一種鮑氏不動桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鮑氏不動桿菌及其應用，本發明的鮑氏不動桿菌命名為鮑氏不動桿菌DD1（Acinetobacter?baumannii?DD1），保藏號為CCTCC?NO:M?2013560，于2013年11月8日保藏于位于中國·武漢·武漢大學內的中國典型培養物保藏中心。將所述鮑氏不動桿菌接種至含有二噁烷的廢水或者通入二噁烷廢氣的無機鹽培養基中中培養，能夠實現二噁烷的完全降解，還可以降解甲苯、苯酚、四氫呋喃等污染物。本發明菌株為好氧非發酵型革蘭氏染色陰性菌，能夠以二噁烷為唯一碳源和能源生長同時高效降解該底物；該菌株能降解甲苯、苯酚、四氫呋喃等多種污染物；本發明為采用生物法凈化含有二噁烷廢水、廢氣的工程應用奠定了基礎。
【專利說明】一種鮑氏不動桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種二B,惡燒的降解方法,具體涉及一種鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)及其應用。
【背景技術】
[0002]I, 4- 二氧雜環己烷(1，4-dioxane)，別名二噁烷，具有很好的水溶性，是一種良好的有機溶劑，可與乙醇、乙醚、丙酮、苯酚等相容，被廣泛應用于油漆、染料、制藥等行業，也應用于食品、化妝品和洗滌劑等消費產品中。二噁烷對皮膚、眼部和呼吸系統有刺激性，可在人體內累積，對肝臟、腎和神經系統有嚴重的損害，慢性累積中毒可導致尿毒癥、腎衰竭等疾病，急性中毒可能導致死亡，被美國環保署(U.S.EPA)和世界衛生組織國際腫瘤研究中心(IARC)歸類為B2級(可能的)人類致癌物。
[0003]二噁烷的大量應用，導致地表水和地下水的污染日益嚴重。目前，在美國、加拿大和日本等多個發達國家的地下水和填埋場中均檢測到二噁烷的污染；在加拿大渥太華、安大略湖及加拿大附近的垃圾填埋場的地下水中檢測出高濃度二噁烷；我國黃河也檢測出大量二噁烷，且在蘭州段的土著魚類內臟中檢測亦出二噁烷的累積。更有研究表明，即使在人煙罕至的北極凍土和地下水中也檢測到了二噁烷的存在。因此，地表水和地下水中二噁烷的去除刻不容緩，亟需一種行之有效的方法將其去除。
[0004]目前國內外對于去除二噁烷的方法主要是化學氧化法，包括臭氧、UV光照、過氧化氫和Fenton氧化等，這些方法都具有各自的優點，但是此類方法處理成本過高，不適用于二噁烷的環境污染治理。由于二噁烷具有環醚結構、C-O高能鍵、低亨利常數和低辛醇-水分配系數等理化性質，一度被歸為“不易生物降解物質”。
[0005]1991年，德國學者Bemhardt等從二噁烷化工廠的污泥中首次分離出了具有二噁燒降解能力的菌株Rhodococcu s ruber219,第一次實現了生物降解二噁燒。從而,越來越多的研究者開始關注生物法處理二噁烷的研究。1993年，Burback等有分離出一株具有二n惡燒降解能力的菌株Mycobacterium vaccae,但是該菌株的二噁燒降解能力有限且不能持續生長。Young-Mo Kim等報道的分支桿菌PH-06可以在15天內將1000mg/L的二Il惡燒降解90%,但是降解周期過長。Nakamiya等分離出的真菌Cordyceps sinensis也可以將二噁烷作為唯一碳源和能源持續生長。目前報道的二噁烷降解菌還有Pseudonocardiadioxanivorans CBl 190,Pseudonocardia B5,Bacillus pumilus D4 以及Xanthobacter D7
坐寸ο
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)及其應用，該鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)對二噁焼的降解率達到99.9%以上，還可以降解甲苯、苯酚、四氫呋喃等污染物。
[0007]一種鮑氏不動桿菌，命名為鮑氏不動桿菌DDl(Acinetobacter baumanniiDDl )，保藏號為 CCTCC N0:M2013560o
[0008]本發明的鮑氏不動桿菌DDl (Acinetobacter baumannii DDl)于 2013 年 11 月 8日保藏于位于中國.武漢.武漢大學內的中國典型培養物保藏中心。
