一種PGC1-α基因DNA甲基化檢測試劑及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物技術及醫學領域，具體涉及一種PGC1-α基因DNA甲基化檢測試劑及其應用。發明人發現并通過實驗證明，PGC1-α基因中位點(+171)的甲基化是DR代謝記憶的早期診斷標志。本發明在上述研究基礎上，制備了用于檢測PGC1-α基因位點+171甲基化的檢測試劑，并提供了相應的檢測試劑盒。本發明提供的甲基化檢測試劑，可以定性或定量的檢測被測試對象PGC1-α基因位點+171是否發生了甲基化及甲基化程度，從而預測被測試對象是否有DR代謝記憶及患病風險，給臨床實踐以指導作用。
【專利說明】—種PGC1-a基因DNA甲基化檢測試劑及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術及醫學領域，具體涉及一種PGCl-α基因DNA甲基化檢測試劑及其應用。
【背景技術】
[0002]過氧化物酶體增殖物激活受體Y輔助激活因子I a (peroxisomeproliferator-activated receptor y coactivatorl α , PGCl-α ),由 PPARGC1A 基因編碼，是轉錄輔助激活因子PGCl家族中最出名的成員，也是近年來細胞及線粒體代謝研究的熱點之一。PGCl-α —方面能增強線粒體的合成功能；另一方面能夠減少線粒體代謝副產物的堆積，它可通過調控許多ROS清除酶的活性而減少ROS的毒性作用。因而，PGCl- α對整個線粒體代謝發揮了積極的調節作用。不僅如此，PGCl-α還具有能夠促進脂肪代謝、減輕體重，能調控骨骼肌細胞中肌纖維類型的轉換，能促進糖異生等代謝過程的重要作用。正因如此，PGCl-α已成為治療糖尿病(Diabetes mellitus, DM)等代謝疾病的新靶點。研究發現，PGCl-α在DM患者的肌肉中表達是降低的，這可能與DM和胰島素抵抗引起的代謝紊亂有關。胰島中編碼PGCl-α的基因PPARGC1A基因啟動子區甲基化的增加可導致胰島β細胞功能下降引起胰島功能紊亂。但是，目前PGCl-a在糖尿病視網膜病變(Diabeticretinopathy, DR)及其代謝記憶中發揮的作用尚不明確,有待進一步研究。
[0003]DR是糖尿病最常見和最嚴重的眼部并發癥，是工作年齡段人群最主要的致盲原因。目前全球DM患者人數高達3.47億，近30%的DM患者有不同程度的DR，3730萬DR患者的視力受到威脅。控制血糖是治療DM及其并發癥的關鍵。然而多個大型的臨床研究發現，若早期血糖控制不佳，即使后續血糖控制達標，仍較早期血糖控制良好的患者更易發生DR等并發癥，這種現象稱之為“代謝記憶”(Metabolic memory, MM)。
[0004] 隨著后基因組時代的到來，表觀遺傳學(Epigenetics)已成為生命學科的研究前沿。表觀遺傳學是針對遺傳學而言的，是指研究DNA序列不發生改變的可遺傳的基因表達變化的科學，它可以解釋一些經典遺傳學所不能解釋的問題。目前表觀遺傳學研究主要集中DNA甲基化及組蛋白乙酰化上。DNA甲基化修飾是基因組表觀遺傳調控中主要的方式，人類腫瘤的發生、發展與DNA甲基化的異常有關，基因啟動子區CpG島高甲基化可導致抑癌基因表達沉默進而導致腫瘤發生。DNA甲基化是指在甲基化轉移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到CG 二核苷酸胞嘧啶的5號碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化異常是細胞癌變過程中早期、頻發事件，因此特異基因的甲基化可作為癌癥早期診斷的分子標志物、治療靶點和判斷預后手段。
[0005]本發明研究了 PGCl-α及其表觀遺傳修飾在DR代謝記憶中的作用。研究在體外培養的視網膜微血管內皮細胞中PGCl-a和S0D2mRNA及蛋白的表達水平，分析高糖對PGCl-a和S0D2mRNA及蛋白表達的影響以及是否具有代謝記憶現象。同時檢測編碼PGCl- α的PPARGC1A基因啟動子區CpG島的甲基化狀態，找到了一個與代謝記憶效應相關的甲基化位點。進一步的，本發明還根據該甲基化位點設計并合成了其甲基化檢測引物并制備了適用于該甲基化位點的檢測試劑盒，所述試劑盒可用于DR代謝記憶早期診斷，具有很好的臨床應用價值。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于證實PGCl- α基因及其表觀遺傳修飾在DR代謝記憶中的作用。所述的對PGCl- α基因及其表觀遺傳修飾的檢測可用于DR代謝記憶早期診斷。
[0007]本發明的另一個目的在于制備出PGCl-α基因甲基化檢測試劑，所述檢測試劑可用于DR代謝記憶的早期診斷、篩查和患病風險預測。
