高耐膽鹽能力的菌株及膽鹽水解酶基因的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高耐膽鹽能力的菌株及膽鹽水解酶基因，菌株的保藏編號為CGMCCNo.8198，具有很強的耐酸、耐膽鹽、硝酸鹽還原等能力，并擴增出該菌株的三種膽鹽水解酶基因，并對其進行了克隆、測序和異源表達，由此產生的膽鹽水解酶具有很高的活性。本發明的菌株和膽鹽水解酶可用于食品、醫藥、農業等領域，如用作食品及飼料發酵劑、微生態制劑、藥物表達載體、飼料添加劑等，膽鹽水解酶可用于開發為重組蛋白產品，亦可用作乳酸菌基因工程表達系統的篩選標記，用于乳酸菌菌種的分子改造。
【專利說明】高耐膽鹽能力的菌株及膽鹽水解酶基因
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程領域，涉及產膽鹽水解酶的乳桿菌屬的新菌株，以及該菌株分離得到的相關基因。
【背景技術】
[0002]益生菌是指當攝入一定數量，能以活菌狀態到達胃腸道，通過調節腸道菌群組成， 發揮對人體或動物健康起促進作用的單一或特定微生物的混合物。作為人和動物胃腸道內重要的生理性有益菌，益生菌具有維持胃腸道正常的微生態平衡、抑制病原菌的入侵與感染、增強機體免疫力、預防和抑制腫瘤發生、降低膽固醇以及抗氧化等作用。益生菌目前仍然以乳酸菌為主。
[0003]膽固醇存在于人和動物的血液、脊髓及腦中，正常人血清膽固醇含量為
1.50-2.50g/L。研究表明，血清中膽固醇含量過高是引起動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓等心腦血管疾病的重要因素。目前心腦血管疾病是引起人們死亡的主要殺手，而且逐年呈上升趨勢。同時，人體總膽固醇濃度與膳食脂質攝入之間有著密切的關系，因此降低食品中膽固醇水平關系到人類的健康。
[0004]在肝臟中，膽固醇的主要去路是轉變成膽酸，膽酸衍生的甘氨膽酸和牛磺膽酸是人類的主要膽汁酸，膽汁酸均以鈉鹽或鉀鹽形式存在，即膽汁酸鹽，簡稱膽鹽，具有促進脂類的消化與吸收和抑制膽汁中膽固醇析出的作用。膽汁酸可分為兩類:一類是膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和石膽酸等游離膽汁酸；另一類是游離膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸結合形成的結合膽酸，主要有甘氨膽酸，牛磺膽酸，甘氨鵝脫氧膽酸和牛磺鵝脫氧膽酸，是人膽汁中的主要膽汁酸。
[0005]國內外一些研究表明，乳酸菌能夠降低發酵食品和人體血清膽固醇的水平，尤以乳桿菌降低人體血液膽固醇水平的研究受到了越來越廣泛的關注和重視。目前的研究證實，乳桿菌降低血液膽固醇水平與膽鹽水解酶的存在有一定的關系。膽鹽水解酶 (Bilesalthydrolase, BSH)是微生物(主要是乳酸菌)生長、繁殖過程中產生的一種代謝物， 它能水解結合形膽酸鹽，將其轉變成氨基酸和游離膽酸鹽，造成吸收效率降低，從而使大量的游離膽酸鹽從糞便中排出。膽固醇是形成膽酸的前體物質，排出體外的部分游離膽酸鹽需要膽固醇的轉化來彌補，從而加速了膽固醇的分解代謝，使膽固醇濃度的降低，促進血清中膽固醇水平的`降低。
[0006]目前，針對微生物中膽鹽水解酶的作用機理還沒有確切的定論，大多是幾種假設， 主要是以吸收同化作用和共沉淀作用為主。但根據實驗結果推測，乳酸菌降膽固醇的機理可能是由多種機制協同作用的結果。膽鹽水解酶基因bsh編碼區的調節在各個種屬之間是有所差異的，BSH酶的大小、亞基組成、最適pH值、底物特異性及動力學性質等變化也較大。 更有趣的是在有些菌株，如植物乳桿菌WCFSl中同時存在4個bsh同源基因，這對于研究 bsh基因的功能具有重要的意義。因此，明確不同菌株或同一菌株不同BSHs的功能和作用機制對于揭示乳酸菌的耐膽鹽作用機理及開發降膽固醇發酵乳制品具有重要的實用價值。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供高耐膽鹽能力的菌株，該菌株為植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum) CGMCCN0.8198菌株，已于2013年9月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，中國北京市朝陽區北辰西路I號院。
