增加的趨勢。這為提高BSH對牛磺結合膽鹽的水解能力和揭示其對底物的結合機制奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0049]圖1:與已知的膽鹽水解酶的氨基酸序列比對圖。
[0050]圖2:L.plantarum BBE7 BSH和脫氧膽酸(DCA)、牛橫酸(Taurine)的復合體的結構及保守氨基酸空間位置。
[0051]圖3:E.coli BL21 (DE3)pLysS 表達突變體的 SDS-PAGE 分析。
[0052]圖4 =SDS-PAGE分析純化的突變體。
[0053]圖5:野生BSH與突變體的底物特異性。
【具體實施方式】
[0054]實施例1:pET_20b (+)-dmsA-bsh 構建方法
[0055]具體操作如下:
[0056]質粒 pUC57_Tat(Tat-dependent protein targeting in prokaryotes andchloroplasts)為模板，擴增 dmsA 基因，PCR 條件為:95 °C 預變性 IOmin ；98°C 10s, 55 °C30s, 72°C 20s，30 個循環；72°C延伸 lOmin。同時以 L.plantarum BBE7 的基因組 DNA 為模板，PCR擴增(延伸時間為Imin)不含終止密碼子的bsh基因，將這兩個片段進行膠回收，以等摩爾的這兩個片段為模板，得到融合片段dmsA-bsh。
[0057]2)用Nde I和Xho I進行雙酶切，與經過相應酶切的質粒pET_20b (+)進行連接，得到重組質粒pET-20b (+) -dmsA-bsh。并將重組質粒轉化E.coli JM109感受態細胞，并篩選陽性重組子進行測序。
[0058]實施例2:氨基酸序列比對分析
[0059]利用在線工具 Clustalff2 (http: //www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)對底物特異性已知的BSH的氨基酸序列進行比對和分析。進行比對分析的膽鹽水解酶基因包括以下23種，具體氨基酸序列見圖1:
[0060]LSB-30514_bshl, L.salivarius B-30514 BSHl (AFP87505.1);
[0061]LSUCC118_bshl, L.salivarius UCCl 18 BSHl (ACL98201.1) ; LSLGM14476_bshl, L.[0062]salivarius LGM14476 BSHl (ACL98197.1) ; LSLGM14476_bsh2, L.salivariusLGM14476(ACL98205.1);
[0063]LSJCM1046_bshl.L.salivarius JCM1046BSH1 (ACL98194.1);
[0064]LPST-1I1-bshl, L.plantarum subsp.plantarum ST-1IIBSHl(AD000098.1);LPBBE7_bsh, L.[0065]plantarum BBE7BSH;
[0066]LPffCFSl_bshI, L.plantarum WCFSl (CCC80500.1);
[0067]LP80_bsh, L.plantarum80 (AAB24746.1);
[0068]LRCRL1098 _bsh, L.reuteri CRL 1098(ACH81023.1);
[0069]LJ100_chshalpha, L.johnsonii100-100CBSH-a (AAG22541.1);[0070]LJ100_chshbeta, L.johnsonii100-100CBSH-β (AAC34381.1);
[0071]LJPFOl_bshA, L.johnsonii PFOl BSHA(EGP12224.1);
[0072]LJPFOl_bshB, L.johnsonii PFOl BSHB(EF536029.1);
[0073]LJPFOl_bshC, L.johnsonii PFOl BSHC (EGP12391.1);
[0074]LANCFM_bshA, L.acidophilus NCFM BSHA(YP_193782.1);
[0075]LANCFM_bshB L.acidophilus NCFM BSHA(AAV42923.1);
[0076]LGAMl_bsh, L.gasseri Aml BSH(FJ439777.1);
[0077]CPERF13_cbahl, Clostridium perfringens 13 CBAH-1 (P54965.3);