[0009]本發明的鮑氏不動桿菌DDl采集于污水處理廠的二沉池活性污泥，形狀為短桿狀，大小為1.0~1.5X1.5~2.5 μ m，無鞭毛，無芽孢；在固體平板培養基30°C培養48h后，單菌落呈圓球狀，光滑濕潤，菌苔沿劃線生長；革蘭氏染色為陰性，氧化酶、接觸酶實驗為陰性；明膠、檸檬酸鹽、硝酸鹽還原實驗為陽性；對卡那霉素、利福霉素具有抗性，對四環素無抗性；鹽度大于4%以上生長緩慢。
[0010]本發明還提供了一種如所述鮑氏不動桿菌在降解二噁烷中的應用。
[0011]該應用具體為:將所述鮑氏不動桿菌接種至含有二噁烷的廢水、含有二噁烷的無機鹽培養基或者通入有二噁烷廢氣的無機鹽培養基中培養，降解二噁烷。
[0012]所述鮑氏不動桿菌DDl (Acinetobacter baumannii DDl)能利用二噁燒作為唯一的碳源和能源物質生長繁殖，將二噁烷礦化成CO2和H20。在純培養條件下，該菌在42h內能將無機鹽培養基中的100mg/L的二噁烷完全降解。
[0013]進一步優選，所述培養在pH值為5.0~8.0、溫度為25 V~40°C的范圍內進行。更優選為在PH值為7.0、溫度為32°C的范圍內進行。
[0014]進一步優選，所述廢水中二噁烷的初始濃度為100mg/L~500mg/L ;所述含有二噁烷的無機鹽培養基中二噁烷的初始濃度為100mg/L~500mg/L ;所述通入二噁烷廢氣的無機鹽培養基中二噁烷的初始 濃度為100mg/L~500mg/L。更優選均為200mg/L。
[0015]所述通入二噁烷廢氣的無機鹽培養基中二噁烷的初始濃度為100mg/L~500mg/L是指:無機鹽培養基中的二噁烷初始濃度是指通入的二噁烷廢氣中溶于無機鹽培養培養基中的二噁烷初始濃度，因此，二噁烷廢氣的通入量以無機鹽培養基中二噁烷所需初始濃度進行計量。
[0016]進一步優選，培養時間為20~50h，更優選為42h。
[0017]進一步優選，所述無機鹽培養基(MSM)包含如下物質:3.5g Na2HPO4.2H20、1.0gΚΗ2Ρ04、0.5g (NH4)2SO4'0.1g MgCl2.6Η20、0.05g Ca (NO3)2，溶于 1000mL 水中，加入 Iml 微量
元素溶液，調節pH至7.0~7.2。含有二噁烷的無機鹽培養基或者通入有二噁烷廢氣的無機鹽培養基的培養基成分部分相同。
[0018]所述微量元素溶液組成為FeSO4.7H201.0g、CuSO4.5Η200.02g、H3BO30.014g、MnSO4.4H200.10g、ZnSO4.7H200.10g、Na2MoO4.2H200.02g、CoCl2.6H200.02g，溶于 1000mL水中。
[0019]本發明的鮑氏不動桿菌還可以用于降解苯酚、甲苯、四氫呋喃或者鄰二甲苯。
[0020]將所述鮑氏不動桿菌接種至含有苯酚、甲苯或四氫呋喃的無機鹽培養基中培養，降解苯酚、甲苯或四氫呋喃。其他降解條件跟降解二噁烷一樣，降解時間有所不同，本發明的菌株對苯酚降解20h的降解率達到99.9%，對甲苯降解24h的降解率達到50%，對四氫呋喃降解48h的降解率達到99.9%。
[0021]本發明的鮑氏不動桿菌還用于降解正丁醇、正己烷、乙醇或苯，降解率均達到99.9%。降解處理的方法同降解二噁烷一樣，降解時間有所不同，正丁醇的最佳降解時間為24h,正己燒的最佳降解時間為108h,乙醇的最佳降解時間為24h,苯的最佳降解時間為24h。
[0022]本發明的有益效果為:
[0023]本發明提供了一株能高效降解二噁烷的鮑氏不動桿菌，該菌株為好氧非發酵型革蘭氏染色陰性菌，能夠以二噁烷為唯一碳源和能源生長同時高效降解該底物，降解率達到99%以上；該菌株能降解甲苯、苯酚、四氫呋喃等多種污染物；本發明為采用生物法凈化含有二噁烷廢水或者廢氣的工程應用奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為Acinetobacter baumannii DDl降解二噁燒及菌體生長情況；
[0025]圖2為不同pH對于菌體濃度和二噁烷降解率的影響；
[0026]圖3為不同溫度下二噁烷濃度隨時間變化情況；
[0027]圖4為不同二噁烷初始濃度下二噁烷濃度隨時間變化情況；
[0028]圖5為Acinetobacter baumannii DDl降解苯酚及菌種生長情況；
[0029]圖6為Acinetobacter baumannii DDl降解四氫呋喃及菌種生長情況。
【具體實施方式】