[0008]本發明還提供三種來自L.plantarumCGMCCN0.8198的膽鹽水解酶(BSHs)及其基因bsh2、bsh3、bsh4。以L.plantarumCGMCCN0.8198基因組為模板，克隆三種bshs基因，連接到大腸桿菌表達載體pET22b中，并在E.coliRosetta(DE3)中誘導表達,所得到的三種膽鹽水解酶具有相對很高的水解結合型膽酸鹽的能力。
[0009]本發明實現目的的技術方案如下:
[0010]一種高耐膽鹽能力的菌株，所述菌株為植物乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum), 保藏編號為CGMCCN0.8198，于2013年9月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址，中國北京市朝陽區北辰西路I號院。
[0011]一種膽鹽水解酶基因，基因序列如序列I所示。
[0012]一種膽鹽水解酶基因，基因序列如序列2所示。
[0013]一種膽鹽水解酶基因，基因序列如序列3所示。
[0014]一種膽鹽水解酶基因組，包括如如序列1、2、3所示基因序列。
[0015]一種膽鹽水解酶，由高耐膽鹽能力的菌株發酵獲得。
[0016]一種產膽鹽水解酶的基因工程菌，包括膽鹽水解酶基因組中任一基因。
[0017]上述工程菌發 酵獲得膽鹽水解酶。
[0018]本發明的優點和積極效果如下:
[0019]1、本發明提供一種高耐膽鹽能力的菌株，通過實驗發現本菌株具有很強的硝酸鹽還原能力和耐酸能力，在pH為5.0~8.0范圍內均能較好的生長，在含有0.3%膽鹽的MRS 培養基中培養4h存活率仍能達到48.32%，屬于具有很高的耐膽鹽能力的菌株。
[0020]2、本發明還提供了該菌株的三種膽鹽水解酶基因，并對其進行了克隆、測序和異源表達，由此產生的膽鹽水解酶具有很高的活性。
[0021]3、本發明的菌株和膽鹽水解酶可用于食品、醫藥、農業等領域，如用作食品及飼料發酵劑、微生態制劑、藥物表達載體、飼料添加劑等，膽鹽水解酶可用于開發為重組蛋白產品，亦可用作乳酸菌基因工程表達系統的篩選標記，用于乳酸菌菌種的分子改造。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為本發明L.plantarumCGMCCN0.8198在不同濃度膽鹽下的存活率；
[0023]圖2為本發明三種膽鹽水解酶在E.coliRosetta(DE3)中的誘導表達；
[0024]圖3為本發明三種膽鹽水解酶水解不同結合型膽鹽的能力；
[0025]圖4為本發明不同濃度膽鹽對bsh2_4表達的調控。
【具體實施方式】
[0026]下面結合實施例，對本發明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。[0027]以下實施例分別從菌株的獲得、該菌株膽鹽水解酶基因的分離獲得以及膽鹽水解酶的表達三個方面來說明本發明的技術方案，具體內容如下:
[0028]一、L.plantarumCGMCCN0.8198 的分離鑒定
[0029]以下實驗均在無菌條件下操作。
[0030]1.菌株的富集
[0031]稱取青貯飼料5g，加入20mL無菌生理鹽水均質，將得到的勻漿適當稀釋后取 100 i! L涂布于含有0.3%豬膽鹽的MRS平板上，37°C厭氧培養箱倒置培養36_72h，觀察菌落生長狀況。