[0078]BLBB536_bsh, Bifidobacterium longum BB536 BSH(AEK27050.1);BLSBT2928_bsh, B.[0079]longum SBT2928 BSH(AAF67801.1);
[0080]BBATCC11863_bsh, B.bifidum ATCC 11863 BSH (AAR39435.1);
[0081]BABI30_bsh, B.animal is subsp.1actis Bi30 BSH (AEK27050.1)。
[0082]氨基酸序列比對表明，這些序列之間的相似度為30.57%-99.69%，平均值為46.78%。根據C.perfringens CBAH的晶體結構的數據，確定了保守的活性位點氨基酸、底物結合口袋和二級結構。從圖1中可以看出，活性位點氨基酸在所有的BSH中都是高度保守的。而底物結合口袋(β6，β7和β--)的氨基酸都不是保守的，除了嚴格保守的Leul42(具體原因尚不清楚)。在所有的BSH中，底物結合口袋的氨基酸主要是疏水氨基酸，這表明BSH可能通過疏水相互作用與底物的疏水性的類固醇部分結合。
[0083]此外，位于C.perfringens CBAH 中的 68 位氨基酸(Ala68)(在 L.plantarum BBE7BSH中是Tyr65)的極性對BSH的底物特異性有一定的影響，這可能是因為Ala68位于形成底物結合口袋的β7上。當這個氨基酸為非極性氨基酸(丙氨酸(A)和苯丙氨酸(F))時，BSH偏向于水解牛磺結合膽鹽；而當這個氨基酸為極性氨基酸(酪氨酸(Y)和半胱氨酸(C))時，BSH則偏向于水解甘氨結合膽鹽，這與Chae等的研究結果一致。此外，盡管存在少數例外，如BABI30_bsh的68為氨基酸為非極性的苯丙氨酸，而它卻偏向于水解甘氨結合膽鹽，但這至少可以表明68位氨基酸是許多決定底物特異性的氨基酸殘基(SDR)中的一個，可能還有其它的SDR需要進一步挖掘。
[0084]實施例3:同源結構模擬和疊加
[0085]利用在線軟件Swiss Model對L.plantarum BBE7 BSH的3-D結構進行了同源模擬，用于同源建模的模板是C.perfringens 13 CBAH的突變體C2a (PDB ID:2rf8B)。二者序列的同源性為37.69%。模擬后BSH模型的估計絕對模型質量(QMEAN Z-Score)和α碳原子的均方根偏差(Root-Mean-Square Deviation, RMSD)分別為-3.61和1.03 A。將該模型與CBAH和底物的復合體結構(PDB code:2BJF, 2BJG)進行疊加(RMSD為10.74 A),得到了L.plantarum BBE7BSH和脫氧膽酸(DCA)、牛磺酸(Taurine)的復合體的結構(圖2a)。圖2a中 L.plantarum BBE7 BSH 與 C.perfringens 13 CBAH 結構的疊加，深灰為 BSH，淺灰為 CBAH ；圖 2b 描述了 L.plantarum BBE7 BSH 中保守的氨基酸(Cys2, Argl6, Aspl9, Asn79, Asnl70和Arg223)以及Tyr65與底物DCA的空間位置關系，其中Tyr65位于底物DCA的異戊酸側鏈以及催化中心Cys2附近。而且這個異戊酸側鏈離C12位的羥基取代基很近，在這里增加親水性的(極性的)氨基酸會改變酶的底物親和力。此外，Tyr65還與β-11有緊密的相互作用，而β-ll位于α β β α核心結構內，因此它對Ntn水解酶家族的酶的底物結合和催化都起到重要作用。
[0086]綜合氨基酸序列比對以及同源結構模擬和疊加的結果，L.plantarum BBE7 BSH的65位氨基酸的極性和空間位置決定了它對酶的底物特異性有一定的影響。
[0087]實施例4:定點突變及突變體的表達和純化
[0088]采用一步法對65位的氨基酸進行了定點突變，將它分別突變成兩個極性的氨基酸(C和N)以及三個非極性的氨基酸(A，F和I)。通過蛋白電泳和酶活測定發現，突變體Y65A，Y65F和Y65I都以活性酶的形式被分泌到胞外(圖3_3a，其中(a)全細胞；(b)破壁沉淀；1，Y65C ;2，Y65N ;3，Y65A ;4，Y65F ;5，Y65I ;6，含有 pET_20b (+)的 E.coli BL21(DE3)pLysS ;M，蛋白分子量標準)，而突變體Y65C和Y65N則以包涵體的形式存在于胞內(圖3-3b)。而且這兩個突變體的信號肽DMSA與BSH形成的前體(分子量約為42kDa)沒有被信號肽切割，也在胞內形成了包涵體(圖3-3b)。這可能是因為C和N為極性氨基酸，而A，F和I為非極性氨基酸。而且Tyr65離催化反應中心Cys2很近。因此,L.plantarum BBE7 BSH65位氨基酸的極性對蛋白的正確折疊至關重要，這也進一步證實了底物結合口袋的氨基酸一般為非極性的疏水氨基酸。