[0030]下面結合具體實施例對發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:
[0031]無機鹽培養基(MSM)包含如下物質:3.5g Na2HPO4.2Η20、1.0g KH2PO4'
0.5g (NH4)2SO4'0.1g MgCl2.6Η20、0.05g Ca (NO3)2，溶于 1000mL 水中，加入 Iml 微量元素溶液，調節pH至7.0~7.2。
[0032]微量元素溶液組成為FeSO4.7H201.0g、CuSO4.5Η200.02g、H3BO30.014g、MnSO4.4H200.10g、ZnSO4.7H200.10g、Na2MoO4.2H200.02g、CoCl2.6H200.02g，溶于 1000mL水中。
[0033]實施例1:Acinetobacter baumannii DDl 的分離與鑒定
[0034](1)樣品采集及馴化
[0035]現場采集杭州七格污水處理廠二沉池的活性污泥，以二噁烷為唯一碳源和能源，進行馴化、富集。數月后，經富集后的活性污泥，接種到含有IOOmL MSM培養基的250mL三角錐形瓶中，以二噁烷作為唯一碳源和能源物質，繼續培養、富集。實驗需恒溫(30土1C)，并保持在好氧條件下進行。
[0036](2)菌株分離與鑒定
[0037]將經過多次傳代富集的混合菌液進行梯度稀釋，用涂布法的形式接種到僅以二噁燒作為唯一碳源的無機鹽瓊脂培養基上，置于恒溫培養箱(30°C )中培養。挑取單菌落。對單菌落進行多次劃線分離后，再接回含二噁烷100mg/L的MSM培養基)中進行培養，測試其是否具有降解二噁烷的能力。選取具有降解能力的菌種進行進一步的分離純化，直至分離出具有二噁烷降解能力的菌株DD1。
[0038]菌株形狀為短桿狀,大小為1.0~1.5 X 1.5~2.5 μ m,無鞭毛,無芽孢；在固體平板培養基30°C培養48h后，單菌落呈圓球狀，淡黃色，光滑濕潤，菌苔沿劃線生長；革蘭氏染色為陰性；明膠、檸檬酸鹽、硝酸鹽還原實驗為陽性；氧化酶、接觸酶實驗為陰性；對卡那霉素、利福霉素具有抗性，對四環素無抗性；鹽度大于4%以上生長緩慢。
[0039]上述特征與《伯杰細菌鑒定手冊》編錄的不動桿菌屬的生理生化性狀相吻合。該菌株經Biolog微生物鑒定以及16S rDNA同源性分析，結合以上的生理生化的菌學特征，將其鑒定為鮑氏不動桿菌，16S rDNA的全基因序列如SEQ ID NO:1所示，GenBank登錄號為KF713537。
[0040]將該鮑氏不動桿菌命名為鮑氏不動桿菌DDl (Acinetobacter baumannii DDl),于2013年11月8日保藏在位于中國.武漢.武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏號為 CCTCC NO:M2013560o
[0041]實施例2:Acinetobacter baumannii DDl 降解二噁燒的特性
[0042](I)二噁燒作為 Acinetobacter baumannii DDl 的唯一碳源，接種 Acinetobacterbaumannii DDl菌體至IOOmL無機鹽培養基中，初始菌體0D_為0.01 ;加入二噁烷使初始二噁烷濃度為100mg/L。置于溫度為30°C，轉數為130r/min的搖床中培養，定期取樣，培養42h時，菌株的OD值達到最大值0.183，結果見圖1。
[0043]由圖1可知，隨著時間的延長，菌種的濃度也不斷增大。本實施例說明降解菌Acinetobacter baumanniiDDl可利用二噁燒作為唯一碳源和能源進行生物繁殖,并且具有高效降解二噁烷的能力。
[0044](2)用NaOH或者HCl溶液調節無機鹽培養基至不同pH值(5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、
8.0)，在初始的二噁烷濃度為100mg/L的條件下，接入菌株使初始菌體0D_為0.01。將樣品置于30°C、130r/min恒溫搖 床里振蕩培養，培養35h后取樣，結果見圖2。
[0045]由圖2可見，在pH5.0~8.0范圍內，微生物均可較好的降解二噁烷，并伴隨細胞濃度的增長；隨著PH的不斷增大，菌株濃度及二噁烷降解率先升高后下降，降解的最適pH為 7.0。