[0032]2.菌株的分離
[0033]挑取I中的菌落，涂于載玻片上，革蘭氏染色，觀察菌體形態特征，選取革蘭氏陽性菌作為目的菌株。
[0034]3.菌株的純化
[0035]挑取2中所得的菌落在含有0.3%豬膽鹽的MRS平板上劃線，37 °C厭氧培養 24-36h，挑取單菌落鏡檢，直至所得的菌株為純菌。
[0036]4.菌株的鑒定
[0037]對3中獲得的純菌進行生理生化實驗研究，發現該菌具有很強的硝酸鹽還原能力和耐酸能力，在pH為5.0~8.0范圍內均能較好的生長。在含有0.3%膽鹽的MRS培養基中培養4h存活率仍能達到48.32% (如圖1所示)，這在文獻報道中，屬于具有很高的耐膽鹽能力的菌株。對該菌株進行16SrRNA鑒定,確定為乳桿菌屬中的一株新的植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum),該菌株已于2013年9月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCN0.8198，地址:中國北京市朝陽區北辰西路I號院。在MRS瓊脂培養基上生長30h，形成乳白色、圓形大菌落，邊緣光滑，中央凸起， 具有一定的黏性，屬于兼性厭氧菌，在顯微鏡下觀察革蘭氏染色陽性，呈桿狀。
[0038]該菌株在培養過程中使用MRS培養基。
[0039]二、L.plantarumCGMCCN0.8198的膽鹽水解酶基因(bsh)的克隆表達
[0040]將已經獲得的L.plantarumCGMCCN0.8198具有很高的耐膽鹽能力，表明該菌株可以高產膽鹽水解酶，從而將結合型膽鹽水解，提高自己的存活率，本發明通過引物擴增出 L.plantarumCGMCCN0.8198中的膽鹽水解酶基因。
[0041]1.bsh基因的克隆
[0042]以GenBank中已公布的L.pIantarumffCFSI (NC_004567.2)的膽鹽水解酶基因為模板設計引物(如表1所示)，以L.plantarumCGMCCN0.8198的基因組為模板，利用PCR擴增 L.plantarumCGMCCN0.8198中相關的膽鹽水解酶基因。PCR體系如表2所示，
[0043]擴增條件為:95°C,5min；95°C,30s ;退火 59°C，40s ;72°C，lmin，30 個循環；72°C 延伸lOmin。瓊脂糖凝膠電泳顯示獲得3個不同大小的DNA片段，分別命名為bsh2、bsh3和 bsh4。
[0044]表1PCR引物序列
【權利要求】
1.一種高耐膽鹽能力的菌株，其特征在于:所述菌株為植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum)，保藏編號為CGMCCN0.8198，于2013年9月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址，中國北京市朝陽區北辰西路I號院。
2.一種膽鹽水解酶基因，其特征在于: 基因序列如序列I所示。
3.一種膽鹽水解酶基因，其特征在于:基因序列如序列2所示。
4.一種膽鹽水解酶基因，其特征在于:基因序列如序列3所示。
5.一種膽鹽水解酶基因組，其特征在于:包括如如序列1、2、3所示基因序列。
6.一種膽鹽水解酶，其特征在于:由權利要求1所述的高耐膽鹽能力的菌株發酵獲得。
7.一種產膽鹽水解酶的基因工程菌，其特征在于:包括如權利要求5所述的基因組中任一基因。
8.權利要求7所述工程菌發酵獲得膽鹽水解酶。
【文檔編號】C12N9/14GK103571776SQ201310491340
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月18日 優先權日:2013年10月18日
【發明者】張同存, 羅學剛, 古向超, 張瑤, 王重喜 申請人:天津科技大學