[0089]采用Ni2+柱和凝膠柱分別對突變體Y65A，Y65F和Y65I進行了純化。SDS-PAGE電泳分析的結果表明，純化后的重組酶均達到了電泳純(圖4，其中1，Y65A ;2，Y65F ;3，Y65I ；M，蛋白分子量標準)。
[0090]實施例5:突變體底物特異性的測定
[0091]分別將IOmM 的底物甘氨膽酸(GCA)，甘氨脫氧膽酸(⑶CA)，甘氨鵝脫氧膽酸(G⑶CA)，牛磺膽酸(TCA)，牛磺脫氧膽酸(TDCA)和牛磺鵝脫氧膽酸(IODCA)添加到反應體系中，37°C反應30min，用茚三酮法進行比酶活的測定。比酶活最高者為100%。
[0092]通過酶活測定分析了野生BSH與突變體的底物特異性，具體結果見圖5，其中GCA為甘氨膽酸；GDCA為甘氨脫氧膽酸；GCDCA為甘氨鵝脫氧膽酸；TCA為牛磺膽酸；TDCA為牛磺脫氧膽酸；TCDCA為牛磺鵝脫氧膽酸；誤差線表示的是標準偏差。從圖中可以看出，與野生BSH相比，突變體Y65A、Y65F和Y65I對甘氨結合膽鹽的水解能力都有所下降，其中Y65A和Y65I的下降趨勢最明顯，Y65I對G⑶CA的比酶活比野生BSH下降了 70.46%。這三個突變體對牛磺結合膽鹽的水解能力卻明顯增加，Y65I的增加趨勢最明顯，它對TDCA的比酶活比野生BSH增加了 4倍多。此外，這三個突變體對甘氨結合膽鹽和牛磺結合膽鹽的水解能力的總體趨勢為:Y65I>Y65A>Y65F。除了 Y65F外，Y65A和Y65I對甘氨結合膽鹽和牛磺結合膽鹽的水解能力與它們的疏水性參數大小(I (4.5)>A(1.8))有關。
[0093]突變體的底物特異性的結果還表明，突變體對含有不同類固醇核的底物的水解能力如下:(G/T) CDCA> (G/T) DCA> (G/T) CA。這可能是因為CDCA的C12位和DCA的C7分別比CA少了一個羥基，導致了它們的疏水性強于CA。且DCA缺少的羥基在C7位，離Tyr65比較遠，對它們之間的相互作用的影響比⑶CA小。
[0094]綜上所述，將65位的氨基酸突變為非極性氨基酸時，BSH對牛磺結合膽鹽的水解能力增強，而對甘氨結合膽鹽的水解能力減弱；且底物的C7和C12位羥基取代基對酶的底物特異性也有一定的影響，為揭示其對底物的結合機制奠定了基礎。
[0095]可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬于本發明所附的權利要求的保護范圍 。
【權利要求】
1.一種膽鹽水解酶突變體，其特征在于，改變膽鹽水解酶氨基酸序列的底物特異性。
2.根據權利要求1所述突變體，其特征在于，植物乳桿菌膽鹽水解酶第65位酪氨酸為突變為非極性氨基酸。
3.根據權利要求1所述突變體，其特征在于，植物乳桿菌L.Plantarum BBE7膽鹽水解酶第65位酪基酸為突變為非極性氨基酸。
4.根據權利要求1所述突變體，其特征在于，植物乳桿菌L.P lantarum BBE7膽鹽水解酶第65位酪氨酸為突變為丙氨酸、苯丙氨酸或異亮氨酸中的任一一種。
5.根據權利要求4所述突變體,其特征在于，植物乳桿菌L.P lantarum BBE7膽鹽水解酶第65位酪氨酸為丙氨酸。
6.根據權利要求4所述突變體,其特征在于，植物乳桿菌L.P lantarum BBE7膽鹽水解酶第65位酪氨酸為苯丙氨酸。
7.根據權利要求4所述突變體,其特征在于，植物乳桿菌L.P lantarum BBE7膽鹽水解酶第65位酪氨酸為異亮氨酸。
8.一種獲得權利要求1所述突變體的方法，其特征在于，將植物乳桿菌L.P lantarumBBE7底物特異性氨基酸突變為非極性氨基酸。
9.根據權利要求8所述方法,其特征在于,植物乳桿菌L.P lantarum BBE7膽鹽水解酶第65位酪氨酸為突變為非 極性氨基酸。
10.根據權利要求8所述方法,其特征在于，植物乳桿菌L.P lantarum BBE7膽鹽水解酶第65位酪氨酸為突變為丙氨酸、苯丙氨酸或異亮氨酸中任一一種。
【文檔編號】C12N9/14GK103992991SQ201310557568
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年11月11日 優先權日:2013年11月11日
【發明者】陳堅, 張娟, 董自星, 周曉玲, 堵國成, 李華鐘 申請人:江南大學