[0046](3)在初始的二噁烷濃度為100mg/L的無機鹽培養基中，接入菌株使初始菌體OD600為0.0I。將各個樣品的溫度分別設置為25 °C、30°C、32 °C、37 °C、40°C，置于130r/min恒溫搖床里振蕩培養，定時取樣，測定二噁烷的殘余濃度，結果見圖3。由圖3可知，在25°C~40°C的范圍內，菌株均可生長，降解速率隨著溫度的上升有一個先上升后下降的過程，在32 °C時降解速率達到最大。
[0047](4)在二噁烷初始濃度分別為 100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L 的無機鹽培養基中，接入菌株使初始菌體0D_為0.01，將樣品置于30°C、130r/min恒溫搖床里振蕩培養，定期取樣，結果見圖4。由圖4可知，除500mg/L之外，都能完全降解，降解速率隨著濃度的升高有一個先上升后下降的過程，其中在200mg/L的情況下，降解速率最快。
[0048]實施例3:Acinetobacter baumannii DDl降解苯酌二和四氫呋喃
[0049]分別以苯酌.和四氫呋喃作為Acinetobacter baumannii DDl的唯一碳源和能源，在初始濃度都為100mg/L的無機鹽培養基中，接入菌株使初始菌體0D_為0.01，將樣品置于30°C、130r/min恒溫搖床里振蕩培養,定期取樣,結果見圖5、圖6。
[0050]由圖5的結果可知，隨著培養時間的延長,菌種的濃度增加,苯酹的濃度降低，當培養時間超過20h時，苯酚基本降解完全；
[0051]由圖6的結果可知，隨著培養時間的延長，菌種的濃度增加，四氫呋喃的濃度降低，當培養時間達到70h時，四氫呋喃基本降解完全；[0052]實施例4:Acinetobacter baumannii DDl底物廣譜性降解情況
[0053]在無機鹽培養基中，分別加入各種底物(即分別以表1中的底物為單一碳源)，投加量見下表1，接入菌株使初始菌體OD6tltl為0.01，將樣品置于30°C、130r/min恒溫搖床里振蕩培養，定期取樣測定，結果顯示，菌株無法直接利用三氯甲烷、三氯乙烯、三氯乙酸、異辛烷等污染物，可直接利用的底物情況見下表1。
[0054]表1Acinetobacter baumannii DDl 底物廣譜性降解情況
[0055]
【權利要求】
1.一種鮑氏不動桿菌，其特征在于，命名為鮑氏不動桿菌DDl (Acinetobacterbaumannii DDl)，保藏號為 CCTCC NO:M2013560。
2.一種如權利要求1所述鮑氏不動桿菌在降解二噁烷中的應用。
3.如權利要求2所述鮑氏不動桿菌在降解二噁烷中的應用，其特征在于，將所述鮑氏不動桿菌接種至含有二噁烷的廢水、含有二噁烷的無機鹽培養基或者通入有二噁烷廢氣的無機鹽培養基中培養，降解二噁烷。
4.如權利要求3所述鮑氏不動桿菌在降解二噁烷中的應用，其特征在于，所述培養在pH值為5.0~8.0、溫度為25°C~40°C的范圍內進行。
5.如權利要求3所述鮑氏不動桿菌在降解二噁烷中的應用，其特征在于，所述廢水中二噁烷的初始濃度為100mg/L~500mg/L ;所述含有二噁烷的無機鹽培養基中二噁烷的初始濃度為100mg/L~500mg/L ;所述通入有二噁烷廢氣的無機鹽培養基中二噁烷的初始濃度為 100mg/L ~500mg/L。
6.如權利要求3所述鮑氏不動桿菌在降解二噁烷中的應用，其特征在于，所述無機鹽培養基包含如下物質:3.5g Na2HPO4.2Η20、1.0g ΚΗ2Ρ04、0.5g(NH4)2S04、0.1g MgCl2.6H20、0.05g Ca (NO3)2，溶于1000mL水中，加入Iml微量元素溶液，調節pH至7.0~7.2。
7.如權利要求6所述鮑氏不動桿菌在降解二噁烷中的應用，其特征在于，所述微量元素溶液組成為=FeSO4.7Η201.0g、CuSO4.5Η200.02g、H3BO30.014g、MnSO4.4H200.10g、ZnSO4.7H200.10g、Na2MoO4.2H200.02g、CoCl2.6H200.02g，溶于 1000mL 水中。
8.一種如權利要求1所述鮑氏不動桿菌在降解苯酚、甲苯、正丁醇、正己烷、乙醇、苯、四氫呋喃或者鄰二甲苯中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK103695351SQ201310700768
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】周玉央, 沈東升, 黃煥林, 殷峻, 李娜 申請人:浙江工商大學