[0008]發明人發現并通過實驗證明，PGCl-a基因的一個位點(+171位點，具體見序列表中SEQ ID N01，所述+171位點位于SEQ ID NOl第459個堿基處)在高糖引起的糖代謝記憶細胞中高度甲基化，而在正常對照中均處于非甲基化狀態，提示PGCl-a基因中位點(+171)的甲基化是糖尿病代謝記憶的早期診斷標志。
[0009]本發明在上述研究基礎上，提供一種檢測試劑，采用所述的檢測試劑組分中的一種或幾種可以檢測PGCl-a基因位點+171的甲基化程度。
[0010]進一步，所述的檢測試劑包括DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒和PGCl-α基因位點+171甲基化檢測試劑盒。
[0011]所述的PGCl-a基因位點+171甲基化檢測可以是現有甲基化檢測技術中任意一種能檢測PGCl-α基因位點+171是否甲基化的檢測方法。已知現有常用的CpG島甲基化檢測方法有甲基化敏感的限制性內切酶方法、NaHSO3法(Sodium bisulfite法)、芯片技術方法。NaHSO3法包括BSP測序法(BSP sequencing)、聯合NaHSO3限制性分析法(COBRA)、甲基化特異性PCR (Methylat1n Specific PCR，MSP)、熒光定量法(Methylight)。芯片技術方法包括甲基化高密度芯片(CpG Islands microarray)、差異甲基化雜交(DifferentialMethylat1n Hybridizat1n, DMH)、甲基化特異性寡核苷酸芯片(methylat1n specificoligonucleotide microarray, MSO microarray)。
[0012]進一步，所述的PGCl-α基因位點+171甲基化檢測試劑盒采用BSP測序法對PGCl-α基因位點+171甲基化進行檢測。所述的試劑盒包括一對BSP檢測引物。進一步，所述BSP檢測引物采用序列表SEQ ID N02和SEQ ID N03。
[0013]所述BSP測序法基本原理是根據重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶(C)脫氨基轉變成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不變。基因組DNA經亞硫酸鹽處理后，設計BSP引物并擴增目的的片段，此時尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶，最后對PCR物進行測序就可判斷CpG位點是否發生甲基化。
[0014]進一步，所述的PGCl-α基因位點+171甲基化檢測試劑盒采用MSP測序法對PGCl-a基因位點+171甲基化進行檢測。所述的試劑盒包括一對甲基化檢測引物和一對非甲基化檢測引物。進一步，所述甲基化檢測引物采用序列表SEQ ID N04和SEQ ID N05 ;所述的非甲基化檢測引物采用序列表SEQ ID N06和SEQ ID N07。所述的甲基化檢測試劑盒還包括全甲基化基因組DNA陽性對照、非甲基化基因組DNA陰性對照以及PCR擴增體系所需的其他常用試劑，如dNTP、DNA聚合酶、緩沖液等。
[0015]所述甲基化特異PCR基本原理是指亞硫酸氫鹽可以氧化去除基因組DNA中胞嘧啶的氨基，在此反應中除m5C外其余胞嘧啶均可被轉變為尿嘧啶。然后將這些靶序列用特異引物進行擴增，經過擴增的DNA，所有尿嘧啶均轉化為可檢測的胸腺嘧啶，只有m5C以胞嘧啶形式被擴增。這種方法是目前所使用的在給定基因組靶序列中分析m5C最常用的方法。可以檢測到每個CpG位點的甲基化情況。基于此原理，發展出亞硫酸氫鹽去氨基反應后，結合PCR擴增的快速方法來檢測m5C，稱為甲基化特異PCR，MSP)，這種MSP方法運用，特別設計的針對甲基化的和非甲基化序列的引物，從而得到特異擴增的甲基化或非甲基化靶序列。目前已經被廣泛應用到CpG島甲基化檢測。
[0016]本發明的另一個目的在于提供PGCl- α基因位點+171在制備一種DR代謝記憶診斷試劑中的應用。
[0017]進一步，所述的診斷試劑通過檢測PGCl-α基因位點+171是否發生甲基化來確定被檢測對象是否有DR代謝記憶。
[0018]本發明的優點:
[0019]本發明制備的PGCl-a基因位點+171甲基化檢測試劑，可以定性或定量的檢測被測試對象PGCl-α基因位點+171是否發生了甲基化及甲基化程度，從而預測被測試對象是否有DR代謝記憶及患病風險，能夠做出早期、快速的診斷，給臨床實踐以指導作用。利用本發明引物、反應體系及其條件檢測PGCl-a基因DNA甲基化其檢測靈敏度高，可達5% ;操作簡單、穩定性好。本發明為DR記憶代謝的早期診斷及防治提供了有力的技術支持，具有很好的臨床應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1.各組HRMECs細胞活力；
[0021]圖2.高糖對HRMEC中S0D2轉錄水平的影響；
[0022]圖3.高糖對HRMEC中PGCl-a轉錄水平的影響；
[0023]圖4.第I天時各組細胞S0D2和PGCl-a蛋白表達量灰度圖；
[0024]圖5.第7天時各組細胞S0D2和PGCl-a蛋白表達量灰度圖；
[0025]圖6.BSP-PCR產物鑒定圖。
圖7.PPARGC1A基因啟動子區待測CpG位點示意圖及編號
【具體實施方式】
[0026]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。本領域的普通技術人員可以理解:在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由權利要求及其等同物限定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件實施檢測。
[0027]實施例1實驗分組
[0028]實驗材料與試劑:
[0029]正常人視網膜微血管內皮細胞(Humanretinal microvascular endothelialcells, HRMECs, cAP-001OTM)，美國 Ang1-Proteomie 公司；內皮細胞基礎培養基(ENDO-Basal medium), ScienCell ;胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS) ,ScienCell ;內皮細胞生長因子(Endothelial cell growth supplement, ECGS), ScienCell ;青霉素-鏈霉素雙抗(Penicillin-Streptomycin), ScienCell ;牛血衆纖維粘連蛋白(Fibronectin, FN),ScienCell ;0.25%膜蛋白酶(Trypsin),Poputech ;D_ 葡萄糖(D-Glucose), Sigma ;D_ 甘露醇(D-Mannitol), Sigma。
[0030]將HRMECs根據干預處理因素分為5組，具體分組及處理方法見表1。
[0031]表1.實驗分組及處理
[0032]
【權利要求】
1.一種PGCl-α基因DNA甲基化檢測試劑，其特征在于，所述的甲基化檢測試劑是針對PGCl-α基因位點+171的甲基化檢測試劑，所述PGCl-α基因位點+171位于SEQ ID NOl第459個堿基處。
2.根據權利要求1所述的甲基化檢測試劑，其特征在于，所述甲基化檢測試劑包括DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒和PGCl- α基因甲基化檢測試劑盒。
3.根據權利要求1所述的甲基化檢測試劑，其特征在于，所述甲基化檢測試劑包括采用下列方法中任意一種或幾種的組合對PGCl-α基因位點+171的甲基化情況進行檢測所需的試劑:甲基化敏感的限制性內切酶方法、NaHSO3法、芯片技術方法；所述NaHSO3法包括BSP測序法、聯合NaHSO3限制性分析法、甲基化特異性PCR、熒光定量法；所述芯片技術方法包括甲基化高密度芯片、差異甲基化雜交、甲基化特異性寡核苷酸芯片。
4.根據權利要求2所述的甲基化檢測試劑，其特征在于，所述甲基化檢測試劑盒采用BSP測序法對PGCl-α基因位點+171甲基化進行檢測。
5.根據權利要求2或4任意一項所述的甲基化檢測試劑，其特征在于，所述的甲基化檢測試劑盒包括一對BSP檢測引物，所述檢測引物序列為SEQ ID Ν02和SEQ ID Ν03所示。
6.根據權利要求2所述的甲基化檢測試劑，其特征在于，所述甲基化檢測試劑盒采用MSP測序法對PGCl-α基因位點+171甲基化進行檢測。
7.根據權利要求2或6任意一項所述的甲基化檢測試劑，其特征在于，所述的甲基化檢測試劑盒包括一對甲基化檢測引物和一對非甲基化檢測引物，所述甲基化檢測引物序列為SEQ ID Ν04和SEQ ID Ν 05所示，所述非甲基化檢測引物序列為SEQ ID Ν06和SEQ ID Ν07所示。
8.PGCl-α基因位點+171在制備一種診斷試劑中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的診斷試劑通過檢測PGCl-α基因位點+171發生甲基化程度來確定被檢測對象是否有DR代謝記憶。
10.根據權利要求8或9任意一項所述的應用，其特征在于，采用權利要求1-7任意一項所述的檢測試劑檢測PGCl-α基因位點+171甲基化程度。
【文檔編號】C12Q1/68GK104178565SQ201410334876
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】張古沐陽, 陳有信, 馬楠, 田蓉, 張辰茜, 張夢雨 申請人:陳有信